急性腦梗死患者外周血單核細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)特點(diǎn)＊

鄺宗和 陳進(jìn)銘 葉小平 張海江 孫盛同

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院白云分院急診科 (廣東 廣州 518120)

急性腦梗死(acute cerebral infarction，ACI)，又稱缺血性腦卒中，是指由于動(dòng)脈粥樣硬化或血栓形成導(dǎo)致血管狹窄或閉塞從而引起的腦供血突然不足導(dǎo)致腦組織壞死的急性腦血管疾病[1]。急性腦梗死發(fā)病率高，是死亡率最高的疾病，并且常伴有難以治愈的并發(fā)癥所以一直以來(lái)備受關(guān)注。為了更好地治療急性腦梗死，人們一直致力于急性腦梗死發(fā)病機(jī)制的研究，目前認(rèn)為缺血再灌注損傷，鈣離子內(nèi)流，神經(jīng)細(xì)胞凋亡等與梗死部位腦組織不可逆損傷有關(guān)，在眾多機(jī)制中神經(jīng)細(xì)胞凋亡處于較為重要的地位[2]。自噬是細(xì)胞程序性死亡的一種方式，適當(dāng)?shù)淖允煽梢允拐婧松飪?nèi)的物質(zhì)循環(huán)利用，并降解自身代謝廢物及異常的細(xì)胞器等，但是自噬的過(guò)度激活溶酶體會(huì)降解細(xì)胞的正常營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和損傷正常的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，反而會(huì)造成過(guò)量的能量消耗和自身?yè)p傷[3]。對(duì)于心肌細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞等不可再生細(xì)胞而言自噬在維持細(xì)胞的正常生理結(jié)構(gòu)，生命活動(dòng)發(fā)揮著重要的作用。國(guó)內(nèi)外研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在心肌梗死患者的心肌中存在自噬現(xiàn)象，在大鼠等腦梗死動(dòng)物模型種中也發(fā)現(xiàn)自噬現(xiàn)象的存在，但是在人類急性腦梗死種是否存在自噬現(xiàn)象尚未明確[4]。本研究探討急性腦梗死時(shí)的單核細(xì)胞自噬蛋白表達(dá)的特點(diǎn)，以期為臨床治療做出參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象隨機(jī)納入我院2020年1月至2021年5月80例合急性腦梗死患者，患者年齡 49～72歲，平均 63.47±8.35歲，采用4種分組方法即：根據(jù)發(fā)病時(shí)間將急性腦梗死患者分為＜4.5h 組、4.5～6h 組和＞6h 3組；根據(jù)治療情況分為溶栓治療前、治療后2組；根據(jù)NIHSS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分成三組：輕度(NIHSS評(píng)分0～6分)、中度(NIHSS評(píng)分7～15分)、重度(NIHSS評(píng)分＞16分)；使用改良Rankin量表(mRS)評(píng)估預(yù)后，根據(jù)評(píng)分結(jié)果分成2組：預(yù)后不良組(mRS評(píng)分＞2分)，預(yù)后良好組(mRS評(píng)分≤2分)，納入同期40例健康人作為對(duì)照組，患者年齡 51～70歲，平均60.52±7.83歲。

納入標(biāo)準(zhǔn)：首次發(fā)病并且在72 小時(shí)內(nèi)入院；癥狀，體征，影像學(xué)檢查結(jié)果等滿足急性缺血性腦卒中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；NIHSS 評(píng)分為 4-20 分；患者及其家屬簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：腦CT提示存在腦出血；既往有腦梗死病史且遺留神經(jīng)功能缺損者；有嚴(yán)重心功能不全、慢性肝腎疾病者；1個(gè)月內(nèi)存在懷孕、分娩、哺乳等情況者；血小板＜100×109/L 或血小板＞300×109/L和中度以上貧血者；24 小時(shí)內(nèi)接受ACEI治療；年齡＞85 周歲。同期選擇健康對(duì)照組40例。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：研究對(duì)象半年內(nèi)未出現(xiàn)腦缺血性疾病，無(wú)冠心病、高血壓等心血管疾病，無(wú)糖尿病、甲亢等內(nèi)分泌性疾病。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1外周血單核細(xì)胞的分離 入院的第1天、第14天抽取外周靜脈血10mL，使用肝素抗凝，之后立即放置于4℃冰箱降溫保存，從而抑制外周血中單核細(xì)胞的活性。冰箱中保存30min 后，取5mL血液用3 000r/min的速度進(jìn)行離心10min，血清標(biāo)本置與-80℃的冰箱中冷存；密度梯度離心剩余的5mL靜脈血，按照單核細(xì)胞的貼壁特性，分離出單核細(xì)胞。

1.2.2 Western blot 檢測(cè)單核細(xì)胞中的MAP1-LC3、Beclin-1 及Atg5-Atg12含量 將單核細(xì)胞使用 RIPA 裂解液裂解，提取總蛋白，在每個(gè)泳道中加入總蛋白40μg。用BCA 法測(cè)各組蛋白濃度。使用15% SDS-PAGE進(jìn)行90V/120V 恒壓電泳，濕轉(zhuǎn)(200mA，50min) 到 PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封存2h，并且加入MAP1-LC3 兔抗人多克隆抗體、Beclin-1 兔抗人多克隆抗體、Atg5 兔抗人多克隆抗體(1∶1000 稀釋) 和β-actin 鼠抗人單克隆抗體(1∶1000 稀釋) ，加入之后4℃孵育，TBST洗滌，β-actin 加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG(1∶5000 稀釋)，MAP1-LC3 加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶5 000 稀釋)，兩者均于室溫孵育 90min，TBST 洗滌后，ECL 化學(xué)發(fā)光試劑顯影。

1.2.3 線粒體偶聯(lián)因子6(CF6)入院時(shí)及第14天空腹抽取肘靜脈血10mL，置于含促凝劑的采血管中，將采血管在2800轉(zhuǎn)/分鐘，4℃環(huán)境下，離心30分鐘并獲取上層血清，-2℃保存?zhèn)溆?。CF6的濃度使用ELISA方法檢測(cè)。

1.3 觀察指標(biāo)外周血單核細(xì)胞中的 MAP1-LC3、Beclin-1 及Atg5-Atg12 含量，CF6濃度，并將各組患者的自噬相關(guān)蛋白含量與各種臨床參數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析，將自噬相關(guān)蛋白含量與CF6濃度之間進(jìn)行Logistac分析，分析其相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法選擇SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。正態(tài)分布的計(jì)量資料以(±s)表示，比較選擇t檢驗(yàn)；偏態(tài)分布的計(jì)量資料以四分位數(shù)間距M(QR)表示，比較選擇Mann-Whitney U 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，比較運(yùn)用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)分析采用spearman相關(guān)分析。使用受試者工作特征(ROC)曲線評(píng)估急性腦梗死患者外周血單核細(xì)胞自噬水平對(duì)腦梗死患者預(yù)后的預(yù)測(cè)能力。以雙側(cè)P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同時(shí)間MAP1-LC3、Beclin-1及 Atg5-Atg12的含量＜4.5h組、4.5～6h 組和＞6h組均較健康對(duì)照組的MAP1-LC3、Beclin-1 及 Atg5-Atg12的含量高，且＞6h組高于4.5～6h 組高于＜4.5h組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同時(shí)間各組MAP1-LC3、Beclin-1 及 Atg5-Atg12的相對(duì)豐度值

2.2 不同NHISS評(píng)分組MAP1-LC3、Beclin-1及 Atg5-Atg12的含量 輕度，中度，重度三組均較健康對(duì)照組的MAP1-LC3、Beclin-1 及 Atg5-Atg12的含量高，且重度組高于中度組高于輕度組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表2。

表2 不同NHISS評(píng)分各組MAP1-LC3、Beclin-1 及 Atg5-Atg12的相對(duì)豐度值

2.3 治療前后MAP1-LC3、Beclin-1及 Atg5-Atg12的含量 治療前，治療后2組均較健康對(duì)照組的MAP1-LC3、Beclin-1 及Atg5-Atg12的含量高，治療后組低于治療前，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表3。

表3 治療前后各組MAP1-LC3、Beclin-1 及 Atg5-Atg12的相對(duì)豐度值

2.4 不同預(yù)后組MAP1-LC3、Beclin-1及 Atg5-Atg12的含量 預(yù)后不良組，預(yù)后良好2組均較健康對(duì)照組的MAP1-LC3、Beclin-1 及 Atg5-Atg12的含量高，預(yù)后良好組低于預(yù)后不良組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表4。

表4 不同預(yù)后各組MAP1-LC3、Beclin-1 及 Atg5-Atg12的相對(duì)豐度值

2.5 MAP1-LC3、Beclin-1及 Atg5-Atg12的變化與線粒體偶聯(lián)因子6(CF6)變化的相關(guān)性 根據(jù)Logistac分析各個(gè)患者的MAP1-LC3、Beclin-及 Atg5-Atg12的含量變化與線粒體偶聯(lián)因子6(CF6)變化具有相關(guān)性。

3 討 論

除細(xì)胞凋亡之外人們還發(fā)現(xiàn)了第二種細(xì)胞程序性死亡方式—自噬，是細(xì)胞通過(guò)溶酶體的作用降解各種細(xì)胞內(nèi)異常的細(xì)胞器，以及各種代謝廢物的過(guò)程。已有大量研究表明自噬過(guò)程與心肌梗死過(guò)程存在密切聯(lián)系，自噬在腦梗死動(dòng)物模型種的作用也有一定的研究[5-6]。在腦梗死時(shí)由于血液供應(yīng)不足造成大量細(xì)胞因缺血缺氧而出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能異常，此時(shí)自噬過(guò)程就有可能會(huì)啟動(dòng)吞噬各種代謝廢物及功能異常的細(xì)胞器幫助細(xì)胞維持正常功能起到保護(hù)作用[7]，但是在缺血再灌注期又有可能因自噬的過(guò)度激活造成細(xì)胞自噬正常的細(xì)胞結(jié)構(gòu)而造成細(xì)胞損傷[8]。自噬是把雙刃劍，自噬在急性腦梗死種到底起著怎樣的作用，在急性腦梗死的治療種應(yīng)該怎樣處理自噬，自噬的過(guò)度激活的機(jī)制，適當(dāng)?shù)奶幚碜允稍谀X梗死的臨床治療中的意義等等都是目前亟待解決的問(wèn)題[9]。急性腦梗死目前雖然已經(jīng)有明確的治療指南，但是治療效果以及治療后后遺癥的處理任然需要進(jìn)步，自噬或許可以成為一把治療的鑰匙，可以輔助超早期溶栓治療提高療效，減少許多不可逆損傷[10-12]。

本研究的目的是探討不同時(shí)間，不同預(yù)后，不同嚴(yán)重程度的急性腦梗死中外周血單核細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)的變化情況，及其與線粒體功能改變的相關(guān)性，從而了解在急性腦梗死中是否存在自噬過(guò)程，自噬的作用如何，自噬作用發(fā)生的機(jī)制如何是否與線粒體功能有關(guān)。研究結(jié)果表明急性腦梗死的自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平高于健康對(duì)照組，且隨著患病時(shí)間的延長(zhǎng)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)逐漸升高，隨著嚴(yán)重程度的增加即NHISS評(píng)分的升高自噬相關(guān)蛋白表達(dá)逐漸升高，治療后自噬相關(guān)蛋白含量明顯低于治療前，并且預(yù)后不良的患者的自噬相關(guān)蛋白含量明顯高于預(yù)后良好的患者，并且自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的變化與線粒體功能變化指標(biāo)CF6的改變具有良好的相關(guān)性。

綜上所述，急性腦梗死過(guò)程中確實(shí)存在著自噬過(guò)程，并且自噬過(guò)程的強(qiáng)弱與急性腦梗死的時(shí)間和嚴(yán)重程度相關(guān)，自噬過(guò)程與急性腦梗死的不良預(yù)后有相關(guān)性，自噬過(guò)程在急性腦梗死的治療即療效評(píng)估中具有一定的臨床意義，并且自噬過(guò)程的過(guò)度激活可能與線粒體的損傷有關(guān)。