經(jīng)典血清分型法與分子分型法對(duì)肺炎鏈球菌血清分型的檢測(cè)結(jié)果比較

柳青 李云慧

肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae,SP)是一種常見(jiàn)致病菌,屬于革蘭陽(yáng)性雙球菌,對(duì)兒童和老年人的損傷最大,可導(dǎo)致兒童和成人發(fā)生社區(qū)獲得性肺炎。我國(guó)發(fā)病率約是全世界的15%左右,而且6 歲以下兒童因?yàn)楦腥痉窝祖溓蚓笏劳龅娜藬?shù)也是最多的［1］。肺炎鏈球菌已成為重要的全球公共衛(wèi)生問(wèn)題,除疫苗外,目前沒(méi)有公共衛(wèi)生策略可減少其發(fā)病率［2］。肺炎鏈球菌的外囊多糖可以使體內(nèi)產(chǎn)生保護(hù)性抗體,并用于制備疫苗。對(duì)肺炎細(xì)菌的血液進(jìn)行監(jiān)測(cè),為肺炎細(xì)菌疫苗的制備和疾病預(yù)防提供重要的科學(xué)依據(jù)。經(jīng)典莢膜腫脹法是肺炎鏈球菌的血清分型方法,雖然其發(fā)揮著重要作用,但也有一些局限性,例如低分辨率、復(fù)雜的操作步驟和主觀判斷結(jié)果。隨著莢膜多糖基因序列(CPS)的出現(xiàn),分子分類技術(shù)以其靈敏度高、快速、準(zhǔn)確、分辨率高、質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn)逐漸得到廣泛應(yīng)用。本文使用經(jīng)典的莢膜腫脹方法和多重PCR 方法用于相同標(biāo)本的血清分型,為建立快速準(zhǔn)確的血清分型方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2019 年1 月～2020 年12 月在北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院住院患者中分離的50 株肺炎鏈球菌作為研究對(duì)象,排除相同患者同一部位重復(fù)分離菌株。

1.2 方法 分別采用經(jīng)典莢膜腫脹法與多重PCR 法進(jìn)行血清分型檢測(cè)。

1.2.1 試劑與儀器 哥倫比亞血平板,VITEK compack 型全自動(dòng)分析系統(tǒng),棋盤式分型系統(tǒng)(pneumotest kit)試劑盒(丹麥國(guó)家血清研究所)0.1 g/dl的亞甲藍(lán)溶液,Leica DM2000 顯微鏡,QIAamp⑧DNA Mini Kit 核酸提取試劑盒,肺炎鏈球菌血清型分型引物,Taq DNA 聚合酶,PCR 擴(kuò)增儀等。

1.2.2 試驗(yàn)操作過(guò)程 細(xì)菌分離培養(yǎng)按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行,挑取待測(cè)菌落在血平板上作奧普托欣(Optochin)試驗(yàn)。經(jīng)35℃10 ml/dl CO2過(guò)夜孵育,若Optochin 紙片周圍抑菌環(huán)直徑＞14 mm 判為Optochin試驗(yàn)敏感,可以確定該檢測(cè)菌株為肺炎鏈球菌。若抑菌環(huán)直徑為9～13 mm 時(shí)應(yīng)參照膽汁溶菌試驗(yàn),其他草綠色鏈球菌的抑菌圈直徑為＜8 mm。不敏感的就可以確診為非肺炎鏈球菌。所有菌株經(jīng)VITEK2 compack 型全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)加以鑒定。選取標(biāo)準(zhǔn)菌株美國(guó)模式菌種收集中心(ATCC) 49619(已知血清型為19F)作為質(zhì)控菌株。50 株肺炎鏈球菌菌株均以濕牛奶冷凍法置于-76℃冰箱保存。試驗(yàn)時(shí)將肺炎鏈球菌凍存管從-76℃冰箱取出至室溫,挑取3～5 μl 菌液接種于哥倫比亞血平板上,35℃,5 ml/dl CO2培養(yǎng)18～24 h。

經(jīng)典莢膜腫脹法：①原理利用：棋盤式分型系統(tǒng)(pneumotest kit)分型［3］的經(jīng)典莢膜腫脹方法。實(shí)驗(yàn)原理是肺炎鏈球菌特異性抗血清與莢膜抗原結(jié)合形成復(fù)合物,經(jīng)染色后鏡下可見(jiàn)細(xì)菌莢膜顯著增大或出現(xiàn)凝集；②操作步驟：挑取肺炎鏈球菌菌落放入小試管中,制成菌懸液約0.5 麥?zhǔn)蠁挝蝗芤?；挑取約3 μl 菌懸液放入載玻片上,分別加入3 μl 縱列和橫行分型血清池,與菌懸液充分混勻。加入血清池的具體操作順序從上到下、從左到右(嚴(yán)格按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作)；在上述混懸液中加入一接種環(huán)0.1 g/dl 的亞甲藍(lán)溶液,放入載玻片上與抗血清混勻1 min,蓋上蓋玻片,在顯微鏡下觀察是否有莢膜或凝集出現(xiàn)。

多重PCR 法：①DNA 提?。河肣IAamp⑧DNA Mini Kit 核酸提取試劑盒提取細(xì)菌DNA,一切操作按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；②引物合成：肺炎鏈球菌血清型分型引物(http://www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/pcr.htm)上提供的,由上海生工生物工程有限公司合成；③PCR血清分型方案：基于美國(guó)目前主要流行血清型的肺炎鏈球菌PCR 血清分型方案；④PCR 擴(kuò)增：PCR 反應(yīng)體系為25 μl：Premix Taq(日本Takara 公司)12.5 μl,引物10 μl,dd H2O 1 μl、DNA 模 板1.5 μl。PCR 擴(kuò)增條件：94℃ 4 min 預(yù)變性,94℃45 s 變性,54℃45 s 退火,72℃ 2 min延伸30個(gè)循環(huán),最后72℃2 min作末端延伸。PCR 產(chǎn)物電泳后觀察結(jié)果。

1.3 觀察指標(biāo) 比較兩種方法的血清分型率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

多重PCR 法血清分型率76.0%高于經(jīng)典莢膜腫脹法的44.0%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩種方法對(duì)50 株肺炎鏈球菌的血清分型率比較［株(%)］

3 討論

莢膜腫脹試驗(yàn)(quellung 反應(yīng)) 是由Neufeld 于1902 年命名的,發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌抗血清可以和同型菌莢膜產(chǎn)生一種腫脹特征。棋盤式分型系統(tǒng)是傳統(tǒng)微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行肺炎鏈球菌血清分型的理想方法,但其操作步驟復(fù)雜,血清成本昂貴,而且通常取決于操作員的主觀性解釋結(jié)果,需要高專業(yè)技能,只能分為群體,細(xì)分類型需要單因素抗血清［4］。本研究表明,經(jīng)典的血清分型方法對(duì)類群分類更具意義,但具體結(jié)果不明顯。這些因素不僅給血清分型技術(shù)的研究帶來(lái)困難,而且限制了血清分型技術(shù)的推廣。隨著PCR 法的不斷發(fā)展,為了成功克服傳統(tǒng)血清分型技術(shù)的不足,基于PCR 法的分子分類方法顯得特別重要。2011 年,瑞士學(xué)者Gervaix 等［5］在第一屆感染預(yù)防和控制國(guó)際會(huì)議上,報(bào)道了以多重PCR 和微陣技術(shù)相結(jié)合的新方法來(lái)自動(dòng)檢測(cè)肺炎鏈球菌的血清分型。這種方法首次利用多重PCR 對(duì)肺炎鏈球菌溶血素、自溶素以及其他8 個(gè)莢膜操縱子基因進(jìn)行擴(kuò)增,相應(yīng)引物被標(biāo)記和點(diǎn)到微陣列芯片上,在自動(dòng)分子診斷系統(tǒng)中使用聚焦激光顯微鏡進(jìn)行掃描結(jié)果并分析,結(jié)果顯示這種新技術(shù)可準(zhǔn)確識(shí)別出其中包括結(jié)合疫苗中出現(xiàn)的13 個(gè)血清型等51 個(gè)肺炎鏈球菌血清型。此外,基于PCR 法的分子分類方法可以用于某些直接被血清識(shí)別的樣本類型,也可以用于對(duì)某些傳統(tǒng)的血清學(xué)布局方法不敏感的樣本的檢測(cè)。本次研究證實(shí),多重PCR 法比經(jīng)典夾膜腫脹法分型率高,和李建平等［6］研究的結(jié)果相同。原因是莢膜腫脹法主要根據(jù)不同的多糖莢膜抗原和特異性血清抗原及特異性血清在肺炎的外層而產(chǎn)生較大的影響。肺炎桿菌株經(jīng)過(guò)反復(fù)傳代,由于自身的溶解酶作用,細(xì)菌逐漸溶解,有報(bào)道稱,普通人工培養(yǎng)基上的莢膜容易丟失,多重PCR 法是由一個(gè)典型的引物合成基因簇(CPS)組合提取的DNA 相關(guān)莢膜,不受莢膜影響。由于區(qū)域、年齡和人口等不同因素的影響,可引起疾病的肺炎鏈球菌的血清型也不同。根據(jù)徐飛等［7］研究結(jié)果證實(shí),肺炎鏈球菌血清型以19F、23F、6B、4、15B 為主。李馬超等［8］研究了杭州地區(qū)肺炎鏈球菌最常見(jiàn)的血清型為19F,其次為19A、6A、23F 和15B。潘芬等［9］分析了的48 株肺炎鏈球菌,以19F、19A、9V、6B、23F 為主。而本次研究發(fā)現(xiàn)19F 的比例較高,與劉又寧等［10］的研究結(jié)果相似。血清型替代削弱了接種七價(jià)肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗(PCV7)的益處,并對(duì)生存率有選擇性壓力。隨著PCV13 增加19A,其為肺炎鏈球菌帶來(lái)了更大的預(yù)防益處。然而,PCV 由于其莢膜血清型的改變和昂貴的成本,在許多發(fā)展中國(guó)家并沒(méi)有得到廣泛的應(yīng)用。肺炎鏈球菌的分子分型也存在一些不足,雖然人復(fù)合前列腺特異性抗原(CPSA)引物擴(kuò)增的基因序列高度保守,但由于CPSA 基因的缺失或突變可能導(dǎo)致極少數(shù)菌株不能從陽(yáng)性產(chǎn)物中擴(kuò)增出來(lái)［11］。引物的設(shè)計(jì)存在一些缺點(diǎn),首先,以PCR 為基礎(chǔ)的分子分型方法鑒定的肺炎鏈球菌血清型/群有限。肺炎鏈球菌有90 多種血清型,目前僅發(fā)表了40 多種血清型序列,但仍有50 多種血清型。部分引物具有血清型特異性而非血清型特異性,6A、6B、6C、6D 引物陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果只能細(xì)分到6C、6D,其結(jié)果可能是血清型6C、6D；15B、15C 引物陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果有可能是15B 或15C；不能細(xì)分型的還 有15A、15F、35A、35C、42、7C、7B、40、10F、10C、33C、9V、9A、33F、33A、37。另外,多重PCR法鑒定的結(jié)果之間存在交叉反應(yīng)［12］,如7A 與7F、6A與6B 之間存在相似性。

綜上所述,多重PCR 法分子分型技術(shù)雖然有一定的局限性,但與經(jīng)典莢膜腫脹法相比,其具有簡(jiǎn)單、分辨率高、靈敏度強(qiáng)、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn),可廣泛應(yīng)用于肺炎鏈球菌的常規(guī)檢測(cè),成為一種可靠的分型方法。