丙泊酚對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的HT22 細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

李婕 王小波 李春梅

當(dāng)前人口老齡化問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重,與之相關(guān)的疾病負(fù)擔(dān)正日益受到社會(huì)的關(guān)注,其中年發(fā)生率顯示不斷提升的病癥成為備受關(guān)注的重點(diǎn)疾病,其中就包括神經(jīng)退行性疾病。全球疾病負(fù)擔(dān)研究顯示,目前約有超過(guò)10 億人受到神經(jīng)退行性疾病的影響,每年約有近700 萬(wàn)人死于該類疾病。同時(shí),在世界衛(wèi)生組織的相關(guān)預(yù)測(cè)中得知,預(yù)計(jì)到2040 年,該疾病的致死率將超過(guò)癌癥［1］。雖然神經(jīng)退行性疾病尤其是阿爾茲海默癥(AD)和帕金森氏病(PD)等是不同性質(zhì)的疾病,其明確的發(fā)病機(jī)制目前也尚不清楚,但研究表明,氧化應(yīng)激(Oxidative Stress)被認(rèn)為是AD 和PD 等神經(jīng)退行性疾病發(fā)病的重要原因［2］。超氧陰離子、羥自由基及H2O2等ROS 積累和氧化損傷與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病進(jìn)程密切相關(guān)［2］。

沉默信息調(diào)節(jié)因子2 相關(guān)酶1(silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT1) 屬于一種基于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸而形成的組蛋白脫乙?；?可使P53、Ku70、FoxOs、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ 輔激活因子(PGC-1α)和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)等多種蛋白脫乙酰化,在氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí)有一定的作用呈現(xiàn)。在氧化應(yīng)激過(guò)程中,將導(dǎo)致細(xì)胞中P300/CBP 對(duì)FoxO 家族的乙酰化修飾作用提升,乙?；腇oxO 家族可促進(jìn)下游靶分子P53、P16 及P21 的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和衰老。而SIRT1 可使FoxO 家族去乙?；?促進(jìn)DNA 損傷修復(fù)和抑制細(xì)胞衰老和凋亡等多種生物過(guò)程,預(yù)防各種疾病的發(fā)生［3,4］。

丙泊酚作為臨床麻醉中常用的鎮(zhèn)靜藥物,因具有起效迅速、短效、復(fù)蘇迅速、可控性好、副作用少、首相迅速分布及消除等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于外科麻醉［5,6］。本研究采用H2O2對(duì)HT22 細(xì)胞實(shí)施處理,以完成體外神經(jīng)細(xì)胞損傷模型的創(chuàng)建,期間通過(guò)丙泊酚執(zhí)行干預(yù)操作,最終觀察丙泊酚是否可抑制H2O2損傷的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,以及是否通過(guò)SIRT1-FoxO1 信號(hào)通路起到保護(hù)作用,為臨床治療、臨床用藥及改善患者預(yù)后提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑 丙泊酚(北京費(fèi)森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司)；海馬神經(jīng)元HT22 細(xì)胞株(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究所)；胎牛血清、1640 培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；NAD/NADH 檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；SIRT1 抗體、Cleaved-Caspase3、Bax、Bcl-2、Cyt C、β-actin 抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology 公司。

1.2 儀器 電泳儀(BioRad)、垂直電泳槽(BioRad)、濕式轉(zhuǎn)膜儀(BioRad)、化學(xué)發(fā)光成像儀(Tanon)、制冰機(jī)(三洋)、4 度離心機(jī)(Thermo)、超潔凈工作臺(tái)(江蘇通凈)、水平脫色搖床(其林貝爾)、Infinite M200 Pro 型酶標(biāo)儀(瑞士Tecan 公司)。

1.3 方法

1.3.1 HT22 細(xì)胞的培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)HT22,置于溫度37 ℃,且含有5%CO2的專用箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)80%～90%進(jìn)行0.25%胰蛋白酶消化HT22 傳代培養(yǎng),以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.3.2 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞存活率和篩選H2O2合適作用濃度 取培養(yǎng)對(duì)數(shù)期HT22 細(xì)胞,0.25%胰蛋白酶消化后調(diào)整密度至 6×104/ml,取96 孔板按每孔 100 μl的體積進(jìn)行鋪板。分別設(shè)對(duì)照組、H2O2組及丙泊酚組,對(duì)照組加入含1%FBS 的培養(yǎng)基,H2O2組加入含100 μM H2O2的1%FBS 的培養(yǎng)基,丙泊酚組在100 μM H2O2干預(yù)后,加入含50 μM 丙泊酚的1%FBS 培養(yǎng)基,培養(yǎng)6 h后,棄上清,加入含10%CCK-8的1640培養(yǎng)基,37℃孵育2 h,酶標(biāo)儀450 nm 處測(cè)吸光度。

1.3.3 DCFH-DA 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平 選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HT22 細(xì)胞,消化收集后用二十四孔板鋪板,24 h 細(xì)胞貼壁后,根據(jù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行相應(yīng)處理因素添加。干預(yù)結(jié)束后,棄掉培養(yǎng)基,4℃預(yù)冷PBS 洗HT22 1 次,棄PBS。加入終濃度為5 μM 的熒光探針工作液,避光孵育20～30 min。PBS 洗HT22 1 次,檢測(cè)各孔熒光強(qiáng)度。

1.3.4 NAD/NADH 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)NAD 選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HT22 細(xì)胞,消化收集后用六孔板以每孔4×105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行鋪板,24 h 細(xì)胞貼壁后,根據(jù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行相應(yīng)處理因素添加。棄培養(yǎng)基,加入200 μl 的NAD/NADH 提取液,輕吹裂解細(xì)胞；按照NAD/NADH 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明檢測(cè)NAD 水平。

1.3.5 Westernblot 檢測(cè)HT22 細(xì)胞內(nèi)SIRT1、FoxO1及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-Caspase3、Bax、Bcl-2、Cyt C 的表達(dá)水平 選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HT22 細(xì)胞,消化收集后用六孔板以每孔 4×105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行鋪板,24 h細(xì)胞貼壁后,根據(jù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行相應(yīng)處理因素添加。干預(yù)結(jié)束后,需要將上清液等剔除,并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行收集。然后,向其中加入適量的裂解緩沖液,以此在冰上勻漿裂解,溫度為4℃,時(shí)間為0.5 h,12000×g 離心,最終取上清液,實(shí)施蛋白定量操作。此后,獲取適量的蛋白上樣,并進(jìn)行電泳分離,所用為十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),電轉(zhuǎn)到固相支持體聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,10%脫脂奶粉封閉PVDF 膜45～60 min,含一抗的抗體稀釋液與PVDF 膜共孵育4℃過(guò)夜,TBST 搖床洗膜3 次,5～10 min/次,含二抗的抗體稀釋液與PVDF 水平搖床室溫共孵育45～60 min,TBST 搖床洗膜3 次,5～10 min/次,配制適量發(fā)光液,Tanon 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)。Image J 分析凈光密度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,兩獨(dú)立樣本比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組分析采用方差分析；組間比較采用SNK 或LSD 法。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H2O2對(duì)HT22 細(xì)胞存活率的影響 用50、100、200、300、400、500 μM 不同濃 度H2O2處 理HT22細(xì)胞24 h 后,與對(duì)照組相比,隨著H2O2濃度的增加,HT22 細(xì)胞存活率逐漸下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖1。H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的IC50 為234.13 μM。與對(duì)照組比較,100 μM H2O2處理HT22 細(xì)胞24 h 后,HT22 細(xì)胞存活率為75.62%。100 μM H2O2組細(xì)胞存活率明顯低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖2。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索和調(diào)整結(jié)合參考文獻(xiàn)最終確定100 μM 作為本次實(shí)驗(yàn)的處理濃度。

圖1 H2O2 對(duì)HT22 細(xì)胞存活率的影響注：與對(duì)照組比較,aP＜0.05

圖2 H2O2 對(duì)HT22 細(xì)胞活力的濃度抑制曲線

2.2 丙泊酚對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HT22 細(xì)胞存活率的影響H2O2組細(xì)胞存活率顯著低于對(duì)照組,丙泊酚組高于對(duì)照組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；H2O2和丙泊酚聯(lián)合處理組細(xì)胞存活率高于H2O2組,低于丙泊酚組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 丙泊酚對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的HT22 細(xì)胞存活率的影響

2.3 丙泊酚對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HT22 細(xì)胞內(nèi)ROS 的影響H2O2組細(xì)胞內(nèi)ROS 顯著高于對(duì)照組,丙泊酚組低于對(duì)照組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。H2O2和丙泊酚聯(lián)合處理組細(xì)胞內(nèi)ROS 低于H2O2組,高于丙泊酚組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 丙泊酚對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的HT22 細(xì)胞內(nèi)ROS 含量的影響

2.4 丙泊酚對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HT22 細(xì)胞凋亡的影響H2O2組細(xì)胞內(nèi)Cleaved-Caspase3、Bax、Cyt C 蛋白的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組,丙泊酚組顯著低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。H2O2和丙泊酚聯(lián)合處理組細(xì)胞內(nèi)Cleaved-Caspase3、Bax、Cyt C 的表達(dá)水平低于H2O2組,高于丙泊酚組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖5,圖6,圖7,圖8。

圖5 Westernblot 檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

圖6 四組凋亡相關(guān)蛋白Bax 的表達(dá)

圖7 四組凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-Caspase3 的表達(dá)

圖8 四組凋亡相關(guān)蛋白Cyt C 的表達(dá)

2.5 丙泊酚對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HT22 細(xì)胞內(nèi)SIRT1-FoxO1 信號(hào)通 路的影 響 H2O2組細(xì)胞 內(nèi)SIRT1 和FoxO1 蛋白的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組,丙泊酚組明顯高于對(duì)照組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。H2O2和丙泊酚聯(lián)合處理組細(xì)胞內(nèi)SIRT1 和FoxO1 的表達(dá)水平高于H2O2組,低于丙泊酚組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖9,圖10,圖11。

圖9 Westernblot 檢測(cè)SIRT1 和FoxO1 的表達(dá)

圖10 四組SIRT1 蛋白的表達(dá)

圖11 四組FoxO1 蛋白的表達(dá)

2.6 丙泊酚對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HT22 細(xì)胞內(nèi)NAD 含量的影響 H2O2組細(xì)胞內(nèi)NAD 水平明顯低于對(duì)照組,丙泊酚組明顯高于對(duì)照組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。H2O2和丙泊酚聯(lián)合處理組細(xì)胞內(nèi)NAD 水平高于H2O2組,低于丙泊酚組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖12。

圖12 丙泊酚對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的HT22 細(xì)胞內(nèi)NAD 含量的影響

3 討論

大量文獻(xiàn)查閱后發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生有不可分割的聯(lián)系,表現(xiàn)在神經(jīng)細(xì)胞中的某些物質(zhì)水平增加,比如ROS［7］。在大腦運(yùn)行期間,相關(guān)組織對(duì)氧氣的消耗量較大,加之脂質(zhì)含量相對(duì)較高,所以會(huì)使得相應(yīng)細(xì)胞中的上述物質(zhì)大量形成并堆積,因此大腦組織易受氧化應(yīng)激的影響。同時(shí)因神經(jīng)元質(zhì)膜中不飽和脂肪酸比較多,所以神經(jīng)元對(duì)ROS 高度敏感。氧化應(yīng)激是PD 和AD 等神經(jīng)退行性疾病出現(xiàn)的關(guān)鍵原因［2］。研究表明海馬神經(jīng)元為AD 患者大腦組織中最先作出反應(yīng)的神經(jīng)元細(xì)胞,而且其中還有大量的內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素受體,導(dǎo)致其更容易被氧化應(yīng)激所“控制”,也就使得氧化應(yīng)激與AD 的發(fā)生、發(fā)展都有著密切關(guān)聯(lián)［7］,可見(jiàn)氧化應(yīng)激是導(dǎo)致該類疾病發(fā)生以及加重的重要因素之一；同時(shí)神經(jīng)元對(duì)于氧化應(yīng)激高度易感,本研究采用H2O2對(duì)HT22 細(xì)胞實(shí)施處理以完成體外神經(jīng)細(xì)胞損傷模型的創(chuàng)建。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,H2O2可降低 HT22 細(xì)胞存活率,且具有濃度依賴性。

研究人員總結(jié)臨床病例時(shí)發(fā)現(xiàn),丙泊酚可通過(guò)減少術(shù)中血流量,縮短腦損傷患者的康復(fù)時(shí)間而滿足腦外科手術(shù)的基本鎮(zhèn)靜需求［8］。實(shí)驗(yàn)研究表明丙泊酚可通過(guò)PI3K/Akt 信號(hào)通路,提高顱內(nèi)血腫SD 大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分,減輕SD 大鼠的神經(jīng)水腫和炎癥［9］。丙泊酚可通過(guò)降低腦局部血流量、降低神經(jīng)系統(tǒng)高量代謝、減輕水腫及減少出血周邊壞死等作用減少腦組織損傷,從而起到保護(hù)作用［6］。研究表明腦出血患者行血腫摘除術(shù)時(shí)應(yīng)用丙泊酚鎮(zhèn)靜可明顯降低其死亡率,改善術(shù)后認(rèn)知功能,但其具體作用機(jī)制不清［6］。因此本研究采用H2O2對(duì)HT22 細(xì)胞實(shí)施處理以完成體外神經(jīng)細(xì)胞損傷模型的創(chuàng)建,并應(yīng)用丙泊酚進(jìn)行干預(yù),在細(xì)胞水平上觀察到丙泊酚對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞起到了一定的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明丙泊酚可提高H2O2損傷后的HT22 細(xì)胞存活率,減少細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)觀察到,丙泊酚可降低H2O2損傷后的HT22 細(xì)胞內(nèi)ROS 含量,這一結(jié)果表明丙泊酚可降低HT22 細(xì)胞的氧化損傷,從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用。本研究在體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了丙泊酚在腦外科臨床應(yīng)用中可能的重要保護(hù)作用,為臨床治療、臨床用藥及改善患者預(yù)后提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

研究表明SIRT1-FoxO1 信號(hào)通路會(huì)對(duì)氧化應(yīng)激等反應(yīng)進(jìn)行一系列調(diào)節(jié),以參與到細(xì)胞從生長(zhǎng)到凋亡的全過(guò)程［10］。氧化應(yīng)激可降低細(xì)胞內(nèi)SIRT1 酶的活性,而SIRT1 則是在FoxO 途徑下實(shí)現(xiàn)對(duì)抗氧化物表達(dá)的強(qiáng)化,同時(shí)抑制SIRT1 活性可上調(diào)NF-κB 信號(hào)通路,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)［10］。研究表明人成神經(jīng)細(xì)胞瘤SHSY5Y 細(xì)胞經(jīng)β-拉帕醌誘導(dǎo)后,細(xì)胞內(nèi)SIRT1 活性會(huì)出現(xiàn)一定的提升,同時(shí)FoxO1 核轉(zhuǎn)位也提升,自噬水平增加,細(xì)胞毒性降低。同時(shí)提高細(xì)胞內(nèi)SIRT1 的活性,可減少PolyQ 蛋白聚合物并降低細(xì)胞毒性,同時(shí)伴有FoxO1表達(dá)上調(diào)［11］。同時(shí)另有研究表明。過(guò)表達(dá)SIRT1,會(huì)使得PolyQ 毒性擴(kuò)散的影響降低,新桿狀線蟲(chóng)神經(jīng)元損傷程度也會(huì)減小,不過(guò)這個(gè)過(guò)程中應(yīng)有FoxO 及其伴侶 β-連環(huán)蛋白參與。因此SIRT1-FoxO 還有一定的保護(hù)神經(jīng)元的能力［12,13］。本研究發(fā)現(xiàn)H2O2可降低SIRT1 和 FoxO1 的表達(dá),表明氧化應(yīng)激具有降低細(xì)胞內(nèi)SIRT1 酶的活性和降低細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的能力。在氧化應(yīng)激過(guò)程中,將導(dǎo)致細(xì)胞中P300/CBP 對(duì)FoxO 家族的乙?；揎椬饔锰嵘?乙?；腇oxO 家族可促使下游靶分子P53、P16 及P21 的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和衰老。而SIRT1 可使FoxO 家族去乙酰化,促進(jìn)DNA 損傷修復(fù)和抑制細(xì)胞衰老和凋亡［3,4］。為了進(jìn)一步探討丙泊酚干預(yù)后減輕細(xì)胞損傷可能的分子機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在H2O2誘導(dǎo)的損傷模型中,丙泊酚處理后,SIRT1 和 FoxO1 表達(dá)增加。這一結(jié)果提示丙泊酚能夠激活SIRT1-FoxO1 信號(hào)通路減輕細(xì)胞內(nèi)ROS 水平和降低細(xì)胞凋亡。

綜上所述,丙泊酚對(duì)H2O2誘導(dǎo)HT22 細(xì)胞損傷具有的保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能與激活SIRT1-FoxO1信號(hào)通路來(lái)減輕氧化應(yīng)激水平,降低細(xì)胞凋亡有關(guān)。