基于正交設(shè)計結(jié)合G1-熵權(quán)法優(yōu)選溫經(jīng)膏的制備工藝研究

陶葉琴，牛江進，謝宗明，袁 淼，熊 丹，蔣翠平

（瀏陽市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 瀏陽 410300）

溫經(jīng)湯出自張仲景《金匱要略·婦人雜病脈證并治第二十二》，臨床上多采用其加減方治療原發(fā)性痛經(jīng)[1-3]。溫經(jīng)湯是婦科調(diào)經(jīng)之要方，臨床應(yīng)用廣泛，具有很好的開發(fā)價值?！皽亟?jīng)膏”處方是以溫經(jīng)湯為基礎(chǔ)方加減而來，由當(dāng)歸、川芎、牡丹皮、吳茱萸、阿膠等藥材組成，具有溫經(jīng)散寒、養(yǎng)血祛瘀、補益天癸、調(diào)暢氣血的攻效，用于女性沖任虛寒兼有瘀滯者。該品種已在我院廣泛使用多年。為了能更好地服務(wù)臨床，此次開發(fā)煎膏劑，并采用單劑量包裝，這樣不僅保留了原方的特點和優(yōu)勢，而且方便了患者的用藥以及確保服用劑量的準(zhǔn)確、可控。合理的工藝設(shè)計是保障中藥質(zhì)量的關(guān)鍵。如何最大限度地提取和保留溫經(jīng)膏臨床起效物質(zhì)是本試驗提取工藝的關(guān)鍵因素。

溫經(jīng)湯藥味較多，成分復(fù)雜多樣，為確保制劑工藝的精制有效，選取多個指標(biāo)成分同時優(yōu)化工藝參數(shù)，而多指標(biāo)的權(quán)重賦予是綜合評分科學(xué)合理的直接體現(xiàn)，是優(yōu)選提取工藝和保證中藥質(zhì)量和療效的關(guān)鍵。G1-熵權(quán)法是一種主觀賦權(quán)法和客觀賦權(quán)法相結(jié)合的方法，既可避免人為賦權(quán)過于主觀，又可避免試驗數(shù)據(jù)出現(xiàn)誤差后所導(dǎo)致綜合評價結(jié)果出現(xiàn)的較大偏差[4-7]。正交設(shè)計與G1-熵權(quán)組合賦權(quán)法相結(jié)合，能提高所得試驗結(jié)果的科學(xué)性與嚴(yán)謹性，使優(yōu)選出的工藝更具合理性及可行性[8]。因此，本試驗將正交設(shè)計與G1-熵權(quán)組合賦權(quán)法相結(jié)合對溫經(jīng)膏的提取工藝進行優(yōu)化，并對其濃縮工藝和成型工藝進行研究，為該制劑的工業(yè)化生產(chǎn)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 儀器LC-10AT型高效液相色譜儀（日本島津儀器有限公司）；L5S型紫外可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；BS224S-CW型電子天平（德國賽多利斯）；CH-0.1AM型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；GENIUS4K型低速離心機（長沙鑫奧儀器儀表有限公司）；DHG-9240A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥當(dāng)歸、川芎、牡丹皮、吳茱萸、阿膠等19味藥材，其中阿膠來源于湖南東健藥業(yè)有限公司，其他18味藥材均購自湖南省金實堂中藥飲片有限公司，經(jīng)瀏陽市中醫(yī)醫(yī)院謝宗明主任中藥師鑒定為正品，符合2020年版《中華人民共和國藥典》一部有關(guān)規(guī)定。丹皮酚（批號：110796-201136，純度：99.8%）、阿魏酸（批號：110773-201915，純度：99.7%）、蔗糖均購自湖南九典宏陽制藥有限公司；乙腈、甲醇為色譜純，購自德國默克股份有限公司；其他試劑為分析純；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 阿魏酸、丹皮酚含量測定

2.1.1 色譜條件[9-12]采用InertsilODS-3C柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相（阿魏酸含量測定）：0.05%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min，88%A→85%A，10～20 min，85%A→84%A，20～60 min，84%A→35%A，60～65 min，35%A→88%A，65～70 min，88%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：320 nm；柱溫：30℃；進樣量：20 μL。流動相（丹皮酚含量測定）：0.05%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～25 min，95%A→78%A，25～35 min，78%A→70%A，35～45 min，70%A→40%A，45～60 min，40%A→20%A，60～66 min，20%A→95%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：274 nm；柱溫：30℃；進樣量：20 μL；分離度＞1.5。色譜圖見圖1～2。

圖1 阿魏酸對照品（A）、供試品（B）、缺當(dāng)歸、川芎的陰性對照（C）HPLC圖

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸10.20 mg，置25 mL棕色容量瓶中，用70%色譜甲醇溶解定容至25 mL，即得阿魏酸對照品溶液；精密稱取經(jīng)P2O5干燥器干燥24 h的丹皮酚對照品10.14mg置于25mL容量瓶中，用50%色譜甲醇定容至25mL，即得丹皮酚對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 分別吸取正交試驗項目下9組供試樣品各5 mL，置于10 mL離心管中，4 000 r/min離心10 min，吸取上層清液過0.22 μm的微孔濾膜，得供試品溶液。取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 陰性對照溶液的制備 分別按溫經(jīng)膏處方的配比精密稱定除當(dāng)歸和川芎、牡丹皮的處方，按溫經(jīng)膏的提取方法和“2.1.3”項下供試品溶液的處理方法，分別制得缺當(dāng)歸和缺川芎的陰性對照溶液、缺牡丹皮的陰性對照溶液。

圖2 丹皮酚對照品（A）、供試品（B）、缺牡丹皮的陰性對照（C）HPLC圖

2.1.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述對照品溶液0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL置于10 mL容量瓶中，丹皮酚對照品溶液用50%甲醇稀釋至相應(yīng)濃度；阿魏酸對照品溶液用70%甲醇稀釋至相應(yīng)濃度，搖勻，按“2.1.1”項下條件進樣測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），計算回歸方程為：阿魏酸Y=126 633X+48 302，r=0.999 8；丹皮酚Y=10639X+6 785.7，r=0.999 9，結(jié)果表明阿魏酸、丹皮酚分別在10.68～213.6、10.14～243.36 μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.6 精密度試驗 分別取阿魏酸、丹皮酚對照品溶液按“2.1.1”項下色譜條件重復(fù)進樣6次，阿魏酸、丹皮酚峰面積RSD值分別為0.92%、0.67%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取溫經(jīng)膏水提供試品溶液分別于制備后0、3、6、9、12、24 h，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，阿魏酸、丹皮酚峰面積RSD值分別為0.74%、0.83%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 重復(fù)性試驗 平行制備6份溫經(jīng)膏水提供試品溶液，分別按“2.1.1”項下色譜條件進樣，阿魏酸、丹皮酚峰面積RSD值分別為1.97%、1.34%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 取含量已知的供試品水提溶液6份，每份1 mL，分別精密加入對照品溶液1 mL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析。結(jié)果顯示，阿魏酸、丹皮酚平均加樣回收率分別為97.83%、99.67%，RSD值分別為1.71%、0.56%。表明方法準(zhǔn)確性良好。（見表1）

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.1.10 樣品測定 取待測供試品溶液按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄阿魏酸和丹皮酚的色譜峰面積，分別代入“2.1.5”項下的回歸方程計算各成分在供試品中的質(zhì)量濃度，并以對應(yīng)藥材量計算阿魏酸和丹皮酚在供試品中的含量。

2.2 干膏率的測定精密吸取已定容的提取液25 mL，置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105℃條件下干燥3 h，置于干燥器中冷卻0.5 h，迅速精密稱定，至兩次質(zhì)量差異不超過0.3mg，記錄各樣品液的干膏質(zhì)量，按以下公式計算干浸膏得率。

注：W.干浸膏質(zhì)量（g）；W1.藥材取樣量（g）；V.定容體積（mL）

2.3 評價指標(biāo)的組合賦權(quán)

2.3.1 G1法主觀賦權(quán)[13-14]建立評價指標(biāo)y1，y2，…ym，確定各評價指標(biāo)的序關(guān)系，記為y1＞y2＞…ym（相對于某評價目標(biāo)的序關(guān)系）。根據(jù)實際情況及參考文獻得出相鄰2個準(zhǔn)則層yk-1與y重要性程度之比rk的理性賦值。確定了rk的理性賦值后，權(quán)重系數(shù)wk的計算，見公式（1）。

2.3.2 熵權(quán)法客觀賦權(quán)[15-16]熵權(quán)法是一種根據(jù)各項指標(biāo)觀測值來確定指標(biāo)權(quán)重的方法。熵用來度量系統(tǒng)混亂程度或無序程度，如果指標(biāo)的熵值越小，則它所包含的信息越多，在綜合評分中所占的比重越大，操作如下：

第一步：原始數(shù)據(jù)矩陣歸一化。歸一化后得到屬性矩陣R=（rij）n×m（m表示評價指標(biāo)個數(shù)、n表示評價對象個數(shù)），進行歸一化，見公式（2）。

yij表示第i個評價對象的第j項指標(biāo)數(shù)值；yjmax、yjmin分別是yij的最大和最小值；i為1，2，…，n；j為1，2，…，m。

第二步：求指標(biāo)熵值。

第三步：計算指標(biāo)權(quán)重系數(shù)。

2.3.3 組合權(quán)重的確定[9]用w1、w2分別表示G1法得到的主觀權(quán)重，熵權(quán)法得到的客觀權(quán)重，組合權(quán)重計算公式為（5）。

2.4 提取工藝研究

2.4.1 浸泡時間考察[17-18]浸泡時間的長短是影響提取效果的因素之一，中藥飲片煎煮前適宜的浸泡能夠讓藥材吸水至飽和狀態(tài)，有利于有效成分的溶出，但浸泡時間過長則易導(dǎo)致藥材霉敗，化學(xué)成分酶解等不良影響?，F(xiàn)將吸水率作為考察指標(biāo),通過單因素試驗對浸泡時間進行考察。

（1）試驗方法：按處方配比稱取藥材（182 g）9份，置于3 000 mL燒杯中，各加10倍量水沒過藥材，密閉，室溫放置。分別浸泡10、15、20、30、40、50、60、70、80 min后，紗布過濾，測量濾液體積，按下式計算各時間點藥材的吸水率。

（2）試驗結(jié)果：藥材在30 min以后的吸水率無明顯變化，說明藥材此時吸水已經(jīng)達到飽和，從生產(chǎn)實際出發(fā)，既要充分浸泡，又要節(jié)省時間，因此最終確定藥材浸泡時間為30 min。（見表2）

表2 浸泡時間考察試驗結(jié)果

2.4.2 正交試驗設(shè)計 按處方配比稱取組方182 g，共9份，以加水倍量、提取時間、提取次數(shù)為考察因素，以阿魏酸、丹皮酚提取量及浸膏得率為評價指標(biāo)，采用L9（34）正交設(shè)計優(yōu)選溫經(jīng)膏的水提工藝參數(shù)，因素水平見表3。

表3 因素水平表

根據(jù)處方的君、臣、佐、使配伍原則，用G1法來確定3個評價指標(biāo)的重要關(guān)系為阿魏酸提取量＞丹皮酚提取量＞浸膏得率，并確定各指標(biāo)的權(quán)重評價標(biāo)度，其中r2=1.2，r3=1.4。根據(jù)r2、r3得到各指標(biāo)的主觀權(quán)重值w1。根據(jù)提取工藝的試驗結(jié)果，選取熵權(quán)法計算各指標(biāo)的客觀權(quán)重值w2。最后根據(jù)公式（5）來計算組合權(quán)重值（W），并計算9組試驗的指標(biāo)綜合評分Pj，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。組合權(quán)重結(jié)果見表4。

表4 評價指標(biāo)權(quán)重值

直觀分析結(jié)果如表5，方差分析結(jié)果見表6，Pj計算公式為公式（6）。

表5 試驗設(shè)計及結(jié)果

表6 方差分析

結(jié)果表明，各因素對試驗結(jié)果綜合評分的作用主次為B＞C＞A，其中B3＞B2＞B1，C2＞C3＞C1，A2＞A3＞A1；由方差分析可知，在α=0.05時，因素B（提取時間）對試驗結(jié)果的綜合評分有顯著性影響，其他兩個因素均無顯著性影響。綜合生產(chǎn)實際和保證臨床療效，最終選取A2B3C2為最佳提取工藝，即共提取2次，第一次加10倍量的水，提取2h，第二次加8倍量的水，提取1.5h。

2.4.3 驗證試驗 根據(jù)優(yōu)選的提取工藝A2B3C2，進行了3次驗證試驗，其綜合評分分別為97.91、99.90、98.57；x=98.79，RSD=0.84%，3批數(shù)據(jù)無顯著性差異，結(jié)果表明優(yōu)選的水提工藝參數(shù)穩(wěn)定、合理可行。

2.5 濃縮工藝考察

2.5.1 濃縮方式考察 稱取6個處方量的藥材，按上述已經(jīng)優(yōu)選的提取工藝進行提取，提取液分成等量的6份，其中3份采用常壓濃縮；另外3份采用減壓濃縮（溫度70℃，真空度-0.06～-0.08 Mpa）。在濃縮至相對密度約為1.25（60℃）時取樣檢測，結(jié)果見表7。綜合評分=丹皮酚含量/丹皮酚含量最大值×1/3×100+阿魏酸含量/阿魏酸含量最大值×2/3×100。

表7 濃縮工藝中濃縮方式考察結(jié)果（n=3）

試驗結(jié)果表明，濃縮方法對阿魏酸和丹皮酚含量影響均較大，其中減壓濃縮優(yōu)于常壓濃縮，所以參考綜合評分的結(jié)果，最終采用減壓濃縮（溫度為70℃，真空度-0.06～-0.08 Mpa）作為溫經(jīng)膏的濃縮方法。

2.5.2 濃縮溫度考察 按處方配比稱取12份樣品，按優(yōu)選的最佳提取工藝，參考實際生產(chǎn)情況，分別考察60℃、70℃、80℃、90℃減壓濃縮溫度對溫經(jīng)膏中指標(biāo)性成分阿魏酸和丹皮酚的含量影響情況。結(jié)果表明，阿魏酸在70℃減壓濃縮時，含量最高；丹皮酚在60℃減壓濃縮時，含量最高。根據(jù)綜合評分，阿魏酸、丹皮酚的綜合評分在70℃含量最高。結(jié)果表明70℃是最優(yōu)減壓濃縮溫度。（見表8）

表8 濃縮工藝中濃縮溫度考察結(jié)果（n=3）

2.6 成型工藝研究取制備好的浸膏30 g共5份，按表8加入不同配比的煉糖，不斷攪拌，繼續(xù)加熱，再按處方配比加入烊化后的阿膠，混勻，收膏。分別取一定量品嘗，觀察狀態(tài)并按2020年版《中華人民共和國藥典》項下方法檢測不溶物和相對密度。結(jié)果見表9。

表9 煉糖用量考察試驗結(jié)果表

結(jié)果表明，當(dāng)m（煉糖）∶m（清膏）=1.5∶1和2∶1時，口感改善均較明顯，考慮到盡可能減少輔料用量，降低服用量，又利于成型，最終選擇m（煉糖）∶m（清膏）=1.5∶1。此時成品的口感較好，黏稠度適中，不溶物符合規(guī)定，相對密度為1.342（60℃），根據(jù)前期經(jīng)驗，該密度既能滿足煎膏劑要求，其流動性又能滿足包裝設(shè)備要求。另外，根據(jù)2020年版《中華人民共和國藥典》四部規(guī)定，煎膏劑加煉糖的量，要求不超過清膏量的3倍，本工藝加入煉糖的量僅為清膏量的1.5倍，符合藥典要求。

2.7 含量測定色譜條件同“2.1.1”項，溶液制備同“2.1.2”“2.1.3”“2.1.4”項，線性關(guān)系考察同“2.1.5”項方法，精密度試驗“2.1.6”項方法，穩(wěn)定性試驗同“2.1.7”項方法，重復(fù)性試驗同“2.1.8”項方法，加樣回收率試驗同“2.1.9”項方法。取3批溫經(jīng)膏，進行含量測定，結(jié)果見表10。3批成品中阿魏酸、丹皮酚的含量比較穩(wěn)定，說明該工藝穩(wěn)定性好，檢測方法可行。

表10 含量測定結(jié)果

3 討 論

本試驗從提取、濃縮和成型3個方面對溫經(jīng)膏的工藝進行了較為全面的研究。溫經(jīng)膏組方藥味較多，成分復(fù)雜，單一浸膏得率并不能完全反映溫經(jīng)膏的內(nèi)在質(zhì)量。溫經(jīng)湯中吳茱萸辛散溫通，溫經(jīng)散寒；當(dāng)歸、川芎活血祛瘀，養(yǎng)血調(diào)經(jīng)；牡丹皮既助活血散瘀，又清血分虛熱；諸藥配伍，共奏溫經(jīng)散寒、養(yǎng)血祛瘀之效。上述中藥在“溫經(jīng)膏”中針對主病主證起主要治療之作用，為本膏方之君藥部分。吳茱萸因有小毒，在整個處方中的藥占比偏低，從而使吳茱萸的主要有效成分吳茱萸堿和吳茱萸次堿含量偏低，不易檢測；阿魏酸是2020年版《中華人民共和國藥典》一部中當(dāng)歸和川芎質(zhì)量控制的指標(biāo)成分；丹皮酚是牡丹皮中主要的有效成分，且為牡丹皮質(zhì)量控制的指標(biāo)成分。因丹皮酚可隨水蒸氣蒸餾，阿魏酸不穩(wěn)定，見光、加熱均易分解，在水提和濃縮過程中，提取次數(shù)、提取時間、濃縮方法和濃縮溫度都會對阿魏酸和丹皮酚的含量產(chǎn)生影響[19-21]，故選擇將阿魏酸和丹皮酚的含量測定作為溫經(jīng)膏水提工藝和濃縮工藝的重要考察指標(biāo)。

本研究將熵權(quán)法和G1法有效地結(jié)合起來，從主觀、客觀兩方面進行綜合評價，可同時兼顧決策者的主觀性和待評價對象各指標(biāo)的內(nèi)在聯(lián)系。這將使溫經(jīng)膏提取工藝的多指標(biāo)綜合評價結(jié)果更加科學(xué)合理。本研究通過單因素考察，確定了溫經(jīng)膏水提的最佳浸泡時間。本研究采用基于G1-熵權(quán)法的主客觀組合賦權(quán)法的L9（34）正交設(shè)計，以加水量、提取時間和提取次數(shù)為考察因素，丹皮酚、阿魏酸提取量及干膏率為評價指標(biāo)，優(yōu)選出溫經(jīng)膏的最佳水提工藝，最佳水提工藝為第1次加10倍量水，浸泡0.5 h，煎煮2.0 h，第2次加8倍量的水，煎煮1.5 h。本研究從濃縮方式和濃縮溫度兩方面分別對濃縮工藝進行研究，結(jié)果表明，當(dāng)溫度為70℃，真空度為-0.06～-0.08 Mpa時，濃縮過程對阿魏酸和丹皮酚的破壞最小。成型工藝方面主要是從煉糖與清膏的配比進行考察，當(dāng)煉糖與清膏質(zhì)量比為1.5∶1時，成品的口感較好，黏稠度適中，不溶物符合規(guī)定，相對密度既能滿足煎膏劑要求，其流動性又能滿足包裝設(shè)備要求。最后經(jīng)3批試驗驗證，重復(fù)性良好。

本研究篩選出的溫經(jīng)膏制備工藝穩(wěn)定可行，建立的含量測定方法專屬性強、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，能夠作為溫經(jīng)膏的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。由于實驗條件限制，本研究未能建立溫經(jīng)膏多組分一測多評的含量測定方法，這是本試驗的不足之處。課題組后續(xù)將對溫經(jīng)膏進行高效液相指紋圖譜研究，在此基礎(chǔ)上采用HPLC多波長切換法實現(xiàn)溫經(jīng)膏多種成分含量測定，旨在為溫經(jīng)膏的關(guān)鍵質(zhì)量屬性研究提供參考，為后續(xù)相關(guān)制劑的制備工藝、質(zhì)量控制以及產(chǎn)品安全性、穩(wěn)定性的評價提供借鑒。