沉香愈傷組織培養(yǎng)研究

盧煒樂

（中山市黃圃鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，廣東中山 528429）

土沉香作為一種瑞香科，沉香屬喬木，是我國生產(chǎn)沉香的唯一植物資源?，F(xiàn)有土沉香大多分布于我國廣東、廣西、海南、福建等區(qū)域內(nèi)的低海拔山地、丘陵地區(qū)[1]。不過隨著社會經(jīng)濟的持續(xù)發(fā)展，我國沉香植物的正常生長也受到一定影響。如今土沉香已經(jīng)被列入《國家二級保護植物名錄》以及《世界自然保護聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄》，屬于易危類植物。因此，對沉香余生組織培養(yǎng)進行研究分析，進而為土沉香資源進行保護、保存提高技術(shù)支持，將有著重要的研究意義[2]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用的土沉香材料均來自于廣東省中山市、江門市的土沉香當年生嫩枝。采集的材料在帶回實驗室后均需要置于盛有洗潔精溶液的燒杯中進行攪拌處理，具體攪拌時間應(yīng)控制在5min 左右，之后用清水對攪拌處理后的材料進行沖洗處理，確保材料完全清洗干凈后，將材料置于無菌環(huán)境下進行保存，以待后續(xù)試驗使用。在試驗開始后，在無菌環(huán)境下用70%的酒精對材料消毒處理30s 以上。然后置于濃度為0.2%的升汞溶液中進行滅菌處理，滅菌時間控制在8min 左右。最后，用無菌水沖洗材料，沖洗次數(shù)通常為5～6 次。沖洗完成后分別取嫩枝材料中的葉片和莖段進行土沉香誘導(dǎo)愈傷組織試驗，其中葉片大小標準為0.5cm×0.5cm；莖段長度為準為0.5cm。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 不同生長調(diào)節(jié)素對土沉香愈傷組織培養(yǎng)及不定芽分化的影響。以MS 為基本培養(yǎng)基，添加30g/L 蔗糖、8g/L 瓊脂、0.1g/L 肌醇，并將培養(yǎng)基pH 值控制在5.8～6.0 區(qū)間內(nèi)。然后設(shè)計加入不同濃度的2,4-D、NAA、BAP 單劑及其組合共10 個處理（詳見表1），完成培養(yǎng)基封裝后，在1.1kg/cm2的壓力環(huán)境下，以121℃對培養(yǎng)基進行滅菌處理，具體處理時間應(yīng)控制在15min 左右，用于土沉香誘導(dǎo)愈傷組織。每個處理接種2 瓶培養(yǎng)瓶，并在每個培養(yǎng)瓶中置于8 片標準葉片或8 個莖段，重復(fù)3 次。完成后的10d，培養(yǎng)瓶中的部分葉片或者莖段外植體的傷端開始生產(chǎn)愈傷組織，30d 后，培養(yǎng)瓶中的葉片或莖段外植體均形成愈傷組織。此時對培養(yǎng)瓶中的愈傷組織培養(yǎng)進行數(shù)據(jù)采集分析。

1.2.2 不同生長調(diào)節(jié)素對土沉香芽增殖的影響。根據(jù)土沉香愈傷組織培養(yǎng)及不定芽分化的效果，采用莖段外植體愈傷組織所分化出的不定芽進行增殖試驗。試驗共設(shè)不同濃度生長調(diào)節(jié)素8 個處理（詳見表2），經(jīng)過7d 的培養(yǎng)后，芽體基部均開始出現(xiàn)膨脹，并于20d 后整體芽體均已完全膨脹，,繼續(xù)對芽體進行培養(yǎng)，于50d 后對所有芽體的增殖情況進行統(tǒng)計分析。

1.2.3 不同生長調(diào)節(jié)素對生根誘導(dǎo)的影響。對土沉香莖段外植體愈傷組織叢生芽進行繼續(xù)培養(yǎng)，待叢生芽高度長至1.5cm～2.5cm，并且具有3～4 片小葉時，將分株后的單株移入到12 個含有不同濃度的NAA 或者IBA 生長調(diào)節(jié)素，并于30d 后統(tǒng)計單株的生根率。

1.3 培養(yǎng)條件

試驗中培養(yǎng)環(huán)境溫度控制在25±2℃，在誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)過程中采用暗培養(yǎng)方式，其他階段則以日光燈作為光源進行光下培養(yǎng)，此過程中每天將光照時間控制在12h，具體光照強度控制在15～25μmol/m2/s。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長調(diào)節(jié)素對愈傷組織培養(yǎng)的影響

由表1 可知BAP 對土沉香生成愈傷組織的影響相對較大，具體表現(xiàn)為所有添加有BAP 的培養(yǎng)基在接種后均會一定程度上影響土沉香愈傷組織的形成及培養(yǎng)，并且隨著培養(yǎng)基中BAP 濃度的持續(xù)增加，土沉香愈傷組織的培養(yǎng)效率也越低，甚至在完全采用BAP 進行土沉香外植體愈傷組織培養(yǎng)時會直接導(dǎo)致外植體未形成愈傷組織。若僅采用NAA 或者2,4-D 生長調(diào)節(jié)素進行土沉香外植體愈傷組織培養(yǎng)，則會導(dǎo)致外植體愈傷組織培養(yǎng)過程中的誘導(dǎo)率不足，尤其是在僅采用2,4-D 生長調(diào)節(jié)素的情況下，葉片和莖段2 種土沉香外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率僅有52.5%和57.2%。結(jié)合不同外植體對愈傷生長速度來看，雖然所采用的外植體分別為土沉香的莖段和葉片，實際形態(tài)及結(jié)構(gòu)均存在較大差異，但不同外植體對土沉香愈傷組織誘導(dǎo)率及生長速度的影響較不明顯[5]。在深入研究后可以發(fā)現(xiàn)，莖段外植體所分化形成的愈傷組織較為稀松，而葉片外植體所分化形成的愈傷組織則較為硬密，試驗結(jié)果表明，0.1mg/L BAP+0.5mg/L NAA 的組合生長率，對愈傷組織的分化最快。

表1 不同生長調(diào)節(jié)素對土沉香莖段和葉片外植體愈傷組織的產(chǎn)生及芽分化情況影響

2.2 不同生長調(diào)節(jié)素對芽分化的影響

由表1 可知，在所有生長調(diào)節(jié)素中，濃度為1.0mg/L BAP+0.5mg/L NAA 組合使用后的土沉香外植體愈傷組織不定芽分化率最高，莖段外植體和葉片外植體的不定芽分化率分別為69.3%和47.7%，但是也存在生長速度極慢的缺點，考慮生長素主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織的作用，分化率越高越好，因此土沉香不定芽分化最佳生長調(diào)節(jié)素組合為1.0mg/L BAP+0.5mg/L NAA。

2.3 不同生長調(diào)節(jié)素對芽增殖的影響

由表2 可知，相對來說，不含有生長調(diào)節(jié)素的培養(yǎng)基內(nèi)的不定芽增殖系數(shù)最低，說明不采用生長調(diào)節(jié)素雖然可以實現(xiàn)芽增殖效果，但整體增長效率較低，不符合當前土沉香愈傷組織培養(yǎng)需求。

表2 不同生長調(diào)節(jié)素對芽增殖的影響

在培養(yǎng)基僅含有BAP 生長調(diào)節(jié)素的情況下，隨著培養(yǎng)基中BAP 濃度的持續(xù)增加，新芽體數(shù)量在增加，但不定芽的增殖系數(shù)卻在持續(xù)下降，說明雖然較高濃度的BAP 生長調(diào)節(jié)素有利于不定芽的增殖生長。

在BAP 和NAA 組合型生長調(diào)節(jié)素方面，較高濃度的NAA 和BAP 也會抑制不定芽的增殖生長。此種情況再次驗證生長調(diào)節(jié)素濃度過高不利于不定芽的增長生長，所以在進行不定芽增殖培育過程中應(yīng)嚴格控制生長調(diào)節(jié)素的實際濃度。綜合來看，芽增殖最佳生長調(diào)節(jié)素為0.05mg/L BAP。

2.4 不同生長調(diào)節(jié)素對生根誘導(dǎo)的影響

由表3 可知，NAA 和IBA 兩類生長調(diào)節(jié)素中，NAA有著較強的生根率促進效果，且隨著濃度的升高土沉香生根率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，NAA 濃度超過0.02mg/L 以后，濃度越高，抑制單株生根效果越強。而不采用生長調(diào)節(jié)素或者是采用IBA 生長調(diào)節(jié)素均無法促使單株生根。因此，為保障單株的生根率，應(yīng)優(yōu)先采用NAA 生長調(diào)節(jié)素，且以0.02mg/L NAA 生根培養(yǎng)效果最佳。

表3 不同生長調(diào)節(jié)素對生根誘導(dǎo)的影響

3 結(jié)果與討論

研究結(jié)果表明，濃度為0.1mg/L BAP+0.5mg/L NAA的組合生長率，對愈傷組織的誘導(dǎo)率100%，分化最快。濃度分別為1.0mg/LBAP+0.5mg/LNAA 的組合型生長調(diào)節(jié)素對不定芽分化的分化率最高，顏色也為淺綠，應(yīng)優(yōu)先采用此種組合進行不定芽培養(yǎng)。相較于采用BAP 和NAA 組合型生長調(diào)節(jié)素，僅采用單一的BAP 生長調(diào)節(jié)素更有利于不定芽的增殖生長。因此，在土沉香莖段外植體愈傷組織不定芽增殖培養(yǎng)過程中，應(yīng)優(yōu)先采用濃度為0.05mg/L 的BAP 作為生長調(diào)節(jié)素。

相較于生長調(diào)節(jié)素直接生根誘導(dǎo)來說，間接生根誘導(dǎo)的生根率更快。同時，間接生根誘導(dǎo)中，NAA 生長調(diào)節(jié)素的濃度控制在1.0mg/L。

通過誘導(dǎo)土沉香愈傷組織培養(yǎng)，并針對不同生長調(diào)節(jié)素對土沉香莖段和葉片外植體愈傷組織的產(chǎn)生及芽分化的影響進行分析。結(jié)果與中國華南研究所土沉香愈傷組織培養(yǎng)及植株再生研究，不同生長調(diào)節(jié)劑對莖段和外植體愈傷組織分化的研究濃度為0.1mg/L BAP+0.5mg/L NAA 的組合生長率，對愈傷組織的誘導(dǎo)率100%，分化最快。濃度分別為1.0mg/LBAP+0.5mg/LNAA 的組合型生長調(diào)節(jié)素對不定芽分化的分化率最高，僅采用單一的BAP 生長調(diào)節(jié)素更有利于不定芽的增殖生長，NAA 生長調(diào)節(jié)素的濃度控制在1.0mg/L 最好，試驗方向和結(jié)果一致。