基于PacBio三代測(cè)序的香瓜茄（人參果）基因組的組裝

司誠(chéng) 鐘啟文 楊世鵬

（1. 青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院 青海省蔬菜遺傳與生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016；2. 青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016）

香瓜茄（Solanum muricatum）是原產(chǎn)于南美洲的二倍體（2n=24）茄科作物［1］，因其具有抗氧化、抗糖尿病、抗炎和抗腫瘤活性的作用而聞名［2-4］。果實(shí)通常呈圓形、橢圓形或細(xì)長(zhǎng)形，成熟時(shí)黃色的果皮上覆蓋著紫色條紋，香氣濃郁，果肉黃色帶有甜味，芳香多汁，富含大量的維生素C［5］，具有較大的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、商業(yè)價(jià)值以及藥用價(jià)值。

近幾年，香瓜茄作為被消費(fèi)者熟知的水果作物，其大部分研究工作主要集中在抗病機(jī)理［6］、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［7］、藥用代謝物［8］、茄科近緣物種比較［9-10］等方面。目前，根據(jù)測(cè)序技術(shù)的不斷更迭，番茄（Solanum lycopersicum）［11］、 辣 椒（Capsicum annuum）［12-13］、馬 鈴 薯（Solanum tuberosum）［14］、 茄 子（Solanum melongena）［15］、煙草（Nicotiana tabacum）［16］等物種的基因組已有多個(gè)版本的完整基因組，不同番茄的近緣種（醋栗番茄 Solanum pimpinellifolium［17］、潘那利番茄Solanum pennellii［18］）基因組也通過測(cè)序被解析。與香瓜茄親緣關(guān)系最近的馬鈴薯，基于組裝了雜合二倍體馬鈴薯RH89-039-16（RH）之后［19］，四倍體馬鈴薯的第一個(gè)高質(zhì)量單倍型組裝也被報(bào)道［20］。

植物基因組包含重要的遺傳信息。基因組序列可用于植物比較基因組學(xué)的研究，同時(shí)也是研究植物進(jìn)化的資源。高質(zhì)量的參考基因組有利于選擇改進(jìn)農(nóng)藝性狀的基因，對(duì)研究其分子機(jī)理、加速植物育種至關(guān)重要。而Hi-C技術(shù)是染色體構(gòu)象捕獲技術(shù)結(jié)合高通量測(cè)序衍生的一種技術(shù)，主要研究染色體的三維結(jié)構(gòu)［21］。多種作物基因組序列的公布及解析，為植物重要性狀（如果肉性狀［22］、抗性水平［23-24］等）以及豐富的基因遺傳資源的挖掘等提供了有力工具，還可據(jù)此推測(cè)基因組的進(jìn)化演變，促進(jìn)對(duì)關(guān)鍵農(nóng)藝性狀候選基因的篩選和分子標(biāo)記的開發(fā)［25］，帶動(dòng)CRISPR等技術(shù)的發(fā)展及其在作物育種中的應(yīng)用［26-27］，已經(jīng)成為作物育種改良的重要資源和工具。

目前尚未報(bào)道香瓜茄基因組，限制了該物種的各項(xiàng)研究。本研究利用PacBio和Hi-C測(cè)序技術(shù)，獲得香瓜茄的基因組序列，解釋香瓜茄與近緣茄科作物的進(jìn)化關(guān)系，為豐富茄科作物基因組信息及進(jìn)化發(fā)育歷程，同時(shí)為香瓜茄相關(guān)分子研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為香瓜茄甜圓形果實(shí)類型（sweet-round friut，SRF）栽培種，采集自青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院園藝創(chuàng)新基地（36°38'N，101°55'E，海拔 2 200 m），經(jīng)莖尖脫毒處理后，將組培苗新鮮葉片用蒸餾水清洗干凈后，擦干，-80℃保存，送北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 采用CTAB法提取香瓜茄植物組織DNA。

1.2.2 基因組大小的預(yù)測(cè)

1.2.2.1 文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序 將檢測(cè)合格的DNA樣品通過Covaris超聲波破碎儀隨機(jī)打斷成片段，經(jīng)末端修復(fù)、加Ploy A尾、加測(cè)序接頭、純化、PCR擴(kuò)增等步驟完成整個(gè)文庫(kù)制備。構(gòu)建好的文庫(kù)通過Illumina Hiseq進(jìn)行PE測(cè)序。

1.2.2.2 基因組組裝 通過對(duì)raw read質(zhì)控得到clean read，采用SOAPdenovo軟件進(jìn)行拼接。SOAPdenovo拼接的基本過程，利用K-mer頻數(shù)表數(shù)據(jù)糾錯(cuò)。對(duì)于有低頻K-mer出現(xiàn)的reads進(jìn)行糾錯(cuò)，經(jīng)過糾錯(cuò)之后的數(shù)據(jù)用于后續(xù)的基因組組裝。將糾錯(cuò)后的小片段庫(kù)的reads截?cái)喑筛〉男蛄衅危瑯?gòu)建de Brujin圖［28-29］，獲得拼接的contigs。將所有文庫(kù)測(cè)序得到的reads比對(duì)回拼接的contigs，利用reads之間的連接關(guān)系和插入片段大小信息，將contigs組裝成scaffolds。

1.2.2.3 基因組大小預(yù)估 利用Illumina HiSeq測(cè)序得到測(cè)序結(jié)果，選取Kmer=41組裝到Scaffold，通過K-mer分析初步判斷樣品的基因組大小、雜合情況、重復(fù)序列信息等評(píng)估基因組大小。

1.2.3 三代基因組文庫(kù)構(gòu)建及組裝 打斷DNA樣品后對(duì)打斷的DNA樣品進(jìn)行損傷修復(fù)及末端修復(fù)，連接啞鈴型接頭，進(jìn)行核酸外切酶消化，使用BluePippin進(jìn)行目的片段篩選，獲得測(cè)序文庫(kù)。

PacBio測(cè)序數(shù)據(jù)通過初級(jí)分析評(píng)估、過濾低質(zhì)量的reads、去除接頭后得到reads，進(jìn)一步堿基糾錯(cuò)后得到高準(zhǔn)確性的CCS數(shù)據(jù)，用于基因組組裝、組裝后評(píng)估等信息分析。

1.2.4 Hi-C技術(shù)輔助組裝 將香瓜茄組培苗活體植株取樣后，利用甲醛將樣品固定，將細(xì)胞內(nèi)蛋白與DNA、DNA與DNA之間進(jìn)行交聯(lián)，利用限制性內(nèi)切酶將DNA進(jìn)行酶切，利用末端修復(fù)機(jī)制引入生物素標(biāo)記的堿基，將末端修復(fù)后的DNA片段進(jìn)行環(huán)化、DNA解交聯(lián)及純化后，破碎為300-700 bp的片段，利用鏈親和素磁珠捕獲含有互作關(guān)系的DNA片段進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。

文庫(kù)構(gòu)建完成后，分別使用Qubit（2.0）和Agilent 2100對(duì)文庫(kù)的濃度和插入片段大小進(jìn)行檢測(cè)，使用qPCR方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫(kù)質(zhì)量。庫(kù)檢合格后，用Illumina平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序讀長(zhǎng)為PE150。

1.2.5 基因組注釋 對(duì)組裝完的基因組進(jìn)行基因組注釋，包括重復(fù)序列、編碼基因及功能注釋、假基因、非編碼RNA注釋等。

1.2.5.1 重復(fù)序列注釋 采用RepeatModeler2（v2.0.1）［30］、LTR_retriever（v2.8）［31］進(jìn)行從頭預(yù)測(cè)（從頭 預(yù) 測(cè) 軟 件 RECON（v1.0.8）［32］和 RepeatScout（v1.0.6）［33］），RepeatClassifier［30］借 助 于 repbase（v19.06）［34］、REXdb（v3.0）［35］和 Dfam（v3.2）［36］3個(gè)已知數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行分類。將上述從頭預(yù)測(cè)結(jié)果和已知數(shù)據(jù)庫(kù)合并去冗余后得到該物種特定的重復(fù)序列數(shù)據(jù)庫(kù)，最后使用RepeatMasker（v4.1.0）［37］基于構(gòu)建好的重復(fù)序列數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)該基因組進(jìn)行轉(zhuǎn)座子序列（TE）的預(yù)測(cè)。

1.2.5.2 編碼基因預(yù)測(cè)及評(píng)估 使用Augustus（v2.4）和 SNAP［38］進(jìn)行從頭預(yù)測(cè)，使用 GeMoMa（v1.7）進(jìn)行基于同源物種的預(yù)測(cè)。有參的轉(zhuǎn)錄本主要使用 Hisat（v2.0.4）和 Stringtie（v1.2.3）獲得，并利用GeneMarkS-T（v5.1）進(jìn)行基因預(yù)測(cè)。無參轉(zhuǎn)錄本主要通過Trinity（v2.11）［39］組裝獲得，然后使用PASA（v2.0.2）進(jìn)行基因預(yù)測(cè)。最后利用EVM（v1.1.1）［40］整合上述3種方法得到的預(yù)測(cè)結(jié)果。

1.2.5.3 非編碼RNA和假基因的預(yù)測(cè) 非編碼RNA包括microRNA、rRNA和tRNA等多種已知功能的RNA，針對(duì)不同非編碼RNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，采用了不同的策略來預(yù)測(cè)。利用tRNAscan-SE（v1.3.1）識(shí)別 tRNA，rRNA 預(yù)測(cè)主要基于 Rfam（v12.0）［41］數(shù)據(jù)庫(kù)并采用barrnap（v0.9）進(jìn)行預(yù)測(cè)，miRNA通過miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定，snoRNA和snRNA基于Rfam（v12.0）數(shù)據(jù)庫(kù)并利用Infenal（1.1）進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過GenBlastA（v1.0.4）比對(duì)，在屏蔽完真基因座的基因組上尋找同源的基因序列，然后利用GeneWise（v2.4.1）［42］尋找基因序列中的不成熟的終止密碼子及移碼突變。

1.2.6 基因功能注釋 對(duì)預(yù)測(cè)得到的基因序列進(jìn)行 NR（ftp：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db）、KEGG（http：//www.genome.jp/kegg）、SWISS-PROT（http：//ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/swissprot）和 Pfam［41］等數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋分析。

2 結(jié)果

2.1 基因組預(yù)估及初步組裝

2.1.1 測(cè)序數(shù)據(jù)量統(tǒng)計(jì) 利用Illumina HiSeq測(cè)序得到54.26 Gb的raw reads，經(jīng)質(zhì)控后獲得54.11 Gb clean reads，測(cè)序深度31 X。Clean reads Q20=97.31%，Q30=92.75%，均大于90%，測(cè)序錯(cuò)誤率（0.04%）＜0.05%，也在容錯(cuò)范圍內(nèi)，表明測(cè)序質(zhì)量較好。

2.1.2 17-mer分析及基因組大小估計(jì) 通過對(duì)香瓜茄過濾得到的54.11 Gb的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行17-mer分析（圖1），根據(jù)survey分析結(jié)果，在主峰值前約1/2處（depth=15）出現(xiàn)一個(gè)較為明顯的小峰，說明香瓜茄基因組的雜合程度較高。主峰后depth=62處同樣也出現(xiàn)一個(gè)小峰，并且與主峰成倍數(shù)關(guān)系，但由于其峰值較低，峰形不明顯，應(yīng)是重復(fù)序列所導(dǎo)致，而非同源多倍體。Depth＞62之后的拖尾則是由于香瓜茄基因組重復(fù)導(dǎo)致。由公式Kmer-number/depth計(jì)算得到的基因組大小約為1 252.41 Mb，修正后的基因組大小為1 238.06 Mb，基因組雜合率為0.84%，重復(fù)序列比例為65.87%（表1）。

表1 香瓜茄基因組特征Table 1 Pepino genomic characteristics

圖1 Depth和K-mer個(gè)數(shù)及種類頻率分布圖Fig. 1 Depth and number of K-mer as well species frequency distribution

2.1.3 基因組組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì) 采用Soapdenovo軟件對(duì)香瓜茄序列進(jìn)行拼接（表2），以Kmer=41組裝到Scaffold，contig N50為2 049 bp，總長(zhǎng)為1 141 353 553 bp，scaffold N50為3 185 bp，總長(zhǎng)為1 169 596 440 bp。圖2-a及2-b展示contig分布情況。

圖2 Contig覆蓋深度、長(zhǎng)度和數(shù)量分布圖Fig. 2 Contig coverage depth, length and number distribution map

表2 組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of assembly results

2.1.4 GC含量及其分布 通過對(duì)組裝的contig進(jìn)行GC含量統(tǒng)計(jì)，根據(jù)contigs的GC分布以及覆蓋深度信息繪制散點(diǎn)圖（圖3）。發(fā)現(xiàn)大多分布在20%-50%，主要集中在36%左右，經(jīng)計(jì)算得到基因組GC含量為36.30%。

圖3 GC含量與測(cè)序深度（depth）關(guān)聯(lián)分析統(tǒng)計(jì)圖Fig. 3 Statistical analysis of GC content and sequencing depth

2.2 PacBio三代測(cè)序組裝結(jié)果及評(píng)估

2.2.1 PacBio測(cè)序結(jié)果 在PacBio測(cè)序平臺(tái)獲得香瓜茄基因組的raw reads及組裝結(jié)果（圖4）。使用該樣品的基因組DNA構(gòu)建PacBio文庫(kù)，測(cè)序獲得約55 080 918 774 bp（55.08 Gb）的CCS數(shù)據(jù)，總測(cè)序深度約為47.64 X，reads N50為14 640 bp，平均讀長(zhǎng)為14.179 bp。過濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)得到的質(zhì)控后讀數(shù)共包含3 884 556條reads。

圖4 Reads長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)Fig. 4 Reads length distribution statistics

2.2.2 組裝結(jié)果 PacBio數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控后得到高準(zhǔn)確性的CCS數(shù)據(jù)，然后基于CCS數(shù)據(jù)使用hifiasm（v0.12）軟件進(jìn)行初步組裝，得到基因組序列（表3）?；蚪M序列總長(zhǎng)度為1.15 Gb，contig N50為22.63 Mb，其中，1 kb以上contig數(shù)目1 813個(gè)，contig N90為596 645 bp，最長(zhǎng)的contig為83 851 337 bp，GC含量為35.83%。

表3 組裝結(jié)果的統(tǒng)計(jì)信息Table 3 Statistical information of assembly results

2.2.3 組裝結(jié)果評(píng)估 利用bwa軟件將二代高通量測(cè)序（如Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)）得到的短序列與參考基因組比對(duì)，統(tǒng)計(jì)比對(duì)率（99.85%），可評(píng)估組裝基因組的完整性。使用CEGMA（v2.5）來評(píng)估最終基因組組裝的完整性，有97.16%的CEGMA基因存在香瓜茄基因組中。使用BUSCO軟件評(píng)估基因組組裝完整性，有98.20%的BUSCO基因存在香瓜茄基因組中，表明基因組組裝完整性較高。

2.3 Hi-C輔助基因組組裝及評(píng)估

對(duì)初步組裝的基因組序列利用有效Hi-C數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的組裝，包括初步組裝基因組序列的分群、排序和排序后的定向，最終獲得染色體水平上基因組序列。共產(chǎn)生143 362 025 128 bp數(shù)據(jù)。通過Hi-C文庫(kù)質(zhì)量評(píng)估分析共獲得404 890 166對(duì)唯一比對(duì)到基因組上的reads（unique paired alignments），其中，252 453 038對(duì)是有效的Hi-C數(shù)據(jù)（valid interaction pairs），占唯一比對(duì)到基因組數(shù)據(jù)的62.35%；116 720 788對(duì)無效數(shù)據(jù)中末端懸掛類型的Hi-C數(shù)據(jù)（dangling end pairs），占唯一比對(duì)到基因組數(shù)據(jù)的28.83%；6 442 178對(duì)無效數(shù)據(jù)中屬于相鄰連接類型的（re-ligation pairs），占比1.59%；1 535 133對(duì)無效數(shù)據(jù)中屬于為自連類型的（self-circle ligation pairs），占比0.83%；27 739 029對(duì)無效數(shù)據(jù)中屬于其他未定義的（dumped pairs），占比6.85%。

經(jīng)過Hi-C組裝和人工調(diào)整后，共有1 123 245 570 bp的序列長(zhǎng)度的基因組序列被定位到12條染色體上，占比97.16%；在定位到染色體上的序列中，能夠確定順序和方向的序列長(zhǎng)度為1 079 553 436 bp，占定位染色體序列總長(zhǎng)度的96.11%。對(duì)Hi-C糾錯(cuò)和組裝后得到的基因組序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表4），獲得最終版本的基因組組裝統(tǒng)計(jì)結(jié)果，Contig N50為22 628 432 bp，Scaffold N50為87 253 278 bp。

表4 香瓜茄Hi-C組裝的基因組信息Table 4 Hi-C assembly information of the pepino genome

對(duì)于Hi-C組裝到染色體的基因組等長(zhǎng)切割成500 000 bp一個(gè)bin，然后任意2個(gè)bin之間覆蓋Hi-C Read Pairs的數(shù)目作為2個(gè)bin之間交互的強(qiáng)度信號(hào)（圖5），可以明顯區(qū)分出12個(gè)染色體分組；在每一分組內(nèi)部可以看出位于對(duì)角線位置的交互的強(qiáng)度要高于非對(duì)角線的位置，說明Hi-C組裝的染色體結(jié)果中鄰近的序列間（對(duì)角線位置）交互強(qiáng)度高，而非鄰近的序列之間（非對(duì)角線位置）的交互信號(hào)強(qiáng)度弱，與Hi-C輔助基因組組裝的原理一致，證明香瓜茄基因組序列掛載率高。

圖5 香瓜茄基因組Hi-C組裝染色體交互熱圖Fig. 5 Hi-C assembly chromosome interaction heat map of pepino genome

2.4 基因預(yù)測(cè)結(jié)果

對(duì)組裝完的基因組進(jìn)行基因組注釋，包括重復(fù)序列、編碼基因及功能注釋、假基因、非編碼RNA注釋等。重復(fù)序列注釋主要包括串聯(lián)重復(fù)序列（tandem repeats）和散在重復(fù)序列（interspersed repeats），其中，第二類主要是轉(zhuǎn)座子序列（transposable elements，TE）是研究的主要對(duì)象。將從頭預(yù)測(cè)結(jié)果和已知數(shù)據(jù)合并去冗余后得到該物種特定的重復(fù)序列數(shù)據(jù)庫(kù)，最后基于構(gòu)建好的重復(fù)序列數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)香瓜茄基因組進(jìn)行TE的預(yù)測(cè)。最終得到約742 491 882 bp的TE，占比64.22%，最終得到約201 341 835 bp的串聯(lián)重復(fù)序列，占比17.42%。

對(duì)香瓜茄基因采用同源預(yù)測(cè)、從頭預(yù)測(cè)和轉(zhuǎn)錄組預(yù)測(cè)，基因預(yù)測(cè)結(jié)果（表5）顯示，編碼基因預(yù)測(cè)最終得到41 571個(gè)基因；非編碼RNA即不編碼蛋白質(zhì)的RNA，包括miRNA、rRNA和tRNA等多種已知功能的RNA，針對(duì)不同非編碼RNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，采用了不同的策略來預(yù)測(cè)不同的非編碼RNA，總共預(yù)測(cè)得到4 360個(gè)tRNA、5 677個(gè)rRNA、154個(gè)miRNA、202個(gè)snRNA、287個(gè)snoRNA；假基因預(yù)測(cè)得到449個(gè)。利用擬南芥、辣椒、番茄、潘那利番茄以及馬鈴薯等開展同源預(yù)測(cè)香瓜茄基因信息，其中，香瓜茄與近緣作物馬鈴薯預(yù)測(cè)得到的基因數(shù)量最多，有51 586個(gè)。

表5 香瓜茄基因預(yù)測(cè)結(jié)果Table 5 Prediction results of pepino gene

BUSCO中embryophyta數(shù)據(jù)庫(kù)包含1 614個(gè)保守的核心基因。使用BUSCO（v4.0）軟件來評(píng)估基因預(yù)測(cè)的完整性，其中，有98.64%的BUSCO基因存在預(yù)測(cè)的基因中，說明基因預(yù)測(cè)的完整性高。

2.5 基因功能注釋

香瓜茄中99.06%的基因可以注釋到所有數(shù)據(jù)庫(kù)中（表6）。通過GO注釋分析（圖6），共有30 713個(gè)基因具有GO注釋預(yù)測(cè)的功能，占預(yù)測(cè)到總基因數(shù)的73.88%。GO注釋結(jié)果顯示整個(gè)分類中基因分布在細(xì)胞組分（cellular component）的相較于分子功能（molecular function）和生物學(xué)過程（biological process）較少，生物學(xué)過程最多。其中，二級(jí)功能分布在細(xì)胞內(nèi)（intracellular）、細(xì)胞結(jié)構(gòu)體（cellular anatomical entity）、催化活動(dòng)（catalytic activity）、結(jié)合（binding）、代謝過程（metabolic process）、細(xì)胞過程（cellular process）的基因數(shù)目相對(duì)較多。

圖6 GO二級(jí)節(jié)點(diǎn)注釋分類統(tǒng)計(jì)圖Fig. 6 Statistical chart of GO secondary node annotation classification

表6 香瓜茄基因功能注釋統(tǒng)計(jì)信息Table 6 Statistical information of pepino gene function annotation

eggNOG注釋結(jié)果（圖7）顯示，香瓜茄的蛋白序列功能主要集中在復(fù)制、重組和生物生成（L：replication，recombination and repair），占比 10.94%，轉(zhuǎn)錄（K：transcription）占比7.58%，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制（T：signal transduction mechanisms）占比7.1%，翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、分子伴侶（O：posttranslational modification，protein turnover，chaperones） 占 比6.82%，能量的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換（C：energy production and conversion）占比5.36%。eggNOG采用了COG，KOG和arCOG中引入的20個(gè)功能類別，在功能層面上對(duì)基因進(jìn)行分類。eggNOG結(jié)果反映在不同的功能類別中，通過基因數(shù)目的多少能夠展示出該物種在進(jìn)化過程中對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性。

圖7 eggNog功能注釋分類統(tǒng)計(jì)圖Fig. 7 eggNog functional annotation classification

2.6 物種進(jìn)化分析

選擇8個(gè)已知基因組信息的物種，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明，香瓜茄與馬鈴薯的進(jìn)化時(shí)間大約在12.82 MYA（圖8）。從進(jìn)化時(shí)間上來看，香瓜茄的進(jìn)化時(shí)間稍晚于煙草、辣椒和茄子。對(duì)比于基因預(yù)測(cè)結(jié)果（表5），近緣物種馬鈴薯作為香瓜茄同源預(yù)測(cè)物種，預(yù)測(cè)到的香瓜茄上的基因個(gè)數(shù)也最多，揭示了馬鈴薯與香瓜茄較近的進(jìn)化關(guān)系。

圖8 物種間分化時(shí)間Fig. 8 Differentiation time between species

3 討論

連續(xù)性和完整性是基因組組裝的重要指標(biāo)，PacBio基因組組裝和Illumina數(shù)據(jù)的糾錯(cuò)可以大大提高測(cè)序數(shù)據(jù)連續(xù)性和完整性［43］。本研究通過這種策略對(duì)香瓜茄基因組組裝顯示出高度分辨的結(jié)果，N50=22.62 Mb（megabases），與近期測(cè)序的芒苞草 N50 = 6.96 Mb［44］，黑麥 N50＞29 Mb［45］和板藍(lán)根N50=36.16 Mb［46］結(jié)果相近。在定位到染色體上的序列中，能夠確定順序和方向的序列長(zhǎng)度為1 079 Mb，占定位染色體序列總長(zhǎng)度的96.11%。BUSCO和基因預(yù)測(cè)結(jié)果分析進(jìn)一步證實(shí)了香瓜茄基因組的高質(zhì)量和完整性。

根據(jù)基因組數(shù)據(jù)構(gòu)建了香瓜茄的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，同時(shí)對(duì)比基因預(yù)測(cè)結(jié)果，香瓜茄比對(duì)到馬鈴薯上的基因個(gè)數(shù)最多，發(fā)現(xiàn)在茄科作物中，香瓜茄與馬鈴薯進(jìn)化關(guān)系最近，這與先前發(fā)表的系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果一致［9］。茄科作為雙子葉植物中最重要的果蔬類群，其包含的較多物種的基因組或基因組草圖已經(jīng)被測(cè)序完成［47-48］?；蚪M測(cè)序技術(shù)及生物信息技術(shù)的不斷發(fā)展［49］，顯著推動(dòng)了香瓜茄這種非模式作物的測(cè)序研究，香瓜茄基因組的測(cè)序完成是對(duì)茄科基因組研究的又一補(bǔ)充。我們的研究結(jié)果將為茄科的起源，進(jìn)化和多樣化分析增加了功能見解。

本研究通過對(duì)香瓜茄基因組的預(yù)估，對(duì)比PacBio第三代測(cè)序技術(shù)測(cè)序以及Hi-C輔助基因組組裝結(jié)果，首次揭示了香瓜茄基因組的大小。根據(jù)各分析指標(biāo)，推測(cè)香瓜茄基因組為高雜合基因組，針對(duì)一些物種基因組重復(fù)序列偏多的特征，可以采用三代測(cè)序或者HiFi測(cè)序等兼顧長(zhǎng)讀長(zhǎng)和高精度的測(cè)序手段開展基因組研究。隨著長(zhǎng)度測(cè)序的出現(xiàn)和完善，基因組組裝的數(shù)量和質(zhì)量正在不斷提升，但一些具有顯著生態(tài)價(jià)值和較低經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物中參考基因組的數(shù)量和質(zhì)量仍然較低，在137個(gè)植物目中，有76個(gè)植物目缺乏代表性的參考基因組，62個(gè)目至少有1個(gè)參考基因組。例如，十字花科目有83個(gè)種的參考基因組，禾本目和唇形目分別有80個(gè)種和67個(gè)種的參考基因組。伴隨著技術(shù)的進(jìn)步和越來越多其他物種的關(guān)注度提升，未來完整的植物基因組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建將成為可能。

4 結(jié)論

獲得香瓜茄高質(zhì)量染色體水平參考基因組，推測(cè)該測(cè)序香瓜茄基因組為高復(fù)雜基因組。香瓜茄與馬鈴薯具有較近的進(jìn)化關(guān)系。