無色桿菌77的基因組構(gòu)成及其趨化和耐藥特性

李霽虹 荊玉玲 馬桂珍 郭榮君 李世東

（1. 江蘇海洋大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，連云港 222005；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193）

土壤中不同生態(tài)位點(diǎn)微生物發(fā)揮著不同功能。菌絲際是真菌與土壤發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)的土壤微域［1］。菌絲際細(xì)菌既影響真菌功能，也影響植物生長［2］。黃瓜枯萎病是我國設(shè)施蔬菜生產(chǎn)中的重要病害，該病害在全國各地幾乎都有發(fā)生，可導(dǎo)致黃瓜減產(chǎn)甚至絕收。該病害的病原菌尖孢鐮刀菌黃瓜?；停‵usarium oxysporum f. sp. cucumerinum，F(xiàn)oc）以腐生方式存活于土壤時(shí)可能為某些細(xì)菌類群提供了生態(tài)位點(diǎn)，并通過與真菌的互作，抑制或促進(jìn)病害的發(fā)生［3］。Sun 等［4］發(fā)現(xiàn)連作后，黃瓜根際土壤中枯萎病菌數(shù)量增加，枯萎病菌菌絲際無色桿菌屬細(xì)菌豐度上升，但是對枯萎病的抑制作用減弱；主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）和置換多元方差分析（permutational multivariate analysis of variance，Permanova）發(fā)現(xiàn)連作、植物生長時(shí)期以及枯萎病菌接種是影響枯萎病菌菌絲際細(xì)菌群落構(gòu)成的驅(qū)動因子，因此推測無色桿菌對根分泌物和真菌分泌物具有趨化和利用特性。深入了解無色桿菌與枯萎病菌的互作對理解連作條件下病害加重原因，尋找新的防控策略具有重要意義。

前人對菌絲際細(xì)菌和真菌之間的互作機(jī)理研究表明，真菌分泌物中碳水化合物、有機(jī)酸、低分子糖類等有機(jī)物質(zhì)［5］為細(xì)菌生長提供了營養(yǎng)，不僅促進(jìn)菌絲際細(xì)菌的生長和代謝活動，還影響菌絲際細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)組成［6］。介導(dǎo)菌絲際細(xì)菌與真菌互作的化合物因真菌種屬不同而有所不同。De Weert等［7］發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌WCS365對番茄枯萎病菌產(chǎn)生的鐮刀菌酸有趨化響應(yīng)，其Che基因突變株在枯萎病菌菌絲上的定殖能力明顯減弱；Haq等［8］發(fā)現(xiàn)草酸是介導(dǎo)細(xì)菌Paraburkholderia terrae 向真菌Lyophyllum sp.和 Trichoderma asperellum菌 絲 趨 化的物質(zhì)；孫寧康等［9］發(fā)現(xiàn)解磷細(xì)菌R. aquatilis對叢枝菌根真菌菌絲分泌物中的有機(jī)酸、氨基酸、核苷酸等物質(zhì)有明顯趨化響應(yīng)。Nazir等［10］發(fā)現(xiàn)細(xì)菌Burkholderia terrae BS001與真菌Lyophyllum sp.共培養(yǎng)時(shí)，Lyophyllum sp.會分泌甘油，且很容易被細(xì)菌BS001利用，但Lyophyllum sp.與大腸桿菌Escherichia coli K12 共培養(yǎng)時(shí)并不產(chǎn)生甘油。有關(guān)無色桿菌在Foc菌絲際的定殖機(jī)理研究尚無報(bào)道。

本研究報(bào)道無色桿菌Achromobacter 77的基因組構(gòu)成，其對根分泌物和真菌分泌物的趨化特性和利用能力以及其耐藥特性，為深入研究細(xì)菌77在Foc菌絲際的定殖機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 無色桿菌77、黃瓜枯萎病菌中等致病力菌株Foc-M7，由本實(shí)驗(yàn)室分離、保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 WA-N培養(yǎng)基：NaCl 5 g，KH2PO41 g，(NH4)2SO40.1 g，瓊脂粉20 g，去離子水定容至1 000 mL，pH 6.7。

0.25% WA-N 培 養(yǎng) 基 ：NaCl 5 g，KH2PO41 g，(NH4)2SO40.1 g，瓊脂粉2.5 g，去離子水定容至1 000 mL，pH 6.7。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨（tryptone）10 g，酵母提取物（yeast extract）5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉 20 g，去離子水定容至1 000 mL。

LB培養(yǎng)液：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，去離子水定容至1 000 mL。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，去離子水定容至1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 將細(xì)菌77接種于LB培養(yǎng)液中，28℃、180 r/min培養(yǎng)14 h，12 000 r/min離心5 min去上清。使用Wizard?基因組DNA純化試劑盒（Promega）提取菌株77的基因組DNA。使用OD260/280=1.8-2.0，DNA總量≥15 μg，濃度大于等于50 ng/μL的高質(zhì)量DNA進(jìn)行建庫測序?；蚪M測序在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.2.2 Illumina 文庫構(gòu)建 將1 μg基因組DNA利用Covaris（M220）對其進(jìn)行片段化，剪切成約400 bp片段的DNA樣本。用NEXTflexTMRapid DNA-Seq試劑盒（Bioo Scientific）進(jìn)行文庫制備。操作步驟：將A&B接頭；篩選掉接頭自連片段；瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段篩選，保留一端是A接頭、一端是B接頭的片段；NaOH變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段；橋式PCR擴(kuò)增。

1.2.3 單分子文庫構(gòu)建 將15 μg基因組DNA利用G-tubes（Covaris，MA）將其處理成約10 kb的片段，根據(jù)PacBio的說明書（Pacific Biosciences，CA）進(jìn)行片段純化，末端補(bǔ)平，兩端分別連接SMRT bell測序接頭。

1.2.4 Illumina 測序 制備的文庫在Illumina HiSeq 10 × 儀器上進(jìn)行雙端測序（2×150 bp）。操作步驟：加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP，每次循環(huán)只加入單種堿基；用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類；將“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”化學(xué)切割，恢復(fù)3' 端黏性，繼續(xù)聚合第二個(gè)核苷酸；統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號結(jié)果，獲知模板DNA片段的序列。

1.2.5 PacBio 單分子測序 得到的測序文庫用0.45倍 體 積 的 Agencourt AMPure XP beads（Beckman Coulter Genomics，MA）試劑進(jìn)行3次純化，然后，將文庫單鏈環(huán)退火，結(jié)合到固定的ZMW（zero-mode waveguides，零模波導(dǎo)孔）底部的聚合酶上，加入測序反應(yīng)試劑，每個(gè)堿基配對合成后會發(fā)出相應(yīng)的光并被檢測，每合成一個(gè)堿基即顯示為一個(gè)脈沖峰，配上高分辨率的光學(xué)檢測系統(tǒng)，進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測。

1.2.6 基因組組裝 原始下機(jī)數(shù)據(jù)以fastq格式存儲。為使組裝更加準(zhǔn)確，需對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，去掉測序質(zhì)量較低、含N比例較高及質(zhì)量修剪后長度較小的reads，得到高質(zhì)量的clean data。利用canu（1.8）及HGAP（2.3.0）軟件進(jìn)行PacBio數(shù)據(jù)組裝，將reads組裝成contigs，然后人工成環(huán)，得到完整的染色體和質(zhì)?；蚪M。最后利用Illumina測序數(shù)據(jù)對組裝結(jié)果進(jìn)行校正。

1.2.7 基因注釋與功能預(yù)測 利用PacBio RS II（SMRT）和Illumina平臺（Hiseq 10×）生成的數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，所有分析均在上海美吉生物的I-Sanger云平臺（www.i-sanger.com）上進(jìn)行。利用 Glimmer（3.02）［11］對基因組中的編碼序列（CDS）進(jìn)行預(yù)測；采用GeneMarkS［12］軟件預(yù)測質(zhì)粒；分別采用 tRNA-scan-SE（2.0）［13］和 Barrnap（https：//github.com/tseemann/barrnap）進(jìn)行tRNA和rRNA預(yù)測。利用 BLAST、Diamond［14］、HMMER 等序列比對工具以 及 Swiss-Prot［15］、GO、COG［16］、KEGG［17］數(shù) 據(jù)庫對預(yù)測到的耐藥基因、趨化基因等進(jìn)行蛋白功能注釋，并使用Diamond軟件對分泌系統(tǒng)（KEGG數(shù)據(jù)庫）、碳水化合物活性酶（CAZy數(shù)據(jù)庫，http：//www.cazy.org/）等進(jìn)行分析及分類。

1.2.8 菌株77的趨化特性 采用改良的游動平板法［18］檢驗(yàn)細(xì)菌77對多種已報(bào)道的菌絲分泌物成分的趨化響應(yīng)。具體方法如圖1所示。將邊長13 cm的無菌方型培養(yǎng)皿等分為上下兩部分，作為同處理的兩組平行實(shí)驗(yàn)。A、C兩點(diǎn)之間，B、C兩點(diǎn)之間相距1 cm，A和B位置分別點(diǎn)接1 μL待測化合物（濃度為1 mmol/L）和1 μL無菌水，C位置點(diǎn)接1 μL濃度為1×107CFU/mL的細(xì)菌77菌液，每種化合物做3個(gè)平板的重復(fù)。28℃避光培養(yǎng)12 h后，觀察細(xì)菌趨化圈并使用Epson PerfectionV850 Pro掃描儀進(jìn)行平板掃描拍照。

圖1 細(xì)菌77對真菌分泌物及根分泌物的趨化響應(yīng)示意圖Fig. 1 Demonstration of chemotactic response of strain 77 to fungal and root exudates

待測物質(zhì)包括：（1）真菌分泌物或根分泌物：其中屬于TCA循環(huán)中間物的化合物有［19］：琥珀酸、延胡索酸、α-酮戊二酸、蘋果酸、檸檬酸；糖類：麥芽糖［18］、果糖［20］、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖、海藻糖［21］；氨基酸［20］：精氨酸、苯丙氨酸［22］、脯氨酸、絲氨酸；醇類：甘露醇、肌醇、山梨醇［23］。（2）尖孢鐮刀菌特有分泌物：鐮刀菌酸［24］。（3）根特有分泌物：水楊酸［20］、對羥基苯甲酸、對羥基苯乙酸、苯乙酸。

1.2.9 趨化化合物對菌株77生長的影響 在三角瓶中加入100 mL LB培養(yǎng)液，然后分別加入水楊酸、延胡索酸、α-酮戊二酸、對羥基苯乙酸、蘋果酸、琥珀酸、鐮刀菌酸，使其終濃度為 0、0.5、1、2、4、6、8、10 mmol/L，每處理3重復(fù)。取77菌液（OD600=0.8）60 μL加入到上述培養(yǎng)液中，于180 r/min、28℃培養(yǎng)24 h。從每瓶培養(yǎng)液中取600 μL轉(zhuǎn)移到96孔板中，每孔200 μL，使用酶標(biāo)儀測定樣品的OD600值。通過比較菌株77的生長情況，明確趨化化合物對菌株77生長的影響。

1.2.10 菌株77對抗生素的抗性 采用濾紙片法檢驗(yàn)細(xì)菌77對卡那霉素（氨基糖苷類）、氯霉素（氯霉素類）、氨芐青霉素（β-內(nèi)酰胺類）、四環(huán)素（四環(huán)素類）等常用抗生素的抗性。將細(xì)菌77菌液與LB培養(yǎng)基混合倒板，使培養(yǎng)基中77終濃度為1×107CFU/mL，待凝固。將直徑1 cm濾紙片放入不同濃度抗生素溶液中浸濕，取出后放在無菌培養(yǎng)皿上晾干，然后轉(zhuǎn)移到含菌平板上，每平板放置4個(gè)不同抗生素濃度的濾紙片，28℃過夜培養(yǎng)后觀察抑菌圈大小。

2 結(jié)果

2.1 菌株77基因組組裝結(jié)果

原始測序數(shù)據(jù)經(jīng)過數(shù)據(jù)質(zhì)控過濾和短序列組裝后，得到菌株77的全基因組。菌株77基因組大小為5 868 070 bp，有1條scaffold，包含1條染色體，無質(zhì)粒，GC含量為65.89%（表1）。使用Circos軟件繪制菌株77的基因組圈圖（圖2）。

圖2 菌株77的基因組圈圖Fig. 2 Circle map of the genome of strain 77

表1 菌株77基因組組裝Table 1 Genome assembly of strain 77

2.2 功能注釋

將菌株77的全基因組測序結(jié)果與6大數(shù)據(jù)庫（NR、Swiss-Prot、Pfam、EggNOG、GO 和 KEGG）分別進(jìn)行比對，獲得數(shù)據(jù)庫中的功能注釋信息。對編碼的各種基因進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。并對KEGG、COG、GO注釋結(jié)果進(jìn)行詳細(xì)解讀。

2.2.1 KEGG注釋 菌株77基因組中有2 696個(gè)基因在KEGG數(shù)據(jù)庫被注釋（圖3），被注釋的編碼基因集中于細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程，代謝通路，人類疾病通路，基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄通路，內(nèi)分泌系統(tǒng)、細(xì)胞老化等生物系統(tǒng)通路，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、膜運(yùn)輸?shù)拳h(huán)境信息處理通路，基因個(gè)數(shù)分別為391、1 755、140、187、47、466。在新陳代謝途徑中，有90個(gè)基因與外源物質(zhì)的降解和代謝有關(guān)；有40個(gè)基因與抗菌耐藥有關(guān)，說明菌株77可能對抗生素類物質(zhì)具有耐受能力。

圖3 菌株77基因組的KEGG注釋途徑Fig. 3 KEGG annotated pathways of strain 77’s genome

2.2.2 COG功能注釋 菌株77基因組中有4 862個(gè)基因在COG數(shù)據(jù)庫被注釋，占細(xì)菌77所有基因的88.8%。菌株77的COG功能分為22類，其中預(yù)測最多的基因功能涉及能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、碳水化合物運(yùn)輸和代謝、轉(zhuǎn)錄、無機(jī)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制等（圖4）。

圖4 菌株77基因組的COG功能注釋分類Fig. 4 Annotated classification of COG functions of strain 77’s genome

2.2.3 GO注釋分類統(tǒng)計(jì) 菌株77基因組中共有4 212個(gè)基因在GO數(shù)據(jù)庫中被注釋，占所有基因的76.93%。被注釋的編碼基因集中于細(xì)胞組成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）三大類（圖5）。其中與分子功能相關(guān)的基因最多，達(dá)3 267個(gè)。在細(xì)胞組成中，有大量基因與分解代謝和趨化有關(guān)，這些基因可能參與了菌株77對根分泌物和真菌代謝物的趨化和分解代謝（表2）。

表2 菌株77基因組的GO注釋中分解代謝與趨化相關(guān)基因統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of catabolism and chemotaxis related genes in GO annotation of strain 77’s genome

圖5 菌株77基因組的GO功能注釋分類Fig. 5 Classification of GO functions annotation of strain 77’s genome

2.3 碳水化合物活性酶分析

在細(xì)菌77基因編碼的六大類蛋白質(zhì)家族中，糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyl transferases，GTs）、碳水化合物酯酶（carbohydrate esterases，CEs）、輔助氧化還原酶（auxiliary activities，AAs）、糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GHs） 占 比 分 別 為 35.71%、28.57%、19.05%和15.08%，多糖裂合酶（polysaccharide lyases，PLs）和碳水化合物結(jié)合模塊（carbohydratebinding modules，CBMs）各占 0.79%（圖 6）。糖基轉(zhuǎn)移酶占比最高，該酶是糖基化過程中糖鏈合成的關(guān)鍵酶之一，參與多種基礎(chǔ)生命活動。

圖6 菌株77基因組的碳水化合物活性酶注釋統(tǒng)計(jì)Fig. 6 Statistics of CAZyme annotation of strain 77’s genome

2.4 趨化基因預(yù)測分類

在菌株77基因組中預(yù)測到多種類型的趨化基因（表3），可編碼組成跨膜受體復(fù)合物所必需的多類趨化蛋白，包括：Mcp類、Tar類等甲基趨化受體蛋白、Aer類趨氧性受體蛋白、Che類（CheW、CheA、CheB、CheD、CheR、CheBR）趨化蛋白、Wsp類（WspA、WspB、WspC、WspD、WspF）趨化蛋白、負(fù)責(zé)調(diào)控鞭毛運(yùn)動的鞭毛馬達(dá)蛋白MotA以及功能未知的趨化蛋白。因此推測菌株77對某些物質(zhì)具有趨化作用。

表3 菌株77趨化基因預(yù)測分類Table 3 Predictive classification of chemotactic genes of strain 77

2.5 分泌系統(tǒng)及耐藥基因

對菌株77的分泌系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，與耐藥和趨化相關(guān)的Ⅵ 型分泌系統(tǒng)（type Ⅵ secretion system，T6SS）占有較大比例，其次為在革蘭氏陰性菌中普遍存在的Ⅱ型分泌系統(tǒng)，不含Ⅲ型和Ⅴ型分泌系統(tǒng)（表4）。對菌株77的耐藥基因分析結(jié)果表明，有375個(gè)基因被預(yù)測為耐藥基因，多被注釋為抗生素耐藥性外排泵基因、抗生素耐藥基因簇、多種抗生素抗性基因。預(yù)測分類統(tǒng)計(jì)顯示，細(xì)菌77對大環(huán)內(nèi)酯類、氟喹諾酮類、青霉素類等十大類藥物均有抗性（圖7），推測菌株77可能是一株多重耐藥菌株。

圖7 耐藥基因預(yù)測分類Fig. 7 Predictive classification of drug resistance genes

表4 菌株77分泌系統(tǒng)分類Table 4 Classification in secretion system of strain 77

2.6 菌株77對真菌分泌物及根分泌物的趨化響應(yīng)

分別測試了菌株77對1.2.8中真菌分泌物或根分泌物的趨化響應(yīng)，結(jié)果表明，菌株77對濃度為1 mmol/L的真菌分泌物或根分泌物中的α-酮戊二酸、延胡索酸、琥珀酸、蘋果酸等及根分泌物對羥基苯乙酸、水楊酸（圖8）等都有較明顯的趨化響應(yīng)；對糖類、氨基酸類及醇類則沒有明顯的趨化響應(yīng)。

圖8 菌株77對真菌分泌物及根分泌物成分的趨化響應(yīng)Fig.8 Chemotactic responses of stain 77 to fungal and root exudates

2.7 趨化化合物對菌株77生長的影響

共測定了7種化合物對菌株77生長的影響，結(jié)果表明，所檢測的化合物在低濃度時(shí)與77共培養(yǎng)24 h均可促進(jìn)菌株77的增殖，但各物質(zhì)促進(jìn)菌株77增殖的濃度略有差異。水楊酸在濃度為0.5-2 mmol/L、延胡索酸在濃度為0.5-4 mmol/L時(shí)可促進(jìn)菌株77的生長，在高濃度時(shí)抑制菌株77的增殖；其他5種化合物僅在0.5-1 mmol/L時(shí)促進(jìn)菌株77的生長（表5）。

表5 真菌及根分泌物組分對菌株77 OD600的影響Table 5 Effects of fungal and root exudate components on OD600 value of strain 77

2.8 菌株77對常見抗生素的抗性

藥敏試驗(yàn)表明，菌株77對卡那霉素、氯霉素和氨芐青霉素（圖9-a-c）均有抗性，最高耐受濃度達(dá)到300 μg/mL；對濃度高于50 μg/mL的四環(huán)素（圖9-d）敏感。表明菌株77對多種抗生素有較高的耐受能力。

圖9 菌株77對常見抗生素的抗性Fig. 9 Resistances of strain 77 to common antibiotics

3 討論

菌絲際細(xì)菌指存在于真菌菌絲周圍的細(xì)菌。菌絲際細(xì)菌不僅影響真菌的生長，對植物也有一定影響［25-26］。深入揭示菌絲際細(xì)菌-真菌-植物之間的相互關(guān)系，對通過微生態(tài)調(diào)控促進(jìn)植物生長具有重要意義。目前國內(nèi)外學(xué)者主要從生理學(xué)和生態(tài)學(xué)角度研究菌絲際細(xì)菌與真菌的關(guān)系［27］，認(rèn)為真菌分泌物是影響菌絲際細(xì)菌種群構(gòu)成的重要因素，但影響細(xì)菌向真菌趨化或在菌絲際定殖的真菌分泌物因真菌種屬不同而異［7，28］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)無色桿菌77受到黃瓜連作和枯萎病菌侵染的影響［4］，由于菌絲際細(xì)菌是采用枯萎病菌菌絲從根際土壤細(xì)菌懸浮液中誘集獲得，因此推測菌絲際細(xì)菌除受到真菌分泌物影響外，也受到植物根分泌物的影響。本研究通過基因組解析和生物學(xué)功能研究，初步證明了根分泌物和真菌分泌物是影響菌株77高豐度存在于枯萎病菌菌絲際的重要原因，為深入理解土壤中菌絲際細(xì)菌與真菌和植物的關(guān)系提供了新的線索。

通過基因組分析預(yù)測基因的功能已成為常用的技術(shù)手段。對菌株77的基因組分析發(fā)現(xiàn)其基因組中含有完整的趨化基因，包括原核生物中重要趨化基因簇mcp、che等［29］；趨化作用檢測表明菌株77對真菌分泌物中的有機(jī)酸類化合物具有趨化作用，但對鐮刀菌酸、苯丙氨酸、絲氨酸等氨基酸及鼠李糖、甘露糖、甘露醇等真菌分泌物［30］并無明顯趨化響應(yīng)，而低濃度有機(jī)酸和鐮刀菌酸可以促進(jìn)菌株77的增殖。該結(jié)果與孫寧康等［9］對菌根真菌菌絲際細(xì)菌的趨化作用研究結(jié)果部分相同，但與De Weert等［7］、Haq 等［8］、Palmieri等［31］研究結(jié)果不同。造成差異的原因可能有兩個(gè)方面：（1）本研究與他人研究中的研究對象不同，即細(xì)菌和真菌不同，不同真菌產(chǎn)生的分泌物不同可能造成趨化作用的差異；（2）所采用的趨化研究方法不同。前人研究中所采用的游動平板法［7-8］、微流體芯片方法［9］、毛細(xì)管法［31］等均需要細(xì)菌與所檢測的真菌分泌物或趨化物接觸，而本研究所使用的趨化作用測定方法中細(xì)菌與真菌相距1 cm，并未接觸，因而可能僅能檢測到有機(jī)酸等強(qiáng)趨化作用物質(zhì)，鐮刀菌酸和其它真菌分泌物是否在接觸后才表現(xiàn)趨化作用尚需進(jìn)一步研究。

根分泌物是影響細(xì)菌在植物根際定殖的重要因素。有關(guān)根際細(xì)菌對根分泌物的趨化作用研究已有較多研究報(bào)道。Yuan等［32］研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌對含有機(jī)酸的根系分泌物具有明顯的趨化響應(yīng)，其中對蘋果酸的趨化作用最明顯，延胡索酸還能促進(jìn)芽孢桿菌生物膜的形成。Feng 等［20］使用微流控芯片設(shè)備檢驗(yàn)解淀粉芽孢桿菌SQR9對黃瓜根系分泌物的趨化響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)SQR9對包括氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸等）、有機(jī)酸（蘋果酸、檸檬酸、延胡索酸等）和10種其他物質(zhì)（甘露糖、海藻糖等）在內(nèi)的44種物質(zhì)都具有明顯趨化作用。De Weert等［7］發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌WCS365在番茄根際定殖所需的第一步是該菌對番茄根分泌物的趨化，其中蘋果酸和檸檬酸是最重要的趨化物。本研究發(fā)現(xiàn)菌絲際細(xì)菌77不僅對黃瓜根分泌物中的有機(jī)酸具有趨化和利用特性，對水楊酸、對羥基苯乙酸［21］等根分泌物也有明顯的趨化和利用特性，低濃度的趨化物還促進(jìn)菌株77的增殖。該結(jié)果說明無色桿菌77對植物根分泌物的趨化和利用是連作后無色桿菌屬細(xì)菌在枯萎病菌菌絲際豐度上升的原因之一。

土壤中存在著很多細(xì)菌、放線菌和真菌，如青霉菌、放線菌可產(chǎn)生多種抗生素類物質(zhì)拮抗其他微生物，具有耐藥特性的微生物則為其自身生存創(chuàng)造了條件［33］。菌株77基因組中存在多個(gè)Ⅵ型分泌系統(tǒng)以及多種耐藥基因如hcp、mac、pmr等，可能是菌株77抵御土壤中其它細(xì)菌和真菌而能存活的另一個(gè)重要原因。目前僅發(fā)現(xiàn)菌株77可利用低濃度的鐮刀菌酸促進(jìn)其自身增殖，是否通過耐受枯萎病菌產(chǎn)生的其它殺菌物質(zhì)而增強(qiáng)其在菌絲際存活的幾率，尚需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，無色桿菌77基因組中存在大量與趨化、耐藥等相關(guān)的基因，可能與其高豐度存活于枯萎病菌菌絲際有關(guān)，未來通過基因敲除和功能驗(yàn)證等技術(shù)手段可進(jìn)一步深入了解無色桿菌77在枯萎病菌菌絲際的定殖機(jī)理。

4 結(jié)論

本研究對無色桿菌菌株77的基因組測序分析和功能注釋發(fā)現(xiàn)其基因組中含有多種耐藥基因和完整的趨化基因。該菌株對多種抗生素具有抗性，是一株抗生素耐藥菌株。菌株77對根分泌物和真菌分泌物中多種有機(jī)酸、對根分泌物中的水楊酸和對羥基苯乙酸具有趨化作用；低濃度上述趨化物和鐮刀菌酸可促進(jìn)菌株77增殖。無色桿菌77對菌絲分泌物及植物根分泌物的趨化和利用是連作后無色桿菌屬細(xì)菌在枯萎病菌菌絲際豐度上升的重要原因。