不同施肥處理農田土壤中噬菌體與細菌攜帶抗生素抗性基因的比較

胡雪瑩 張越 郭雅杰 仇天雷 高敏 孫興濱 王旭明

（1. 東北林業(yè)大學林學院， 哈爾濱150040；2. 北京市農林科學院生物技術研究所 農業(yè)基因資源與生物技術北京市重點實驗室，北京 100097）

抗生素廣泛使用導致的細菌耐藥問題已對全球公共衛(wèi)生構成了重大威脅?？股啬退幘鷶y帶的抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes，ARGs）被認為是一種新型的環(huán)境污染物［1］，引起國內外的廣泛關注。土壤是自然環(huán)境中ARGs的最大儲存庫［2］。很多土壤微生物具有內在的抗生素抗性［3］，而人類活動如糞肥施用、再生水灌溉等，使土壤ARGs的多樣性和豐度顯著增加［4-5］。土壤ARGs可通過接合、轉化和轉導作用進行水平轉移［6］，使抗生素抗性在土壤微生物間擴散傳播。其中，質粒等可移動遺傳元件（mobile genetic elements，MGEs）介導的接合作用被認為是細菌ARGs水平轉移的主要方式［7-8］。盡管噬菌體介導的轉導作用可以轉移供體細胞內的任何DNA片段（包括質粒DNA）給受體細胞，但是噬菌體與抗生素抗性之間的關系一直未得到重視和深入研究［2］。這在一定程度上限制了人們對土壤微生物抗生素抗性的全面認知，以及對耐藥細菌快速進化機制的詳細了解。

噬菌體是地球上豐度最高的生物體，其數(shù)量約為1031-1033，是細菌的10倍［9］。最近的研究表明，河水、土壤、污水、畜禽糞便等環(huán)境噬菌體基因組中都存在ARGs［10-13］。農田土壤中種類豐富、數(shù)量巨大的細菌和噬菌體為它們的相互作用以及基因轉移提供了物質基礎。由于噬菌體能通過轉導作用轉移ARGs，因此噬菌體DNA中ARGs的風險可能比細菌中的更大［14］。盡管土壤噬菌體中ARGs的存在已被證實，但對其多樣性和豐度的認識還不夠全面，不同肥料長期施用對土壤噬菌體中ARGs的影響也鮮有研究報道。本文以北京某蔬菜基地長期施用化肥和有機肥的土壤為研究對象，采用微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）絕對定量檢測方法，初步探討土壤噬菌體攜帶ARGs的多樣性與豐度，揭示化肥和有機肥施用對土壤噬菌體中ARGs的影響差異，并與土壤細菌中的ARGs進行對比分析，旨在為評估噬菌體對土壤抗生素抗性的貢獻奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇位于北京大興區(qū)某蔬菜基地（39°66'N，116°57'E）的溫室，于2020年10月采集土壤樣品。該溫室面積488 m2（61 m×8 m），于2009年開始采用3種不同的施肥處理方式：不施肥（CK）、單施化肥（IF）、單施有機肥（OF）。每個處理設置3個小區(qū)，各處理之間設50 cm隔斷，以避免干擾。每年種植2茬蔬菜，上半年種植茄子，下半年種植甜椒，在每茬蔬菜種植前進行1次施肥，每次施肥量如表1所示。采樣時地表種植作物為甜椒，選用五點采樣法采集每種處理中3個小區(qū)的表層土壤（0-20 cm）作為3個重復。所有樣品用冰袋覆蓋運輸，當日到達實驗室后過2 mm篩，均勻分成兩份，一份用于理化性質測定，另一份保存于-80℃冰箱中，用于后續(xù)DNA提取。

表1 不同施肥處理的施肥量Table 1 Fertilizer amount of different treatments

1.2 方法

1.2.1 土壤理化性質的測定 對3種不同施肥處理農田土壤中的重金屬元素（As、Hg、Cu、Cr、Cd、Pb、Zn）、酸堿度（pH）、有機質（OM）、有效磷（AP）、有效鉀（AK）、總氮（TN）進行測定。重金屬As、Hg用硝酸-鹽酸消解后用原子熒光光譜法測定，Cu、Cr、Cd、Pb、Zn用硝酸-鹽酸消解后用火焰原子吸收光譜法和石墨爐原子吸收光譜法測定。在土水比為1∶2.5的條件下，用pH計測定土壤pH。采用重鉻酸鹽氧化法測定土壤OM，碳酸氫鈉法測定AP，醋酸銨萃取-火焰光度法測定AK，凱氏定氮法測定TN。

1.2.2 土壤細菌DNA和噬菌體DNA的提取 將20 g土壤樣品和20 mL PBS緩沖液1∶1混合，加入50 mL無菌離心管中，加入絲裂霉素C至終濃度1 μg/mL［15］?；旌弦河?30-50 r/min 下 28℃過夜培養(yǎng)，渦旋1 h后于4℃ 3 000×g離心10 min，保留上清液，將土樣重新懸浮，重復3次。收集好的上清液依次經 5 μm、0.45 μm 及 0.22 μm 孔徑 PES濾膜過濾以去除土樣中的細菌［16］。將濾膜截留的細菌用試劑盒（FastDNA SPIN Kit For Soil，美國）提取DNA，按照說明書要求進行操作；獲得的含噬菌體的濾液，用100 kD超濾管（Millipore，美國）超濾濃縮至1 mL，加入DNase I和RNase A至終濃度為100 U/mL［12］，37℃ 孵 育 2 h， 加 入 EDTA（0.5 mol/L，pH=8.0）至終濃度20 mmol/L，65℃加熱5 min，用試劑盒（TIANGEN，TIANamp Virus DNA/RNA Kit，中國）提取噬菌體DNA。用16S rRNA通用引物對每個噬菌體DNA提取物進行PCR檢測，超純水作為陰性對照，保留結果為陰性（即不含細菌DNA）的噬菌體DNA樣本，再用Qubit 3.0檢測DNA濃度，以便后續(xù)分析。

1.2.3 ARGs及MGEs的ddPCR定量檢測 采用ddPCR對細菌DNA和噬菌體DNA中ARGs和MGEs進行定量檢測。本研究中，選擇了氨基糖苷、β-內酰胺、大環(huán)內酯-林肯酰胺-鏈陽性菌素B（MLSB）類等9大類共25種ARGs亞型和1種常見的MGE（I類整合子，intl1）進行分析（表2）。ddPCR是在水-油系統(tǒng)中將含有核酸分子的反應體系形成數(shù)萬個獨立的納升級微滴，經PCR擴增后，對微滴中核酸靶分子進行檢測來實現(xiàn)絕對定量。ddPCR反應體系為 20 μL：QX200 ddPCR EvaGreen Supermix（美國，Bio-Rad）10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 0.2 μL，ddH2O 8.6 μL，模板 1 μL。反應程序為 95℃預變性10 min，95℃變性30 s，退火30 s（各引物序列和退火溫度見表2），72℃延伸30 s，40 個循環(huán)后于4℃保存，升溫速率2.5℃/s。每個樣品測定3個技術重復。ARGs和intl1拷貝數(shù)（copies/g）=檢測得到的拷貝數(shù)（copies/μL）×體系（20 μL）×DNA稀釋倍數(shù)×DNA洗脫體積（μL）/DNA提取的樣品質量（g）。

表2 ARGs及I類整合子intl1 PCR引物信息Table 2 PCR primer information of ARGs and class I integrase gene（intl1）

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 檢測數(shù)據(jù)經Excel進行初步計算整理，采用IBM SPSS 24.0軟件進行單因素方差分析和相關性分析，在P＜0.05時確定統(tǒng)計顯著性。利用Origin 2021軟件進行直方圖與擬合曲線的繪制。采用R 3.6.1進行環(huán)境因子與ARGs關系的冗余分析（redundancy analysis，RDA）。

2 結果

2.1 不同施肥處理農田土壤噬菌體與細菌中ARGs的多樣性

對3種施肥處理的土壤樣品中噬菌體和細菌攜帶ARGs和intl1進行檢測，結果如表3所示?？傮w上看，土壤細菌DNA中共檢出23種ARGs亞型，噬菌體DNA中共檢出20種。所有土壤細菌和噬菌體樣品均未檢出的ARGs有2種：β-內酰胺類抗性基因blaOXA-20和喹諾酮類抗性基因qnrA。同時發(fā)現(xiàn)，所有在噬菌體中檢測到的ARGs都能在細菌中檢出，二者均檢出了intl1。細菌攜帶的ARGs在IF和OF中檢出率最高，均為92%；在CK中，還有β-內酰胺類抗性基因blaCTX-M未被檢測出，ARGs檢出率為88%。對于所有處理的土壤噬菌體，除了未檢出以上目標基因之外，也沒有發(fā)現(xiàn)MLSB類抗性基因ermA、ermB和磺胺類抗性基因sul1。此外，CK處理未檢測出strA、blaCTX-M、qnrS，ARGs檢出率為68%；IF處理未檢測出blaCTX-M和mcr-1，ARGs檢出率為72%；OF處理還未檢測出qnrS，ARGs檢出率為76%。以上結果表明，土壤細菌DNA中ARGs的多樣性普遍高于噬菌體DNA；有機肥施用不但能增加土壤細菌中ARGs的多樣性，也能增加土壤噬菌體中ARGs的多樣性。

2.2 不同施肥處理農田土壤噬菌體與細菌中ARGs的豐度水平

對不同施肥處理農田土壤（CK、IF、OF）中噬菌體和細菌攜帶ARGs的豐度水平進行分析。結果表明，土壤噬菌體中ARGs的總豐度在（5.92×102）-（1.55×103）copies/g之間（圖1-B），占據(jù)顯著優(yōu)勢的是多耐藥類抗性基因，其豐度在（2.52×102）-（1.15×103）copies/g之間，MLSB類和β-內酰胺類抗性基因的豐度相對其它類型抗性基因也處于比較高的水平。方差分析（ANOVA）表明，噬菌體攜帶ARGs的總豐度在OF處理中要顯著高于CK和IF（P＜0.05），MLSB類和多耐藥類抗性基因豐度也有相似規(guī)律，但萬古霉素類抗性基因豐度在IF處理（1.40×102copies/g）中要顯著高于CK和OF（P＜0.05）。由圖1-D可看出，不同施肥處理農田土壤中噬菌體攜帶intl1的豐度有顯著差異（P＜0.05），在IF處理中顯著低于CK和OF，豐度范圍為（1.89×102）-（7.09×102）copies/g。此外，不同施肥處理土壤細菌中ARGs的總豐度在（1.35×105）-（1.30×106）copies/g之間（圖1-A），比土壤噬菌體中ARGs的總豐度高2-3個數(shù)量級，且在不同施肥處理中具有顯著性差異（P＜0.05）。與土壤細菌中ARGs相似，土壤噬菌體中也是多耐藥類抗性基因的豐度占顯著優(yōu)勢。土壤細菌所攜帶的intl1豐度如圖1-C所示，豐度范圍為（8.05×103）-（3.09×104）copies/g（P＜0.05），比土壤噬菌體中intl1豐度高1-2個數(shù)量級。以上結果表明，土壤噬菌體中的ARGs總豐度和intl1豐度明顯低于土壤細菌，而有機肥施用能顯著提高土壤噬菌體中ARGs的總豐度，但對intl1豐度沒有明顯影響。

圖1 不同施肥處理農田土壤細菌（A、C）和噬菌體（B、D）中ARGs與intl1豐度Fig. 1 Abundances of ARGs and intl1 in bacteria（A，C）and bacteriophages（B，D）in farmland soil under different fertilization treatments

對土壤噬菌體和細菌中不同ARGs亞型在不同施肥處理中的豐度進行對比，結果如圖2所示。土壤噬菌體中多耐藥類抗性基因mexF、emrD，MLSB類抗性基因oleC、mphA-01和β-內酰胺類抗性基因blaTEM的豐度處于較高水平。方差分析（ANOVA）表明，大部分噬菌體攜帶的ARGs亞型豐度在不同施肥處理中的差異不顯著（P＞0.05）。而MLSB類抗性基因mphA-01和多耐藥類抗性基因mepA、mexF豐度在OF處理顯著高于CK和IF（P＜0.05）；MLSB類抗性基因oleC豐度在CK和OF中顯著高于IF（P＜0.05）；多耐藥類抗性基因acrA-05、emrD和萬古霉素類抗性基因vanA的豐度在不同施肥處理中均有顯著性差異（P＜0.05），其中acrA-05和emrD為 OF＞CK＞IF，vanA 為 IF＞OF＞CK。土壤細菌攜帶ARGs亞型豐度的差異整體上看與噬菌體的分布一致，其中多耐藥類抗性基因mexF、emrD和MLSB類抗性基因oleC的豐度較高。與噬菌體中ARGs豐度分布不同的是，土壤細菌中絕大部分ARGs亞型在不同施肥處理中呈現(xiàn)出顯著性差異（P＜0.05）。

對比不同施肥處理下土壤噬菌體與細菌中各種ARGs亞型的豐度（圖2），除β-內酰胺類抗性基因blaTEM外，噬菌體攜帶的其他ARGs亞型豐度均顯著低于細菌（P＜0.05），其中MLSB類抗性基因oleC和多耐藥類抗性基因mexF基因豐度相差較大，達到3個數(shù)量級。

圖2 土壤細菌和噬菌體中不同ARGs亞型的豐度Fig. 2 Abundances of ARG subtypes in the bacteria and bacteriophages in farmland soil under different fertilization treatments

2.3 土壤噬菌體與細菌攜帶ARGs的相關性

分別對不同施肥處理土壤噬菌體與細菌中ARGs亞型的豐度進行相關性分析（圖3）。結果表明，在3個不同處理中，噬菌體與細菌攜帶的ARGs豐度之間均存在顯著正相關性（P＜0.001），其中CK中二者相關性最強（RCK2=0.665），其次為IF處理組（RIF2=0.612），而OF處理組中二者的相關系數(shù)最?。≧OF2=0.409）。

圖3 不同施肥處理土壤噬菌體與細菌中ARGs豐度的相關性（A：CK；B：IF；C：OF）Fig. 3 Correlation of the abundances of ARGs between bacteria and bacteriophages fractions in farmland soil under different fertilization treatments（A：CK；B：IF；C：OF）

2.4 土壤理化性質與噬菌體和細菌攜帶ARGs的相關性

分別對不同施肥處理下噬菌體和細菌ARGs與土壤理化性質進行冗余分析（圖4）。結果表明，ARGs在CK、IF、OF處理中與7種重金屬元素（As、Hg、Cu、Cr、Cd、Pb、Zn）和5種其他理化因子（pH、OM、AP、AK、TN）顯著相關（P ＜ 0.05）。圖4-A的結果顯示，重金屬元素對細菌ARGs分布的影響在第一軸和第二軸的解釋量分別為74.87%和21.38%。pH和營養(yǎng)因子對細菌ARGs分布的影響在第一軸和第二軸的解釋量分別為74.69%和21.26%（圖4-B）。在所選擇的因子中，Zn、Cr、Cu、OM、TN與細菌ARGs的相關性最大。其中Cu、Zn、OM、AP、AK、TN主要影響OF處理的土壤細菌ARGs分布；As、Hg、Cr、AP、AK主要影響IF處理的土壤細菌ARGs分布；pH主要影響CK的細菌ARGs分布。

重金屬對噬菌體ARGs分布的影響在第一軸和第二軸的解釋量分別為50.38%和24.32%（圖4-C）。pH和營養(yǎng)因子對噬菌體ARGs分布的影響在第一軸和第二軸的解釋量分別為49.58%和24.38%（圖4-D）。在所選擇的因子中，Zn、Cr、Cu、AP、OM與噬菌體ARGs的相關性最大。其中Cu、Zn、OM、AP、AK、TN主要影響OF處理的土壤噬菌體ARGs分布；As、Cr、Pb、AP、AK主要影響 IF處理的土壤噬菌體ARGs分布，pH主要影響CK中噬菌體ARGs分布。不同施肥處理中，所選擇的因子對噬菌體ARGs分布的影響與對細菌的影響差異并不明顯。

圖4 細菌（A、B）與噬菌體（C、D）中ARGs與環(huán)境因子的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis depicting the relationship between ARGs in bacteria（A，B）and bacteriophages（C，D）and environmental factors

綜上所述，環(huán)境因子對施化肥和有機肥土壤中細菌及噬菌體攜帶ARGs的影響較大，對不施肥土壤的ARGs影響較小。因此，施肥可能通過改變土壤pH、重金屬和營養(yǎng)因子水平來影響細菌和噬菌體ARGs的賦存特征。

3 討論

3.1 農田土壤噬菌體與細菌中ARGs的分布特征

土壤是自然環(huán)境中ARGs的最大儲存庫和ARGs向食物鏈傳遞的媒介。研究到現(xiàn)階段，已基本明確土壤ARGs整體上的種類和豐度，ARGs與土壤細菌之間的生物網絡也在逐漸建立，然而對可移動ARGs（可移動抗性組）的認知還很有限，尤其是噬菌體及其介導的轉導作用對土壤抗生素抗性的貢獻還所知甚少［14］。有研究表明，環(huán)境中由噬菌體攜帶的那部分ARGs可能被低估［21-22］。本研究采用ddPCR技術對農田土壤中噬菌體和細菌攜帶的ARGs進行定量檢測，以評估化肥和有機肥施用下土壤噬菌體和細菌攜帶ARGs的多樣性與豐度。研究結果表明，不施肥及化肥和有機肥施用的農田土壤中噬菌體均攜帶多種 ARGs，其豐度達到（5.92×102）-（1.55×103）copies/g。有研究表明，不同作物農田土壤微生物總DNA 中 ARGs豐度范圍在（6.47×109）-（1.41×1010）copies/g 之間［23］。

本研究結果表明，土壤細菌中ARGs的多樣性高于噬菌體，總豐度和絕大多數(shù)ARGs亞型豐度也顯著高于噬菌體。Sun 等［12］的研究表明，溫室蔬菜土壤噬菌體中 ARGs 的豐度比細菌中的低約2個數(shù)量級。Wang等［13］檢測到豬場糞便的細菌DNA中攜帶32種ARGs亞型，而噬菌體DNA中這些ARGs亞型的檢出率僅為35.5%，且豐度顯著低于細菌DNA中相應的ARGs，最大相差約3個數(shù)量級。盡管噬菌體中ARGs的多樣性及豐度均低于細菌，但是噬菌體基因組中的ARGs可通過轉導作用進行水平轉移，因此其危害可能更大。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)土壤噬菌體中一種β-內酰胺類抗性基因blaTEM豐度與細菌中該基因的豐度相當，需要引起重視。在土壤噬菌體中還檢測到較高豐度的整合酶基因intl1［（1.89×102）-（7.09×102）copies/g］。農田土壤噬菌體中檢測到ARGs和整合酶基因的存在，增加了土壤ARGs污染問題的復雜性，說明不僅要繼續(xù)關注細菌所攜帶的ARGs［24-25］，更要關注噬菌體所攜帶的ARGs及其介導的轉導作用對ARGs水平轉移的貢獻［26-27］。

本研究在農田土壤噬菌體中檢出豐度較高的為多耐藥類抗性基因mexF、emrD，MLSB類抗性基因oleC、mphA-01和β-內酰胺類抗性基因blaTEM。Larra?aga等［11］在鮮切蔬菜和農田土壤噬菌體中檢測到較高豐度的blaTEM和較低豐度的qnrA、qnrS。Sun等［12］在溫室土壤噬菌體中檢測到四環(huán)素類抗性基因tetM、tetX。Anand等［28］在不同動物養(yǎng)殖場的土壤噬菌體中檢測到blaTEM、tetA、tetW，其中blaTEM豐度較高。以上不同類型的土壤樣本研究結果與本文結果大致相同，但本研究發(fā)現(xiàn)土壤噬菌體攜帶高豐度的多耐藥類抗性基因和MLSB類抗性基因，這在以往的研究并不多見，未來還需要對土壤噬菌體中這兩類ARGs進行詳細研究。

3.2 施肥對農田土壤噬菌體和細菌中ARGs的影響

Ross等［29］研究了施用牛糞的土壤中噬菌體攜帶 5種 ARGs（strA，strB，sul1，aadA，blaOXA-20）的豐度特征，發(fā)現(xiàn)ARGs豐度變化不大。而本文研究結果顯示，施用有機肥會顯著提高土壤噬菌體攜帶ARGs的總豐度。這可能是與前者檢測的ARGs種類較少及施用的肥料不同有關。在其他環(huán)境樣品噬菌體中也檢測到ARGs的存在。Yang等［30］在雞糞噬菌體中檢測到blaCTX-M、ermB、mcr-1、qnrS、sul1、sul2、vanA、tetM和整合酶基因intl1，其中sul1和ermB豐度較高。Brown-Jaque等［31］從健康人群糞便樣本分離出的噬菌體中檢測到blaTEM、qnrA、qnrS、sul1，其中blaTEM豐度較高。Yang等［10］從四川某河水噬菌體中檢測到了sul1、sul2、blaCTX-M和整合酶基因intl1，其中sul1檢出率最高。Calero-Cáceres等［32］從未經處理的城市廢水噬菌體中檢測出blaTEM、blaCTX-M、sul1。以上研究結果中抗性基因sul1、qnrA和ermB的檢出與本研究結果不一致，表明不同的環(huán)境介質可能對噬菌體攜帶的ARGs亞型有一定的影響。施用有機肥雖然能使土壤細菌和噬菌體中ARGs的總豐度都得到顯著提高，但對不同ARGs亞型影響并不一致：有機肥施用能使土壤細菌中大多數(shù)ARGs亞型豐度顯著提高，而土壤噬菌體中只有少數(shù)ARGs亞型的豐度顯著提高。含有抗生素和耐藥菌的有機肥長期施用，不但能向土壤輸入外源的ARGs，而且抗生素的選擇壓會使土著菌的耐藥性增加，引起土壤細菌中大多數(shù)ARGs亞型豐度提高［2］。而噬菌體是一種細菌病毒，可通過轉導方式促進細菌間的基因水平轉移。噬菌體在轉導過程中，因為“錯裝”宿主細菌ARGs的頻率通常很低（10-9-10-7）［14］，所以有機肥施用對噬菌體基因組中ARGs的影響可能遠低于細菌。

此外，對不同施肥處理中噬菌體與細菌攜帶ARGs亞型的豐度進行相關性分析發(fā)現(xiàn)，均存在顯著正相關。Yang等［33］研究發(fā)現(xiàn)豬場污水處理廠中噬菌體和細菌所攜帶ARGs的豐度呈現(xiàn)顯著正相關（P＜0.000 1，R2=0.678 7），這與本文結果一致。對土壤理化性質與ARGs分布進行冗余分析發(fā)現(xiàn)，環(huán)境因子與施肥土壤中細菌和噬菌體ARGs賦存均有著密切關系。不施肥土壤細菌和噬菌體ARGs主要受pH影響；施化肥土壤細菌和噬菌體ARGs主要受As、Cr、AP、AK影響；施有機肥土壤細菌和噬菌體ARGs主要受Cu、Zn、OM、AP、AK、TN影響。Dickinson等［34］研究表明，重金屬（Cu、Zn）污染與抗生素耐藥性可能存在共選擇關系。Zhao等［35］發(fā)現(xiàn)，重金屬（Cu、Cr）和營養(yǎng)因子TN可能會驅動環(huán)境中ARGs的分布和傳播。但是，土壤理化性質對噬菌體攜帶ARGs賦存特征的影響機制還需進一步研究。

由于細菌作為噬菌體的宿主，為噬菌體提供大量營養(yǎng)物質和遺傳物質，因此噬菌體所攜帶的ARGs可能主要來源于細菌［7］。今后可采用宏基因組測序和生物信息學技術全面解析土壤噬菌體基因組中ARGs的多樣性及其驅動機制，并與細菌基因組中ARGs的驅動機制進行對比分析，以擴展對土壤抗生素抗性的全面認知。

4 結論

農田土壤細菌和噬菌體攜帶的ARGs豐度具有顯著正相關性，而且施用有機肥能同時顯著提高土壤細菌基因組和土壤噬菌體基因組中ARGs的總豐度。施肥對土壤噬菌體攜帶的大多數(shù)ARGs亞型的豐度影響不大，但能顯著提高土壤細菌中大多數(shù)ARGs亞型的豐度。