類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血TLR7與Pin1、Th17/Treg相關(guān)性分析

李娟娟 高惠英 張婷婷 尚莉麗 范春雪 康亞亞 羅 靜 李小峰

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種常見的以侵蝕性、對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的慢性、全身性自身免疫性疾病。 雖然其發(fā)病機(jī)制尚不明確,但有研究表明,輔助性T 細(xì)胞17(T-helper 17 cell,Th17)和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)失衡可能是RA 最直接、最重要的發(fā)病要素。 尤其,Treg細(xì)胞減少或功能異常導(dǎo)致免疫耐受缺陷可能是RA發(fā)病的關(guān)鍵因素之一[1]。 然而,導(dǎo)致Treg 細(xì)胞減少或Treg/Th17 平衡失調(diào)的始動(dòng)因素尚不明確。

TLR7 樣受體(Toll-like receptor 7,TLR7)是一種模式識(shí)別受體,可識(shí)別相應(yīng)配體,從而激活TLR 信號(hào)通路,導(dǎo)致各種促炎介質(zhì)的產(chǎn)生[2]。 其可通過調(diào)節(jié)Th17 和Treg,而參與多種自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展[2,3]。 Pin1 (peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1)是一種肽脯氨?；樂串悩?gòu)酶,其主要作用可介導(dǎo)并上調(diào)TLRs 信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)及活性,還可以增強(qiáng)NF-κB 的活性,從而促進(jìn)疾病的發(fā)展[4]。 既往研究發(fā)現(xiàn),RA 患者外周血Pin1 過表達(dá),Th17 增高而Treg 降低[5]。 那么,RA 患者外周血中TLR7 表達(dá)與Pin1 表達(dá)相關(guān)性如何,又與Th17/Treg細(xì)胞是否具有相關(guān)性,尚未見報(bào)道。 本研究旨在通過檢測(cè)RA 患者外周血TLR7 和Pin1 含量,分析TLR7與Pin1、Th17/Treg、部分細(xì)胞因子及疾病活動(dòng)度的相關(guān)性,進(jìn)一步探索RA 發(fā)病機(jī)制。

資料與方法

1.一般資料：選取2020年5月～2021年3月山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科住院部及門診確診的RA 患者92 例作為RA 組,其中男性25 例,患者平均年齡為60 ±8 歲,女性67 例,患者平均年齡為55 ±10 歲。 所有患者符合1987年ACR 修訂的RA 分類標(biāo)準(zhǔn),并排除其他關(guān)節(jié)炎、重疊其他風(fēng)濕病、有嚴(yán)重感染、合并惡性腫瘤及其他嚴(yán)重心腦血管疾病者。 RA組又分為初發(fā)組和治療組,其中初發(fā)組46 例(指確診入組時(shí)尚未使用藥物),治療組46 例(指確診入組時(shí)已使用藥物,包括非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素和DMARDS 藥物,其中糖皮質(zhì)激素為小劑量醋酸潑尼松每日10mg 及以下,DMARDS 藥物主要有甲氨蝶呤或來氟米特、聯(lián)合羥氯喹或短期的生物制劑治療,且治療時(shí)間為3 ～6 個(gè)月)。 選擇同期筆者醫(yī)院的健康體檢者40 例作為健康對(duì)照組。 本研究所有患者均簽署知情同意書,并通過筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審批[倫理審批號(hào)：(2017)KY 第(004)號(hào)]。

2.試劑和檢測(cè)方法：TLR7 與Pin1 試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。 采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunos orbent assay,ELISA)檢測(cè)TLR7 與Pin1。 經(jīng)前臂肘窩處取外周靜脈血5ml 于肝素抗凝管中,顛倒混勻。 血清于1.5ml EP 管中,室溫靜置30min,6000r/min 離心15min 吸取上清液。 嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。 紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C 反應(yīng)蛋白由山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科完成。 Th17、Treg 及部分細(xì)胞因子,由山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科實(shí)驗(yàn)室完成。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)[M(Q1,Q3)]表示。 組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)或Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。 變量間的相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman及多元線性回歸分析,以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.TLR7 活性表達(dá)在RA 各組和健康對(duì)照組的比較：與健康對(duì)照組比較,RA 組外周血的TLR7 表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組(z=-2.53,P＜0.05);RA初發(fā)組明顯高于健康對(duì)照組(P＜0.05),但與治療組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),詳見圖1。

圖1 TLR7 在RA 各組和健康對(duì)照組外周血活性表達(dá)

2.RA 組中TLR7 活性表達(dá)與病情活動(dòng)度等指標(biāo)相關(guān)性分析：Spearman相關(guān)分析顯示RA 組TLR7 與CRP、受累關(guān)節(jié)數(shù)、DAS28 評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.255,P＜0.05;r=0.247,P＜0.05;r=0.226,P＜0.05),而與病程、紅細(xì)胞沉降率則無明顯相關(guān)性 (r=0.007,P＞0.05;r=0.167,P＞0.05),詳見表1。

表1 RA 組臨床指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)學(xué)描述及TLR7 與其相關(guān)性分析

3.Pin1 活性在RA 各組和健康對(duì)照組外周血表達(dá)的比較：與健康對(duì)照組比較,RA 組外周血的Pin1 表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(z=-6.26,P＜0.001); RA 初發(fā)組、RA 治療組的Pin1 活性表達(dá)顯著高于健康對(duì)照組(P均＜0.001),但RA 初發(fā)組與RA 治療組間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

圖2 Pin1 在RA 各組和健康對(duì)照組外周血活性表達(dá)

4.RA 組外周血中TLR7 活性表達(dá)與Pin1 的相關(guān)性分析：將RA 組92 例患者測(cè)定的TLR7 與Pin1 活性表達(dá)量進(jìn)行Spearman秩相關(guān)分析。 結(jié)果發(fā)現(xiàn),TLR7 與Pin1 呈正相關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.206,P＜0.05)。

5.Th17 和Treg 絕對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)在RA 組和健康對(duì)照組絕對(duì)計(jì)數(shù)比較：與健康對(duì)照組比較,RA 組外周血Th17 細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增高(z=-3.53,P＜0.001),而Treg 細(xì)胞計(jì)數(shù)則顯著降低(z=-4.06,P＜0.001)。 而RA 初發(fā)組和RA 用藥組的Th17 細(xì)胞計(jì)數(shù)和Treg 細(xì)胞計(jì)數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05),詳見圖3。

圖3 RA 組和健康對(duì)照組Th17/Treg 比較

6.RA 組外周血中TLR7 活性表達(dá)與Th17 和Treg 的相關(guān)性分析：Spearman相關(guān)分析顯示,RA 組TLR7 與Treg 呈負(fù)相關(guān)(r=-0.239,P＜0.05),而與Th17 雖有正相關(guān)趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.031,P＞0.05),詳見表2。

表2 RA 組TLR7 表達(dá)活性與Th17 和Treg 相關(guān)性分析

7.RA 組外周血中TLR7 活性表達(dá)與部分細(xì)胞因子的相關(guān)性分析：Spearman相關(guān)分析顯示,RA 組TLR7 與IL-6 呈顯著正相關(guān)(r=0.299,P＜0.01),而與IL-10、IL-17、TNF-α 無明顯相關(guān)性(表3)。

表3 RA 組TLR7 活性表達(dá)與細(xì)胞因子相關(guān)性分析

8.RA 組TLR7 活性表達(dá)與Pin1、疾病活動(dòng)度、Treg 及部分細(xì)胞因子多元線性回歸分析：RA 組TLR7活性表達(dá)與Pin1、DAS28 呈顯著正相關(guān)(BPin1=0.013,P= 0.028;BDAS28= 0.239,P= 0.035),而與Treg 呈明顯負(fù)相關(guān)(BTreg=-0.020,P=0.002),詳見表4。

表4 RA 組TLR7 活性表達(dá)與Pin1、疾病活動(dòng)度、Treg 及部分細(xì)胞因子多元線性回歸分析

討 論

RA 是一種常見的以慢性滑膜炎癥為特征的自身免疫性疾病,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,其中,免疫細(xì)胞數(shù)量或功能紊亂參與該病的發(fā)生、發(fā)展,尤以CD4+T 淋巴細(xì)胞最為關(guān)鍵。 CD4+T 亞群種類多樣,其中以Treg 細(xì)胞較為重要,主要因其可通過產(chǎn)生抗炎性細(xì)胞因子,從而具有免疫抑制、維持自身耐受和抑制自身免疫的作用。 Th17 細(xì)胞雖與Treg 細(xì)胞同源,但作用相反,主要發(fā)揮促炎作用。 此外,Th17 細(xì)胞和其他效應(yīng)性T 細(xì)胞的活性也受到Treg 細(xì)胞的抑制[6,7]。 因此,維持Th17/Treg 細(xì)胞的平衡也是保持機(jī)體正常免疫的基礎(chǔ)。

TLR7 激活可導(dǎo)致Treg 細(xì)胞的數(shù)量減少和功能抑制,而增強(qiáng)自身反應(yīng)性Th17 應(yīng)答。 TLR7 還可識(shí)別RA 患者血清和關(guān)節(jié)液中內(nèi)源性的單鏈RNA,當(dāng)其被激活后,通過髓樣細(xì)胞分化因子88 經(jīng)典途徑,引起級(jí)聯(lián)反應(yīng),產(chǎn)生TNF-α、IL-6、干擾素等促炎性細(xì)胞因子以及誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞和Th17 細(xì)胞的分化,從而導(dǎo)致骨破壞和炎性反應(yīng)[8,9]。 還有研究發(fā)現(xiàn),TLR7 在RA 滑膜組織中大量表達(dá),活化的TLR7 可獨(dú)立誘導(dǎo)STAT-3 信號(hào)通路活化核因子-κB 受體活化因子配體(nuclear factor-κB receptor activator ligand,RANKL) 表達(dá), 進(jìn)而刺激破骨細(xì)胞的生成與分化[10,11]。 本研究結(jié)果顯示,TLR7 在RA 患者外周血過表達(dá),且與CRP、受累關(guān)節(jié)數(shù)、DAS28 評(píng)分呈顯著正相關(guān)。 多元線性回歸分析也進(jìn)一步證實(shí),RA 患者TLR7 表達(dá)與DAS28 評(píng)分呈顯著正相關(guān)。 Chamberlain 等[12]研究發(fā)現(xiàn),TLR7 在RA 患者外周血中存在過表達(dá)的現(xiàn)象,且與DAS28 評(píng)分呈正相關(guān)。 這與本研究結(jié)果相符。 另外,還有報(bào)道,TLR7 在原發(fā)性干燥綜合征(primary Sj?gren syndrome, pSS)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等也過表達(dá),且參與了疾病的發(fā)生、發(fā)展[13,14]。表明TLR7 過表達(dá)是RA 等自身免疫性疾病發(fā)病的關(guān)鍵因素之一。

TLR7 和Pin1 可以互相作用,一方面,TLR7 可以激活異構(gòu)酶Pin1,從而啟動(dòng)下游級(jí)聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)干擾素的釋放;另一方面,Pin1 又可上調(diào)TLR7 的活性,刺激破骨細(xì)胞的活化以及金屬蛋白酶和促炎介質(zhì)等的產(chǎn)生,從而導(dǎo)致骨破壞和炎性反應(yīng)[15,16]。 本研究發(fā)現(xiàn),在RA 患者外周血中,Pin1 活性顯著高于健康對(duì)照組,與既往研究結(jié)果一致,且Spearman相關(guān)分析及多元線性回歸分析均證實(shí)Pin1 活性和TLR7 表達(dá)呈明顯正相關(guān)[4]。 表明Pin1-TLR7 途徑激活可能是RA 發(fā)病的原因之一。

本研究發(fā)現(xiàn),RA 患者Th17 細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于健康對(duì)照組,而Treg 細(xì)胞計(jì)數(shù)低于健康對(duì)照組,與既往研究結(jié)果一致,表明Th17 細(xì)胞計(jì)數(shù)增高和Treg 細(xì)胞計(jì)數(shù)減少參與了RA 的進(jìn)展[1,3,17]。 本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),TLR7 與Treg 呈顯著負(fù)相關(guān),而與IL-6 呈顯著正相關(guān),與TNF-α 也有正相關(guān)跡象,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 多元線性研究也發(fā)現(xiàn),TLR7 與Treg 呈顯著負(fù)相關(guān),與IL-6 有正相關(guān)趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這可能受多種因素影響,后期可通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索。 雖然Th17 和Treg 功能相互抑制,但二者分化都需要T 淋巴細(xì)胞受體和TGF-β,且Th17細(xì)胞極化需要額外的IL-6 調(diào)節(jié)[11,18]。 Chamberlain等12]研究發(fā)現(xiàn),TLR 與TNF-α 呈正相關(guān),而且TLR7還可能是TNF-α 反應(yīng)基因,參與了RA 發(fā)病的慢性病程。 Wang 等[19]還研究發(fā)現(xiàn),pSS 外周血和唾液腺中TLR7 和炎癥標(biāo)志物顯著高于健康人,這表明TLR7 信號(hào)在局部和全身性疾病中均發(fā)揮重要作用。因此,Pin1-TLR7 途徑激活及Treg 降低致免疫耐受缺陷可能是RA 發(fā)病的主要原因之一。 本研究發(fā)現(xiàn),RA 初發(fā)組和RA 用藥組中TLR7、Pin1 活性均明顯高于健康對(duì)照組,但在RA 初發(fā)組和RA 用藥組中TLR7、Pin1 活性無明顯差異,這可能與兩組患者均處于疾病活動(dòng)有關(guān)。

綜上所述,RA 患者外周血TLR7 過表達(dá),且與Pin1 過表達(dá)、Treg 降低及疾病活動(dòng)度均相關(guān)。 因此,Pin1-TLR7 途徑激活及Treg 降低致免疫耐受缺陷可能是RA 發(fā)病的主要原因之一。 抑制TLR7,或者抑制Pin1-TLR7 信號(hào)通路,可能是治療RA 和其他自身免疫性疾病的一種有前途的治療策略。 本研究尚存在一些不足之處。 如有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道TLR7 與TNF-α 呈正相關(guān),但在本實(shí)驗(yàn)中雖有正相關(guān)趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 后期筆者將擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步探索二者的關(guān)系,并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn),深入研究RA的發(fā)病機(jī)制。