基于轉錄組測序探討鎖陽提取物對線蟲衰老的影響

胡夢圓,蘇 磊，張昕雨，張雅麗，李玲玲，魯 藝

(北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，北京 100029)

衰老是機體多器官、多組織、全面的漸進性退化過程，是許多慢性病、退行性疾病(阿爾茲海默癥和帕金森病等)和死亡發(fā)生的重要風險因素[1]。隨著社會進步和醫(yī)療水平的不斷提高，人們的壽命明顯延長，老年人口( 60歲及以上)的相對數(shù)量(占總人口的百分比)和絕對數(shù)量(老齡數(shù)值)均呈現(xiàn)明顯的增幅[2]，故抗衰老的研究具有重要的社會意義。目前關于衰老的研究理論主要有自由基衰老理論[3]、線粒體學說[4]、端粒學說[5]、熱量限制學說[6]，其機制仍不明確，尚無有效干預藥物。中藥鎖陽為鎖陽科植物鎖陽的干燥肉質莖,可以補腎陽、益精血、潤腸通便，用于治療腎陽虛衰、精血不足所導致的陽痿、遺精、滑泄、不孕、腰膝酸軟、筋骨無力，也可用于治療由血虛精虧導致的腸燥便秘[7]?，F(xiàn)代科學研究發(fā)現(xiàn)，鎖陽具有抗氧化[8]、保護神經(jīng)系統(tǒng)[9]、調節(jié)激素水平[10]及糖脂代謝[11]等作用，可能具有潛在抗衰老作用。本實驗觀察了鎖陽乙酸乙酯提取物(ECS)對秀麗隱桿線蟲衰老的影響，并結合轉錄組測序技術預測其可能的作用機制，現(xiàn)將結果報道如下。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 野生型秀麗隱桿線蟲由北京中醫(yī)藥大學劉永剛老師課題組惠贈。

1.2實驗藥物及主要試劑 中藥鎖陽(北京同仁堂飲片有限公司)。尿嘧啶缺陷型大腸桿菌(E.coli OP50，北京中醫(yī)藥大學劉永剛老師課題組惠贈)。瓊脂粉、蛋白胨、酵母提取物、二甲基亞砜(DMSO)、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈉、硫酸鎂、氯化鈣、膽固醇、氫氧化鈉、左旋咪唑，北京拜爾迪生物技術有限公司；石油醚、乙酸乙酯、無水乙醇，北京虹湖聯(lián)合化工有限公司。

1.3主要實驗器材 W-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；SPX-100B-Z 微電腦生化培養(yǎng)箱，上海博訊有限實業(yè)有限公司；Leica EZ4W體式顯微鏡，德國徠卡。

1.4實驗方法

1.4.1ECS的制備 鎖陽飲片打粉，60目過篩。中藥粉的質量與70%乙醇1∶10浸泡過夜(200 g粉需要2 L 70%乙醇)。第2天收集濾液，然后加2 L 70%乙醇超聲1 h，收集上清液，加1 L 70%乙醇超聲45 min，收集上清液，加1 L乙醇超聲30 min，收集上清液，加熱旋蒸至無醇味。分別用石油醚和乙酸乙酯按照2∶1的比例萃取濃縮液的乙酸乙酯極性部分。將乙酸乙酯有機層用旋蒸儀減壓濃縮后制成凍干粉備用。ECS提取率為2.36%，雜質<2%，總灰分<12%，符合藥典標準。

1.4.2線蟲的飼養(yǎng)及給藥方法 E.coli OP50在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后，滴加到NGM上，轉入線蟲后22 ℃恒溫飼養(yǎng)。取0.1 g ECS凍干粉溶于100 μL DMSO，配制成1 000 mg/mL母液。將ECS母液與E.coli OP50混合成不同的濃度后，取100 μL滴加到NGM培養(yǎng)基上，室溫培養(yǎng)24 h后用于正式實驗。

1.4.3同步化處理 無菌條件下挑取100條處于產(chǎn)卵期的成蟲，置于鋪有E.coil 的培養(yǎng)基上，待產(chǎn)卵2～4 h后將成蟲全部轉移。將余下的產(chǎn)卵板放置于22 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)線蟲至L4期，使其生長24 h后，作為用于實驗的正式線蟲。

1.4.4急性熱應激實驗

1.4.4.1初篩 實驗分為空白組和ECS 0.1 mg/mL組、ECS 1 mg/mL組、ECS 5 mg/mL組、ECS 10 mg/mL組。將1.4.3同步化處理后的線蟲轉入各組培養(yǎng)基。22 ℃培養(yǎng)24 h后,在35 ℃條件下進行急性熱應激實驗，每板16條，實驗平行重復3次。每2 h從35 ℃培養(yǎng)箱取出統(tǒng)計線蟲的存活數(shù)量，直至所有線蟲全部死亡，計算線蟲平均生存時間和最長生存時間。線蟲死亡標準為顯微鏡下蟲體多次用picker觸碰沒有反應，蟲體完全喪失運動能力。

1.4.4.2復篩 實驗分為空白組和ECS 0.1 mg/mL組、ECS 0.4 mg/mL組、ECS 0.8 mg/mL組。將1.4.3同步化處理后的線蟲轉入各組培養(yǎng)基。22 ℃分別培養(yǎng)24 h、3 d、5 d，在35 ℃條件下進行急性熱應激實驗，每板16條，實驗平行重復3次。判斷標準同1.4.4.1。

1.4.5壽命實驗 將1.4.3同步化處理后的線蟲轉入空白組、ECS 0.1 mg/mL組、ECS 0.4 mg/mL組、ECS 0.8 mg/mL組的NGM培養(yǎng)基上，22 ℃培養(yǎng)，每個濃度3個平行板，每板30條。實驗過程中為防止新生幼蟲影響計數(shù)，前期線蟲每隔24 h更換1次含有相同藥物濃度及E.coli OP50的NGM培養(yǎng)基，待沒有新生幼蟲后，每2～3 d更換1次培養(yǎng)基。初始時間記為第0天，每24 h統(tǒng)計1次線蟲的死亡數(shù)和存活數(shù)，直至所有線蟲死亡。所有個體的平均存活時間計為平均壽命，最長生存時間即最大壽命取每個培養(yǎng)基中最后存活10%個體壽命的平均值。

1.4.6生殖實驗 將同步化L4期的線蟲轉移到空白組、ECS 0.1 mg/mL組、ECS 0.4 mg/mL組、ECS 0.8 mg/mL組的培養(yǎng)基中，每組12個平行培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)基培養(yǎng)1條線蟲，每24 h轉移至新的培養(yǎng)基，直至線蟲產(chǎn)卵期結束。產(chǎn)卵板在22 ℃的恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計子代數(shù)目。每條線蟲所有子代數(shù)目之和記為該線蟲的產(chǎn)卵量。

1.4.7運動能力實驗 將1.4.3同步化處理后的線蟲轉入空白組、ECS 0.1 mg/mL組、ECS 0.4 mg/mL組、ECS 0.8 mg/mL組的培養(yǎng)基中，22 ℃分別培養(yǎng)24 h、3 d、5 d后，測定線蟲的運動能力，每組16條。

1.4.7.1頭部擺動速率測定 將處理后的線蟲放入未添加E.coli OP50的NGM培養(yǎng)基上,經(jīng)過30 s恢復后，記錄線蟲30 s內(nèi)頭部擺動次數(shù)(線蟲頭部相對于身體長軸方向擺到一側記為1次)。

1.4.7.2身體正弦運動速率測定 將處理后的線蟲放入未添加E.coli OP50的NGM培養(yǎng)基上,經(jīng)過30 s恢復后，滴一滴M9緩沖液，記錄線蟲30 s內(nèi)的身體正弦運動次數(shù)(線蟲相對于身體長軸1個波長的移動記為1次身體彎曲)。

1.6轉錄組測序

1.6.1RNA提取與檢測 同步化處理的線蟲培養(yǎng)3 d后，Trizol法提取空白組和ECS 0.4 mg/mL組線蟲組織總RNA，Nanodrop分光光度計檢測RNA純度，電泳法確定RNA質量。

1.6.2測序數(shù)據(jù)處理與分析 對Illumina高通量測序的原始圖像文件進行堿基識別(Base Calling)，并轉化為原始測序序列(Sequenced Reads)，即原始測序序列構成的集合，稱為Raw Data。使用fastp軟件對原始數(shù)據(jù)進行過濾，刪除不滿足分析標準的reads，得到可用于后續(xù)比對、統(tǒng)計以及后續(xù)分析的clean reads。使用Fast QC (http://www.bioinformatics.babraham. ac.uk/ projects/fastqc/)在線工具對樣本的測序數(shù)據(jù)質量進行可視化評估。通過一系列的質量控制篩選，得到高質量的clean data。 使用Hisat2軟件將clean reads與參考基因組序列進行比對，對每個樣品進行單獨組裝，根據(jù)組裝結果對每個樣品進行統(tǒng)計，統(tǒng)計主要包括組裝轉錄本數(shù)目、組裝基因數(shù)目、轉錄本長度等。用StringTie將所有樣品組裝的結果進行合并，得到一個總的轉錄本注釋文件，并引入對應的參考基因組注釋信息。使用StringTie軟件進行基因和轉錄本重構，即組裝。

1.6.3差異基因的篩選 利用limma包進行有生物學重復或配對的差異比較，利用DESeq包進行沒有生物學重復的差異比較。如果項目中既有重復的分組也有單個樣本的分組，則所有分組用DESeq的方法進行差異分析。差異基因篩選標準：|log2FC|≥1且p-Value≤0.05。

1.6.4差異表達基因本位數(shù)據(jù)庫(GO)和Pathway顯著性富集(KEGG)分析 把目標基因集合和背景基因向GO數(shù)據(jù)庫(http://www.geneontology.org/) 的各個條目映射，計算每個條目的基因數(shù)目，利用超幾何分布進行假設檢驗得到富集結果的p-value。以KEGG數(shù)據(jù)庫中的Pathway為單位，應用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比在差異表達基因中顯著性富集的Pathway，得到差異基因顯著富集的 GO功能類群和代謝通路，篩選其中顯著差異表達基因或通路進行重點分析。

2 結 果

2.1急性熱應激實驗 ECS 1 mg/mL組、ECS 5 mg/mL組、ECS 10 mg/mL組線蟲的平均生存時間和最長生存時間均明顯短于空白組(P均<0.05)，分別較空白組縮短21.30%，26.56%，33.17%；ECS 0.1 mg/mL組線蟲的平均生存時間和最長生存時間與空白組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，見圖1及表1。后期急性熱應激實驗顯示，ECS各組平均生存時間與空白組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，見表2。

表1 急性熱應激初篩實驗中空白組和鎖陽乙酸乙酯提取物各組線蟲生存時間比較

表2 急性熱應激復篩實驗中空白組和鎖陽乙酸乙酯提取物各組線蟲生存時間比較

2.2壽命實驗 ECS 0.4 mg/mL組線蟲的平均生存時間明顯長于空白組(P<0.05)，平均壽命延長了14.85%，中位數(shù)壽命延長了2 d；ECS 0.8 mg/mL組線蟲的平均生存時間明顯短于空白組(P<0.05)，平均壽命縮短了19.68%；ECS 0.1 mg/mL組線蟲的平均生存時間與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組最長生存時間差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見圖2及表3。

表3 壽命實驗中空白組和鎖陽乙酸乙酯提取物各組線蟲生存時間比較

2.3生殖實驗 空白組、ECS 0.1 mg/mL組、ECS 0.4 mg/mL組、ECS 0.8 mg/mL組的產(chǎn)卵量分別是(248.91±22.92)個、(251.70±23.59)個、(254.73±12.54)個、(246.64±23.99)個，各組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。

2.4運動能力實驗 培養(yǎng)24 h后，各組線蟲頭部擺動速率和身體正弦運動速率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；培養(yǎng)3 d和5 d后，ECS 0.4 mg/mL組線蟲的頭部擺動速率和身體正弦運動速率均明顯高于空白組(P均<0.05)，且培養(yǎng)5 d提高更加明顯。見圖3。

2.5轉錄組測序結果

2.5.1原始測序結果 空白組和ECS 0.4 mg/mL組樣本的總RNA濃度分別為0.452 μg/μL和0.572μg/μL，RNA總量和質量均滿足測序要求?？瞻捉M和ECS 0.4 mg/mL組的原始序列條數(shù)分別為42 029 064條和42 573 756條，過濾后序列條數(shù)分別為41 435 302條和41 988 044條；過濾后的總堿基數(shù)分別為6 196 151 652個和6 279 488 372個，各占原始數(shù)據(jù)總堿基數(shù)的98.28%和98.33%；過濾后序列條數(shù)中質量值大于20的堿基數(shù)占總堿基數(shù)的比例(Q20)分別為98.39%和98.47%，過濾后序列條數(shù)中質量值大于30的堿基數(shù)占總堿基數(shù)的比例(Q30)分別為94.74%和94.97%。說明測序質量較高，能滿足進行后續(xù)的生信學分析要求。

2.5.2序列比對結果 ECS 0.4 mg/mL組和空白組的序列與參考基因組的比對效率分別為99.06%和98.94%(≥70%)，比對到參考基因組序列多個位置的序列分別為1.99%和1.81%(≤10%)，表明測序質量及序列比對結果較好，可滿足后續(xù)分析需求。見表4。

表4 空白組和ECS 0.4 mg/mL組線蟲組織轉錄組測序序列與參考基因組比對結果 條(%)

2.5.3差異表達基因篩選結果 將空白組與ECS 0.4 mg/mL組的測序數(shù)據(jù)進行比對分析，顯示共有604個基因差異表達，其中313個基因上調表達，291個基因下調表達，上調表達基因數(shù)約為下調表達基因數(shù)的1.07倍，說明攝取ECS之后的線蟲有更多的基因通過上調表達來影響其生命過程。見圖4。

2.5.4差異表達基因的GO功能注釋分析結果 分別從分子功能(Molecular function，MF)、生物學途徑(Biological process，BP)和細胞學組件(Cellular component，CC)3個部分對差異表達基因進行GO注釋，共富集到1 562個條目。GO功能注釋排名前20的條目中，分子功能中差異表達基因富集在4個GO條目，生物學途徑中的差異基因富集在12個GO條目，細胞學組件中的差異基因富集在4個GO條目，共富集到391個基因，見圖5。

2.5.5差異表達基因的KEGG分析結果 對差異表達的基因進行KEGG分析，差異表達的基因富集于166條通路中，共富集到312個差異基因。排名前20的Pathway見圖6和表5，共富集到76個差異基因，22個基因上調，54個基因顯示下調。富集差異性最顯著的通路是線蟲的長壽調節(jié)通路，包括1個超氧化物歧化酶(SOD)基因，1個硬脂酰輔酶A去飽和酶 (SCD)基因,1個褪黑素受體(MT)基因,1個脂肪酶(LIPS)基因,3個熱休克蛋白(HSP)基因。其次長壽調節(jié)通路、溶酶體途徑、脂肪酸代謝通路、MAPK信號通路都具有較多的基因富集(≥5)。

表5 空白組和ECS 0.4 mg/mL組線蟲組織轉錄組測序差異表達基因的KEGG分析TOP 20

3 討 論

秀麗隱桿線蟲是第一個已知完整的基因組序列的多細胞真核生物[12]，其與人類的同源基因有60%～80%[13]，且老年秀麗隱桿線蟲表現(xiàn)出許多與年齡相關的microRNA、應激反應基因以及蛋白質的變化，其遺傳易處理性、壽命短和明顯的年齡依賴性的生理特點，使得它成為衰老研究的一個極具價值的模型[14]。轉錄組測序技術是進行細胞表型和基因功能研究的重要手段，能夠為基因、RNA、蛋白質和其他小分子間的相互作用的機制研究提供更加多維的分析思路[15]。

前期實驗鑒定出，ECS有效部分的化學成分主要有原花青素類(B1、B3、B4、B2、B7、B8、B5、B6)、腺苷、兒茶素、水楊酸、表兒茶素、異槲皮苷、表兒茶素沒食子酸酯、松苷、木犀草苷、南酸棗苷、葉綠香豆素、根皮苷等[16]。研究發(fā)現(xiàn)，原花青素 B2(PCB2)特有的二聚體結構使其具有很強的抗氧化活性[17]，可延長線蟲的壽命[18]。

本實驗結果發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，ECS 0.4 mg/mL組線蟲的平均壽命延長了14.85%，中位數(shù)壽命延長了2 d，而高濃度的ECS則體現(xiàn)出一定的不利作用，或許是其藥物毒性引起，有待進一步探討。運動能力下降是衰老的保守表現(xiàn)[19]，本實驗發(fā)現(xiàn)，ECS0.4 mg/mL組線蟲培養(yǎng)3 d和5 d后的頭部運動能力和身體運動能力均較空白組提高，提示ECS可提高線蟲的運動能力，具有抗衰老作用。生殖能力評價是藥物安全性評價的關鍵環(huán)節(jié)[20]，產(chǎn)卵實驗顯示ECS各組和空白組間產(chǎn)卵量比較差異無統(tǒng)計學意義，說明ECS對線蟲產(chǎn)生的影響并不會犧牲其生殖能力。上述研究結果說明中藥鎖陽具有抗衰老的潛力。

本研究轉錄組測序結果顯示，空白組Q30為94.74%，比對到參考基因組序列的序列效率為98.94%，比對到參考基因組序列唯一位置的序列效率為 98.19%，文獻[21]報道的Q30為93.75%，比對到參考基因組序列的序列效率為96.28%，比對到參考基因組序列唯一位置的序列效率為93.66%，與之比較本研究參考基因組序列匹配度更高。KEGG分析顯示，差異表達的基因富集于166條通路中，共富集到312個差異基因。在顯著性排名前20的通路中，主要涉及長壽調節(jié)、脂代謝、藥物代謝、激素調節(jié)、能量代謝、免疫途徑等。長壽調劑通路是與線蟲壽命直接相關的通路，也是富集到差異表達基因最顯著的通路。其中有5條信號通路與脂代謝直接相關，而脂代謝與衰老及衰老相關疾病的發(fā)生有著重要的聯(lián)系，如脂代謝異?？捎绊懩X衰老進程[22]。卵巢發(fā)育及功能對動物的繁殖能力有重要的影響,而視黃醇在哺乳動物繁殖過程中有著重要的調節(jié)作用，視黃醇代謝通路和GnRH信號通路均可對生殖系統(tǒng)的功能產(chǎn)生重要影響[23-24]。前期實驗發(fā)現(xiàn)，ECS有雌激素樣作用，可提高去卵巢大鼠的學習記憶能力及血清E2水平[25]，但是在產(chǎn)卵實驗中并未發(fā)現(xiàn)明顯差異，ECS對生殖的影響還需進一步探索。外源性物質可影響P450酶對其藥物底物的代謝活性，從而影響藥物的療效和不良反應[26]。細胞色素P450代謝通路和黃曲霉毒素生物合成通路[27]的顯著性富集或可以作為研究高濃度的ECS是否對線蟲的壽命及運動能力產(chǎn)生持續(xù)濃度遞增效應的著手點。

綜上所述，ECS可能通過多途徑多基因共同作用而影響秀麗隱桿線蟲的壽命和運動能力，其有潛在抗衰老作用，但具體的作用機制還需要進一步進行研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。