補(bǔ)中益氣湯對(duì)PTEN/PI3K/Akt/FOXO1通路介導(dǎo)的盆腔臟器脫垂大鼠子宮骶韌帶組織膠原代謝的影響

嚴(yán) 曉，高立群，林 艷，許 嵐，張忻佩，朱小丹，胡佳貞，樊伯珍

(1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，上海 200062；2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203)

盆腔臟器脫垂被定義為陰道前壁、陰道后壁、子宮或陰道頂端(子宮切除后的陰道穹隆)中的1個(gè)或多個(gè)下降并伴有功能障礙或出現(xiàn)不適癥狀，是中老年女性常見(jiàn)的婦科良性疾病[1]，但會(huì)嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量、心理健康，進(jìn)而影響社會(huì)活動(dòng)，故也被稱為“社交癌”。目前西醫(yī)對(duì)早期盆腔臟器脫垂患者通常采用盆底肌肉鍛煉、電刺激、生物反饋等方法治療，但療效有限；對(duì)于晚期患者，通常通過(guò)手術(shù)治療，但仍有部分復(fù)發(fā)、再手術(shù)的可能[2-5]。近年研究表明，中藥補(bǔ)中益氣湯可有效防治盆腔臟器脫垂，特別是聯(lián)合上述西醫(yī)治療時(shí)療效更佳[6-7]，但是其起效機(jī)制仍不明確。盆腔臟器脫垂的發(fā)病機(jī)制也仍有爭(zhēng)議，盆腔臟器依靠一個(gè)復(fù)雜的支持系統(tǒng)維持在正常的解剖位置，這個(gè)支持系統(tǒng)主要包括韌帶和筋膜，而膠原在其中扮演了重要的角色，各種生理病理過(guò)程使膠原含量減少，導(dǎo)致韌帶或筋膜彈性減弱不能對(duì)盆底器官起到應(yīng)有的支撐作用，最終導(dǎo)致盆腔臟器脫垂的發(fā)生是比較一致的共識(shí)[8-10]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路是膠原代謝中重要的信號(hào)通路，盆腔臟器脫垂患者骶韌帶中PI3K/Akt/FOXO1信號(hào)通路被激活，F(xiàn)OXO1通過(guò)下調(diào)抗氧化酶谷胱甘肽過(guò)氧化物酶1(GPX1)、含錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)的表達(dá)激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起Ⅰ型膠原蛋白的破壞[11]。在其他器官中，磷酸酶與張力蛋白同源基因(PTEN)是該通路的負(fù)性調(diào)控因子[12-13]，在盆底疾病中，PTEN的作用尚不明確。基于此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察正常大鼠和盆腔臟器脫垂大鼠子宮骶韌帶組織中PTEN/PI3K/Akt/FOXO1信號(hào)通路相關(guān)因子和膠原蛋白Ⅰ(COL1A1)、膠原蛋白Ⅲ(COL3A1)表達(dá)情況，探討了補(bǔ)中益氣湯防治盆腔臟器脫垂的可能起效機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1動(dòng)物 自然分娩過(guò)3次的SPF級(jí)雌性SD大鼠20只，體重約300 g，同齡同級(jí)別無(wú)生育史雌性SD大鼠10只，均由上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0012。大鼠在上海同濟(jì)生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司飼養(yǎng)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，許可證號(hào)：SYXK(滬)2018-0034，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理編號(hào)：TJHBLAC-2019-026。飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各半循環(huán)照明，濕度50%～60%，溫度21～24℃。

1.2藥物 補(bǔ)中益氣湯，組方：黃芪15 g、人參15 g、白術(shù)9 g、當(dāng)歸9 g、柴胡9 g、升麻6 g、陳皮6 g、炙甘草9 g，飲片來(lái)源于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，經(jīng)煎熬、濃縮等處理制備成含原生藥400 g/L的藥液備用。

1.3主要試劑及儀器 PTEN、Akt、p-Akt、p-FOX1、FOX1、β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology(CST)公司；Mn-SOD抗體、COL1A1和COL3A1抗體購(gòu)自abcam公司；GPX1抗體購(gòu)自absin公司。蛋白裂解液(碧云天公司)；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；PVDF膜、Power-pac基礎(chǔ)型電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、化學(xué)發(fā)光成像儀購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad公司 。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 將10只健康無(wú)生育史雌性SD大鼠作為正常組。取20只自然分娩過(guò)3次的雌性SD大鼠，參考文獻(xiàn)[14]方法制備盆腔臟器脫垂模型：大鼠稱重后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取俯臥位固定，將6F弗萊氏導(dǎo)尿管插入陰道中約3 cm，并往氣囊中注入生理鹽水3 mL撐開(kāi)陰道，用1-0號(hào)絲線將導(dǎo)尿管八字縫合于陰道口，將大鼠固定，取恥骨聯(lián)合位于桌緣使導(dǎo)尿管下垂，給300 g拉力維持4 h后取出。2周后再行上述操作1次，常規(guī)飼養(yǎng)2周后在腹腔麻醉下行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)8周，將造模成功后大鼠隨機(jī)分為模型組和補(bǔ)中益氣湯組各10只。參考前期研究[15]，補(bǔ)中益氣湯組大鼠給予補(bǔ)中益氣湯7 mL/(kg·d)灌胃8周，模型組和正常組大鼠給予等量生理鹽水灌胃8周。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法 末次灌胃結(jié)束后處死各組大鼠，取骶韌帶組織，采用Western blot法檢測(cè)PTEN、p-Akt/Akt、p-FOX1/FOX1、GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1蛋白表達(dá)情況，采用 RT-PCR法檢測(cè)GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1mRNA表達(dá)情況。

1.5.1Western blot檢測(cè)方法 提取子宮骶韌帶組織蛋白，BCA蛋白定量后行蛋白變性，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，BSA封閉后分別行一抗孵育、二抗孵育。于暗室中取出條帶，用吸水紙印干，將按照1∶1比例配置好的顯影液均勻涂于膜上，每個(gè)條帶200 μL。根據(jù)說(shuō)明書(shū)設(shè)置好曝光條件，曝光拍照。以β-actin為內(nèi)參物，Image J軟件分析條帶灰度值進(jìn)行定量分析。

1.5.2RT-PCR檢測(cè)方法 取各組大鼠子宮骶韌帶組織，用Trizol裂解液和RNA抽提試劑盒提取總RNA,測(cè)定總RNA濃度和純度,-80 ℃保存?zhèn)溆?。? μg的總RNA根據(jù)TaKaRa的反轉(zhuǎn)錄試劑盒行cDNA反轉(zhuǎn)錄,按照TaKaRa熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒操作步驟，在實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,共45個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參基因；COL1A1(上游5’-TGGTGAGACGTGGAAACCTG-3’,下游5’-CTTGGGTCCCTCGACTCCTA-3’)、COL3A1(上游5’-GATGAGCCACTAGACTGCCC-3’,下游5’-GTCGCCATTTCTCCCAGGAA-3’)、GPX1(上游5’-CAGTCCACCGTGTATGCCTT-3’，下游5’-CCAGACGCTTCTGCAGATCA-3’)、Mn-SOD(上游 5’-TAAGGGTGGTGGAGAACCCA-3’，下游5’-TTAGAGCAGGCGGCAATCTG-3’)引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。各個(gè)基因的表達(dá)采用2-△△CT方法進(jìn)行定量分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠骶韌帶組織中PTEN、p-Akt/Akt、p-FOX1/FOX1、GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1蛋白表達(dá)情況比較 與正常組比較，模型組大鼠骶韌帶組織中PTEN、GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1蛋白表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05)，p-Akt/Akt、p-FOX1/FOX1蛋白表達(dá)量均明顯增高(P均<0.05)；與模型組比較，補(bǔ)中益氣湯組大鼠骶韌帶組織中PTEN、GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1蛋白表達(dá)量均明顯增高(P均<0.05)，p-Akt/Akt、p-FOX1/FOX1蛋白表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05)。見(jiàn)圖1及表1。

表1 正常組和盆腔臟器脫垂各組大鼠骶韌帶組織中PTEN/PI3K/Akt/FOXO1通路相關(guān)因子蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.2各組大鼠骶韌帶組織中GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1mRNA表達(dá)情況比較 模型組大鼠骶韌帶組織中GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于正常組(P均<0.05)，補(bǔ)中益氣湯組大鼠骶韌帶組織中GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于模型組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 正常組和盆腔臟器脫垂各組大鼠骶韌帶組織中GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

盆腔臟器脫垂是影響老年女性健康的重要疾病，其診斷和治療已日益受到重視。目前，西醫(yī)對(duì)輕度患者以物理治療為主，對(duì)中重度患者以手術(shù)治療為主，但效果不理想。中醫(yī)對(duì)盆腔臟器脫垂的治療積累了不少經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為其病機(jī)可歸納為中氣不足或腎氣不固、濕熱下注, 其中中氣不足、氣虛下陷最為常見(jiàn)。脾為氣血之源，司中氣，脾虛則中氣不足，氣虛下陷，沖任不固，帶脈失約，無(wú)力系胞，因此臨證治療宜補(bǔ)虛、舉陷、固脫[16]。補(bǔ)中益氣湯出自李東垣《內(nèi)外傷辨惑論》，有補(bǔ)中益氣、升陽(yáng)舉陷之功，主治一切中氣不足之證，與盆腔臟器脫垂的病機(jī)相吻合。相關(guān)研究證實(shí),補(bǔ)中益氣湯聯(lián)合生物反饋或盆底功能訓(xùn)練可有效防治盆腔臟器脫垂[17-18]。艾陽(yáng)等[19]研究報(bào)道，補(bǔ)中益氣湯能影響正常骶韌帶成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β3(TGF-β3)、COL1A1、COL3A1 mRNA的表達(dá)，對(duì)盆腔臟器脫垂的治療作用可能與調(diào)節(jié)TGF-β3、COL1A1、COL3A1的表達(dá)有關(guān)。本課題組前期研究提示，補(bǔ)中益氣湯可增加盆腔臟器脫垂大鼠子宮骶韌帶組織中COL1A1、COL3A1 的合成，其作用機(jī)制可能與上調(diào)大鼠子宮骶韌帶組織中TGF-β3和降低微小核糖核酸-30d的表達(dá)水平有關(guān)[15]。但盆腔臟器脫垂的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，補(bǔ)中益氣湯也可能通過(guò)其他作用靶點(diǎn)發(fā)揮作用。

本實(shí)驗(yàn)基于PI3K/Akt/FOXO1通路的研究結(jié)果顯示，模型組大鼠子宮骶韌帶組織中p-Akt/Akt、p-FOX1/FOX1蛋白表達(dá)量較正常組明顯升高，GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1蛋白表達(dá)量及GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1mRNA表達(dá)量較正常組明顯降低。其中Akt為PI3K/Akt信號(hào)通路激活的調(diào)控開(kāi)關(guān)，p-Akt蛋白的高表達(dá)提示該通路被激活，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制膠原蛋白合成。與模型組比較，補(bǔ)中益氣湯組骶韌帶組織中p-Akt/Akt、p-FOX1/FOX1蛋白表達(dá)量明顯降低，GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1蛋白表達(dá)量及GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1mRNA表達(dá)量明顯升高，提示補(bǔ)中益氣湯可能通過(guò)抑制PI3K/Akt/FOXO1通路上調(diào)抗氧化酶GPX1、Mn-SOD的表達(dá)，從而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而影響膠原蛋白的合成而起到治療盆腔臟器脫垂的作用。

第10號(hào)染色體缺失的PTEN不僅在腫瘤及纖維化的病理生理過(guò)程中起到重要作用[20-21]，而且與內(nèi)分泌疾病如糖尿病[22]、免疫系統(tǒng)疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病[23]、脂質(zhì)代謝疾病[24]和神經(jīng)精神類疾病[25-26]的發(fā)生相關(guān)。PTEN通過(guò)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、遷移、代謝和自我更新等，其中PI3K/Akt信號(hào)通路是它調(diào)控的主要途徑，PTEN作為負(fù)性調(diào)控因子，可拮抗PI3K作用，使PI3K作用的底物發(fā)生去磷酸化，PIP3脫磷酸形成PIP2來(lái)阻斷該通路。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠骶韌帶組織中PTEN表達(dá)量降低，而補(bǔ)中益氣湯組明顯升高。推測(cè)在盆腔臟器脫垂疾病中，PTEN同樣作為負(fù)性調(diào)節(jié)因子，調(diào)控PI3K/Akt/FOXO1通路介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，PTEN的下調(diào)解除了對(duì)該通路的抑制作用，該通路激活引起膠原蛋白的破壞而導(dǎo)致盆腔臟器脫垂的發(fā)生，而補(bǔ)中益氣湯能促進(jìn)骶韌帶組織中PTEN的表達(dá)，抑制PI3K/Akt/FOXO1通路激活，從而阻止膠原蛋白的進(jìn)一步破壞，這可能是補(bǔ)中益氣湯對(duì)盆腔臟器脫垂治療起效的機(jī)制之一。

綜上所述，盆腔臟器脫垂大鼠骶韌帶組織中PTEN蛋白表達(dá)上調(diào)，p-Akt/Akt、p-FOXO1/FOXO1被顯著激活，受FOXO1調(diào)節(jié)的抗氧化酶GPX1、Mn-SOD 蛋白和mRNA表達(dá)下調(diào)。補(bǔ)中益氣湯可通過(guò)上調(diào)大鼠子宮骶韌帶組織中PTEN的表達(dá)而抑制PI3K/Akt/FOXO1通路的激活，使抗氧化酶GPX1、Mn-SOD蛋白和mRNA表達(dá)上調(diào)而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)膠原的合成，即補(bǔ)中益氣湯可能通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt/FOXO1通路而發(fā)揮作用，但也不排除其他起效機(jī)制，其治療該類疾病起效的具體作用靶點(diǎn)和機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。