SD大鼠灌胃染毒蓖麻籽的毒代動力學研究及臨床中毒樣品初步檢測

付佳婷，張 瑛，張文鵬，郭 磊，徐 斌，謝劍煒

（1.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京 100850；2.華北理工大學藥學院，河北 唐山 063210；3.北京市公安司法鑒定中心，法庭毒物分析公安部重點實驗室，北京 100192）

蓖麻（Ricinus communis）為大戟科蓖麻屬下的唯一物種，是我國首要油料作物，在我國南北方廣泛種植。蓖麻全株可入藥，有祛濕通絡(luò)、消腫、拔毒等功效；蓖麻種子（蓖麻籽）用于榨取富含甘油三酯的蓖麻油，因其具有黏度高、凝固點低、耐寒、耐高溫等特點，是紡織、冶金、化工、機電等工業(yè)重要原料［1］。但蓖麻又屬有毒植物，其毒性成分主要包括蓖麻毒素蛋白（ricin）、蓖麻凝集素蛋白和小分子化合物蓖麻堿（ricinine）等。蓖麻堿化學名為N-甲基-3-氰基-4-甲氧基-吡喃酮，分子式為C8H8N2O2，相對分子質(zhì)量為164.17，屬劇毒生物堿，主要存在于蓖麻的莖葉和籽實中。小鼠sc給予蓖麻堿的LD50為25 mg·kg-1。過量服食可引起嘔吐、呼吸抑制和腎損害等［2-3］。

鑒于全球范圍內(nèi)蓖麻毒素恐怖活動和蓖麻相關(guān)中毒事件時有發(fā)生，針對蓖麻毒素蛋白的分析檢測方法已有諸多報道。但蓖麻毒素蛋白具有體內(nèi)易降解、檢測時間窗窄（＜8 h）、方法技術(shù)需求高和檢測周期長等問題［4-6］，現(xiàn)有方法仍無法滿足臨床中毒診斷的需求。蓖麻堿與蓖麻毒素蛋白同時存在于蓖麻籽中，誤服蓖麻籽后體內(nèi)蓖麻堿暴露量相對較高，其檢測方法簡便、靈敏，適于生物醫(yī)學樣品的檢測［7-10］，目前已用于蓖麻籽接觸或中毒者生物樣品的檢測。本研究建立一種血漿中蓖麻堿的液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry，LC-QqQ MS/MS）定量分析方法，檢測ig染毒后蓖麻堿在SD大鼠體內(nèi)的毒代動力學參數(shù)，并嘗試將該法用于臨床中毒者血漿和尿液樣本的半定量檢測。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器

蓖麻堿參考品（貨號R495550，批號2-KAS-3，純度大于98%），加拿大TCI公司；氫溴酸東莨菪堿對照品（貨號：100476，批號：100476-180301），中國食品藥品檢定研究院，14個不同產(chǎn)地蓖麻籽分別購于河北、山西、四川等藥材市場；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）和甲酸（質(zhì)譜級），均美國Fisher公司。

SPF級健康雄性SD大鼠，15只，體重180～220 g，由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供（動物合格證號1103241911031288）。實驗前，大鼠飼養(yǎng)于室溫23.5～24.5℃、相對濕度為45%～55%的條件下，明暗各12 h（8∶00～20∶00燈光照明），飼料為嚙齒類普通維持飼料，自由飲食飲水。所有動物實驗遵循軍事醫(yī)學研究院動物實驗倫理委員會規(guī)定。

1200型液相色譜儀和6430型LC-QqQMS/MS系統(tǒng)，配備電噴霧電離源，液相泵、自動進樣器和在線脫氣裝置，美國安捷倫公司；Synergi Polar-PR 100?色譜柱（100 mm×2 mm，2.5 μm），美國飛諾美公司；渦旋振蕩器（Vortex-Genie2），美國Scientific Industries公司；十萬分之一電子分析天平（PL203），美國梅特勒-托利多公司；臺式高速冷凍離心機（3K30），美國Sigma公司；低溫組織破碎儀（SPEX6775），美國SPEX公司；多功能靜音型超聲波清洗機（LMDTC-10F），中國綠綿科技有限公司；真空離心濃縮儀（RCD33），德國Christ公司；超純水（18 MΩ·cm）由Milli-QA10超純水儀制備，美國Millipore公司。

1.2 標準溶液和工作溶液的配制

精密稱取蓖麻堿和氫溴酸東莨菪堿各2.0和2.5 mg，以50%甲醇水溶液配制得到濃度為0.2 g·L-1母液（氫溴酸東莨菪堿按東莨菪堿計）；取蓖麻堿母液，以50%甲醇水溶液逐級稀釋至5000，3750，1000，250，50，10，2，1和0.5 μg·L-1，作為系列標準溶液；取東莨菪堿母液，以50%甲醇水溶液逐級稀釋至500 μg·L-1作為內(nèi)標溶液。

取40 μL正常大鼠血漿，分別加入10 μL蓖麻堿標準溶液和2.5 μL東莨菪堿內(nèi)標溶液，制備成為蓖麻堿血漿濃度為1000，750，200，50，10，2和1 μg·L-1的工作曲線樣品。所有溶液4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 色譜和質(zhì)譜條件

色譜條件：Synergi Polar-PR 100?色譜柱（100 mm×2 mm，2.5 μm），柱溫40℃，進樣體積5 μL。流動相A為含0.1%甲酸水溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序為：0～1 min，15%B；1～5 min，15%～90%B；5.1～7 min，15%B。流速為0.3 mL·min-1。

質(zhì)譜條件：ESI源，正離子方式檢測，源溫350℃，噴霧電壓4 kV，噴霧氣壓力40 psi，氮氣流速10 L·min-1；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；用于分析的離子對分別為：蓖麻堿定量離子對質(zhì)荷比（m/z）165→138（碎裂電壓130 V，毛細管電壓17 V），定性離子對為m/z165→82（碎裂電壓130 V，毛細管電壓29 V）；東莨菪堿（內(nèi)標）定量離子對為m/z304→156（碎裂電壓110 V，毛細管電壓13 V）。

1.4 測定不同產(chǎn)地蓖麻籽中蓖麻堿含量

分別選取14個不同產(chǎn)地蓖麻籽并標號，將種子均勻鋪成3層，每一層隨機取5顆共15顆，進行去殼、稱量，加入研磨鋼珠后用低溫組織破碎儀進行研磨，后加入種子質(zhì)量5倍的超純水，充分渦旋，超聲振蕩10 min，14 000×g離心10 min，取上清液1 mL置于進樣瓶中用于LC-MS/MS定量檢測。

1.5 動物、染毒和血漿樣品處理

結(jié)合已報道蓖麻籽的LD50數(shù)據(jù)［3］，確定大鼠ig給予蓖麻籽勻漿液的染毒劑量（折算成蓖麻堿量）分別為0.3，1.0和3.0 mg·kg-1，即大鼠體重按200 g計，每粒蓖麻籽平均重量0.2 g，則染毒劑量相當于每只大鼠ig 1/3，1和3粒蓖麻籽。

使用新鮮T11號蓖麻籽，超純水勻漿后以超純水稀釋至相當于蓖麻堿含量0.6，0.2和0.06 kg·L-1，待染毒使用。每劑量組5只大鼠，每只大鼠ig體積為1.0 mL。分別于ig前后0.25，0.5，1，2，4，6，8，12和24 h時進行眼眶后靜脈叢采血，肝素鈉抗凝，經(jīng)1000×g離心10 min后取上清得到血漿樣品。

取血漿樣品50 μL加入2.5 μL東莨菪堿內(nèi)標溶液500 μg·L-1，渦旋1 min；加入甲醇∶乙腈（3/1，V/V）混合溶液200 μL沉淀蛋白，渦旋1 min，14 000×g離心10 min；取上清液，50℃真空離心濃縮2 h；待溶液旋干后加入15%乙腈水溶液50 μL，渦旋1 min，14 000×g離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至進樣瓶中待測。

使用Phoenix WinNonlin軟件（版本號8.2），分別對0.3，1.0和3.0 g·kg-1組大鼠不同時間點血漿中蓖麻堿的血藥濃度進行非房室模型擬合［11］，并繪制血漿濃度-時間曲線圖，計算血漿毒動學參數(shù)。

1.6 血漿樣品分析方法學驗證

1.6.1 工作曲線和定量下限

以蓖麻堿濃度為橫坐標（X），蓖麻堿與內(nèi)標峰面積比值為縱坐標（Y），以加權(quán)（1/X2）最小二乘法進行線性回歸，即得工作曲線，其定量下限為工作曲線上最低濃度點。

1.6.2 批內(nèi)、批間精密度和準確度

取同一批母液加入SD大鼠空白血漿中，配制800（高），75（中）和2.5（低）和1 μg·L-1（定量下限）4個濃度的質(zhì)控樣品，每個濃度平行制備6個樣本，根據(jù)隨行測定的工作曲線計算質(zhì)控樣品的實際濃度。該法的測量值與分析物標示濃度的接近程度為批內(nèi)準確度，以相對誤差（RE，%）表示；而6個測量值之間的相對標準差（RSD，%）即為批內(nèi)精密度；連續(xù)3 d進行相同操作，測得批間精密度和準確度。

1.6.3 回收率和基質(zhì)效應(yīng)

為考察大鼠血漿中復雜基質(zhì)對檢測結(jié)果的影響，參照1.5處理6個來自不同個體的大鼠空白血漿，復溶時，加入適量母液，用15%乙腈水溶液稀釋為濃度800和2.5 μg·L-1的含基質(zhì)樣本，同時用15%乙腈水溶液稀釋母液為濃度800和2.5 μg·L-1的溶液樣本，通過計算內(nèi)標歸一化的基質(zhì)因子的變異系數(shù)考察基質(zhì)效應(yīng)，以變異系數(shù)≤15%為符合基質(zhì)效應(yīng)的要求。同時，在800和2.5 μg·L-1濃度2個水平下比較血漿樣本與溶液樣本的峰面積考察回收率。

1.6.4 殘留效應(yīng)

取處理后的高濃度蓖麻堿質(zhì)控樣品（750 μg·L-1）和空白血漿樣本交替進樣分析5次，考察標準曲線高濃度點進樣后有無殘留。

1.7 臨床中毒樣品檢測

臨床中毒樣品來自北京市某醫(yī)院急診科。2020年10月收治1例中青年男性患者，無其他軀體疾病，因誤信蓖麻具有保健功效，口服3～4粒蓖麻籽4 h后出現(xiàn)惡心、嘔吐等癥狀。采集中毒后4和14 h血液樣品2份和14 h尿液樣品1份。

血漿樣品參照1.5處理，尿液樣品用1倍體積甲醇溶液稀釋后14 000×g離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至進樣瓶中進行半定量分析。同時，分別配制濃度均為100 μg·L-1蓖麻堿的人空白血漿加標樣品和尿液加標樣品，同樣處理后檢測，采用單點外標法進行半定量測定。

2 結(jié)果

2.1 蓖麻籽中蓖麻堿的含量

6個產(chǎn)地14份蓖麻籽中的蓖麻堿含量測定結(jié)果見（表1）。其中以編號9的新疆產(chǎn)蓖麻籽中蓖麻堿含量最高，為1.60 g·kg-1；內(nèi)蒙古通遼產(chǎn)蓖麻籽（T19）中蓖麻堿含量最低，為0.95 g·kg-1。14份蓖麻籽中蓖麻堿含量均值為（1.19±0.22）g·kg-1（百分含量約為0.12%），與文獻報道基本一致［12］。選取含量較接近中位值的內(nèi)蒙T11號蓖麻籽ig給予大鼠進行毒動學研究。

Tab.1 Content of ricinine in castor beans from different origins

2.2 SD大鼠血漿中蓖麻堿濃度定量檢測方法學驗證

0.1%甲酸水溶液和乙腈作為流動相時，可在5 min梯度下使待測物蓖麻堿和內(nèi)標東莨菪堿較好分離；同時色譜柱選用反相醚聯(lián)苯基固定相，可有效改善傳統(tǒng)C18色譜柱在分析生物堿類化合物時的色譜峰拖尾現(xiàn)象［13-14］，蓖麻堿和東莨菪堿的保留時間分別為2.67和2.85 min（圖1）。

Fig.1 Extracted ion chromatograms of different ricinine samples.A：matrix blank；B and C：plasma samples spiked with ricinine at 1.0（B）and 1000 μg·L-1（C）；D：a plasma sample from rats after ig administration of caster bean homogenate.

大鼠血漿中蓖麻堿在1～1000 μg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為y=0.0082x+0.0253（R2=0.9644），最低定量限為1.0 μg·L-1（S/N＞10），最低檢出限為0.5 μg·L-1（S/N≥5），其血漿樣品的批內(nèi)和批間精密度均≤15%，批內(nèi)和批間準確度在88.1%～100.8%，基質(zhì)效應(yīng)為 4.8%～8.9%（RSD≤1.9%），方法回收率在77%～81%（RSD≤13%），且在高濃度質(zhì)控樣品（750 μg·L-1）進樣后無殘留，均能滿足生物樣品分析的要求（表2）。

Tab.2 Precision and accurcy of the LC-MS/MS method for ricinine determination in rat plasma

Fig.2 Plasma concentration-time curve of ricinine after ig administration of castor bean homogenate in SD rats determined by LC-MS/MS.The dose of caster bean homogenate（equivalent content of ricinine）was 0.3，1.0 and 3.0 g·kg-1，separately.±s，n=5.

2.3 蓖麻籽染毒大鼠血漿中蓖麻堿毒動學參數(shù)

經(jīng)蓖麻籽勻漿液ig染毒，SD大鼠血漿蓖麻堿的平均血漿濃度-時間曲線見圖3。0.3 mg·kg-1染毒組樣品的蓖麻堿檢出時間窗為12 h，而1.0和3.0 mg·kg-1組24 h樣品中仍可檢測到高于定量限的蓖麻堿。毒動學參數(shù)見表4，結(jié)果表明，3個染毒劑量組均呈現(xiàn)單峰，且達峰濃度（Cmax）和曲線下面積（AUC）均隨劑量增加而增加；染毒后0.7～0.8 h達到最大血漿暴露濃度，之后快速下降，消除半衰期（T1/2）為2.2～2.5 h。0.3和1.0 mg·kg-1組平均駐留時間非常接近，為4.1和4.5 h，而3.0 mg·kg-1組平均駐留時間較長，為8.2 h。

Tab.4 Toxicokinetic parameters of ricinine in rat plasma determined by LS-MS/MS method

2.4 臨床中毒樣品檢測結(jié)果分析

結(jié)果顯示，臨床中毒后4和14 h血漿樣品中蓖麻堿的濃度分別為25.5和22.2 μg·L-1，中毒后14 h尿樣中蓖麻堿的濃度為92.2 μg·L-1。

3 討論

本研究建立了以東莨菪堿為內(nèi)標的SD大鼠血漿中蓖麻堿的LC-MS/MS定量分析方法，該法操作簡便，具有較高專屬性和靈敏度，可滿足本實驗低濃度分析物測定的需要。采用蓖麻籽勻漿液ig給予大鼠，進行了蓖麻堿毒代動力學研究，其體內(nèi)有效暴露量和中毒劑量呈正相關(guān)，檢測時間窗寬，適于生物醫(yī)學樣品檢測，但其在體內(nèi)消除也較快。值得注意的是，3.0 mg·kg-1染毒組的平均駐留時間約是其他組的2倍，同時在24 h出現(xiàn)了一個明顯的上升趨勢，推測中毒蓖麻堿在體內(nèi)可能存在二次釋放效應(yīng)，但需要進一步研究。

本研究也對臨床中毒樣本進行了檢測，結(jié)合已報道的臨床中毒數(shù)據(jù)來看，蓖麻中毒途徑包括口服、注射等，檢材涵蓋血液、尿液、嘔吐液以及尸檢的組織樣本，其中蓖麻堿的檢出量范圍差別較大，從μg·L-1到mg·L-1濃度水平；檢出時間窗從中毒后4到38 h不等；與個體差異、中毒方式與蓖麻中蓖麻堿含量不同等密切相關(guān)。如2019年比利時1名26歲男性靜脈注射蓖麻籽粗提物自殺［8］，送醫(yī)后醫(yī)治無效死亡，其6 h血樣和7 h尿樣中的蓖麻堿濃度分別為16.5和79.6 μg·L-1。美國疾病控制預(yù)防中心也曾報道1例口服6粒蓖麻籽自殺未遂事例［15］，該患者為58歲美國男性，將蓖麻籽咀嚼吞咽，其14 h尿樣中檢出了高達1400 μg·L-1的蓖麻堿。

綜上，本研究建立了蓖麻堿LC-MS/MS定量方法并應(yīng)用于SD大鼠血漿中蓖麻堿的快速、靈敏、準確測定及毒代動力學曲線繪制。毒代動力學研究結(jié)果闡明了蓖麻堿體內(nèi)代謝行為、中毒檢測時間窗和體內(nèi)駐留時間等。對臨床中毒血、尿樣本的初步研究結(jié)果表明，蓖麻堿可作為蓖麻籽中毒診斷的標志物，且可在此工作基礎(chǔ)上建立基于人血漿和尿液基質(zhì)樣品的準確定量方法，為蓖麻中毒的臨床診斷確證和預(yù)后評估提供重要數(shù)據(jù)。