藏藥兔耳草常用基原的ITS2序列鑒定研究

高必興，齊景梁，鐘 紅，馬璐琳，李 倩，連 艷，蔣桂華*，蔣運(yùn)斌

藏藥兔耳草常用基原的ITS2序列鑒定研究

高必興1, 2，齊景梁2，鐘 紅4，馬璐琳4，李 倩2，連 艷1，蔣桂華1*，蔣運(yùn)斌3*

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137 2. 四川省藥品檢驗研究院 國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點實驗室，四川 成都 611731 3. 西南大學(xué)藥學(xué)院/中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 北碚 400715 4. 成都市郫都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，四川 成都 611730

利用DNA條形碼內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（internal transcribed spacer 2，ITS2）序列針對自采及流通使用環(huán)節(jié)的不同基原兔耳草進(jìn)行分析，建立一種快速鑒定常用兔耳草的方法，并分析市場流通的主流品種。采用試劑盒提取101份兔耳草樣品的DNA，針對其ITS2片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增并雙向測序，獲取ITS2序列信息；并從GenBank上下載相關(guān)序列28條。運(yùn)用MEGA6.0對129條ITS2序列進(jìn)行比對分析，計算種內(nèi)和種間K2P遺傳距離，構(gòu)建鄰接法（neighbor-joining，NJ）系統(tǒng)進(jìn)化樹，并預(yù)測ITS2二級結(jié)構(gòu)。采用BLAST法及NJ聚類分析法分析市場流通兔耳草基原。除四川部分區(qū)域所產(chǎn)全緣兔耳草與革葉兔耳草種間親緣關(guān)系近外，短筒兔耳草、全緣兔耳草、圓穗兔耳草、革葉兔耳草、短穗兔耳草及紫葉兔耳草的種內(nèi)最大遺傳距離均小于種間最小遺傳距離，具有明顯的條形碼間距。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示短筒兔耳草、圓穗兔耳草、短穗兔耳草及紫葉兔耳草單獨(dú)聚為一支，四川部分區(qū)域所產(chǎn)全緣兔耳草與革葉兔耳草聚為一支，其余全緣兔耳草聚為一支。通過ITS2二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，各基原兔耳草在莖環(huán)數(shù)目、大小及位置均有一定差異，可區(qū)分親緣關(guān)系近的全緣兔耳草與革葉兔耳草。市場分析顯示，市面上流通的兔耳草有6種基原，以全緣兔耳草使用占比最高，短筒兔耳草次之，短穗兔耳草及圓穗兔耳草較低，紫葉兔耳草及革葉兔耳草最低。ITS2序列可以作為DNA條形碼用來鑒別常用藏藥兔耳草的基原，市場主流兔耳草品種為全緣兔耳草、短筒兔耳草及短穗兔耳草。

兔耳草；ITS2序列；短筒兔耳草；全緣兔耳草；圓穗兔耳草；革葉兔耳草；短穗兔耳草；紫葉兔耳草；主流品種

藏藥“兔耳草”基原之一的短筒兔耳草Maxim.收載于《中國藥典》2020年版一部，藏文音譯名為“洪連”，藥用部位為全草，應(yīng)用廣泛，藥用價值高，具有清熱、解毒、利濕、平肝、行血、調(diào)經(jīng)等功效，可用于發(fā)熱煩渴、肺熱咳嗽、頭痛眩暈、濕熱黃疸、月經(jīng)不調(diào)、藥食中毒等證[1]，主要分布于我國青海省。通過前期調(diào)研發(fā)現(xiàn)，市售及臨床使用的兔耳草除短筒兔耳草外，還有多種兔耳草屬植物均被使用[2]，但目前傳統(tǒng)鑒別方法難以將其區(qū)分，無法了解市場總體的兔耳草使用情況，因此亟待一種有效的鑒別方法將其區(qū)分。

DNA分子鑒定技術(shù)是利用基因組中一段公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的、相對較短的DNA片段來進(jìn)行物種鑒定的分子診斷技術(shù)，不依賴物種的形態(tài)特征和分類經(jīng)驗[3]?！吨袊幍洹?020年版四部通則收載了中藥材 DNA 條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則，其中內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（internal transcribed spacer 2，ITS2）作為中藥材鑒定的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼[4]。現(xiàn)兔耳草的研究多集中在成分[5-6]、指紋圖譜[2]、藥理[7]等方面，鮮見兔耳草DNA條形碼的相關(guān)報道。本研究以DNA條形碼ITS2序列為基礎(chǔ)，對所收集的樣品和網(wǎng)站下載的相關(guān)ITS2序列進(jìn)行研究分析，以期建立一種快速準(zhǔn)確的鑒別方法，為兔耳草品種的鑒別及使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

C1000型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀、PowerPac Basic型電泳儀、Gel Doc XR+型全自動凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）；XP205型電子分析天平（Mettler Toledo公司）；MM400型球磨儀（Retsch公司）；MiniSpin型高速離心機(jī)（Eppendorf公司）；Milli-Q Advantage A10型純水儀（Millipore公司）；植物基因組DNA提取試劑盒、2×Taq Master Mix緩沖液、Gene Red核酸染料（天根生化科技有限公司）；Taq酶PCR擴(kuò)增試劑盒（北京聚合美生物科技有限公司）；瓊脂糖（Biowest公司）；ITS2引物（ITS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′；ITS3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′）由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

收集兔耳草相關(guān)樣品共計101批次，其中自采42批，購買59批，經(jīng)四川省藥品檢驗研究院黎躍成主任中藥師鑒定為全緣兔耳草W. W. Smith、革葉兔耳草W. W. Smith、短筒兔耳草Maxim.、短穗兔耳草Maxim.、紫葉兔耳草W. W. Smith、圓穗兔耳草Batalin，樣品來源見表1。同時于GenBank數(shù)據(jù)庫中下載28條ITS2序列，包括全緣兔耳草7條，革葉兔耳草2條，短筒兔耳草3條，短穗兔耳草14條，紫葉兔耳草1條，圓穗兔耳草1條。ITS2序列信息見表2。

2 方法

2.1 DNA提取

用75%乙醇擦拭樣品表面，自然晾干后，用球磨儀研磨成粉末，稱取粉末約30 mg，按照植物基因組DNA提取試劑盒說明書（天根生化科技有限公司）進(jìn)行操作，提取DNA，?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 PCR擴(kuò)增及測序

選取通用引物F（5′-ATGCGATA- CTTGGTGTGAAT-3′）和R（5′-GACGCTTCT- CCAGACTACAAT-3′）對樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50 μL，包含2×Taq Master Mix緩沖液25 μL、上下游引物各2 μL、DNA模板5 μL，加滅菌超純水至50 μL。陰性對照為無模板DNA的反應(yīng)體系。以10 000 r/min離心（離心半徑為3 cm）5 s后，置于PCR儀中。反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測以確定成功率及目的條帶片段大小，擴(kuò)增產(chǎn)物委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測序。

表1 不同基原兔耳草樣品信息

Table 1 Sample information sheet of different origins of Lagotidis Herba

編號基原來源獲取方式 HL-1全緣兔耳草德格縣藏醫(yī)院購買 HL-2宗薩藏醫(yī)院購買 HL-3石渠縣藏醫(yī)院購買 HL-4四川省甘孜州石渠縣絡(luò)須鎮(zhèn)第一個埡口自采 HL-5四川省甘孜州石渠縣絡(luò)須鎮(zhèn)分叉口前行雪山自采 HL-6鄉(xiāng)城縣藏醫(yī)院購買 HL-7甘孜州藥檢所購買 HL-8宇妥藏藥（批次201806）購買 HL-9四川省甘孜州石渠縣德榮馬鄉(xiāng)自采 HL-10涼山州木里藏族自治縣中藏醫(yī)院購買 HL-11得榮藏醫(yī)院購買 HL-12阿壩縣藏醫(yī)院購買 HL-13阿壩州藏醫(yī)院購買 HL-14若爾蓋藏醫(yī)院購買 HL-15白玉縣藏醫(yī)院購買 HL-16理塘縣藏醫(yī)院購買 HL-17居麥旁藏藥購買 HL-18青海果洛州藏醫(yī)院購買 HL-19青海省海東市樂都區(qū)自采 HL-20青海省囊謙縣藏醫(yī)院購買 HL-21金珂藏藥購買 HL-22青海省黃南州藏醫(yī)院購買 HL-23青海省玉樹藏族自治州藏醫(yī)院購買 HL-24青海省八一路藥材市場購買 HL-25青海省班瑪縣藏醫(yī)院購買 HL-26西藏拉薩藍(lán)屋石藥材公司購買 HL-27西藏藥檢所購買 HL-28西藏諾迪康藥業(yè)有限公司購買 HL-29西藏山南市錯那縣波拉山自采 HL-30西藏自治區(qū)拉薩市墨竹工卡縣思金拉錯自采 HL-31西藏藏醫(yī)學(xué)院藏藥有限公司購買 HL-32西藏錯那雷達(dá)站自采 HL-33西藏拉薩市當(dāng)雄縣羊八井鎮(zhèn)雪古拉山自采 HL-34西藏自治區(qū)拉薩市墨竹工卡米拉山自采 HL-35紅原藏醫(yī)院購買 HL-36云南藥檢所購買 HL-37四川省甘孜州理塘縣兔耳山埡口自采 HL-38四川省甘孜州雅江縣柯拉山上自采 HL-39四川省甘孜州理塘縣拉波鄉(xiāng)拉德村自采 HL-40四川省甘孜州理塘縣藏壩鄉(xiāng)自采 HL-41四川省甘孜州稻城海子山埡口自采 HL-42四川省甘孜州藏醫(yī)院自采 HL-43四川省甘孜州巴塘縣海子山姐妹湖自采 HL-44四川省甘孜州理塘縣拉波鄉(xiāng)拉美村自采 HL-45四川省甘孜州巴塘縣海子山埡口自采 HL-46四川省甘孜州雅江縣埡口前行3 km自采 HL-47革葉兔耳草云南省迪慶州白馬雪山第一埡口自采 HL-48云南省迪慶州白馬雪山第二埡口自采 HL-49迪慶藏醫(yī)院購買 HL-50甘南州藏醫(yī)院購買 HL-51四川阿壩年寶葉則自采 HL-52西藏自治區(qū)拉薩市墨竹工卡縣思金拉錯自采

續(xù)表1

表2 不同基原兔耳草ITS2序列的GenBank登錄號信息

Table 2 GenBank login number information of ITS2 sequence for different origins of Lagotidis Herba

名稱GenBank登錄號 全緣兔耳草KC413431.1、KC413433.1、KC413434.1、KC413435.1、KJ630574.1、KU508311.1、KU508316.1 革葉兔耳草KC413410.1、KC413411.1 短筒兔耳草KC413418.1、KC413420.1、KU508315.1 短穗兔耳草AF313027.1、KC413414.1、KC413415.1、KC413416.1、KC413417.1、KU508310.1、KU508312.1、KU508313.1、KU508314.1、OK275352.1、OK275354.1、OK275355.1、OK275356.1、OK275357.1 紫葉兔耳草AF313029.1 圓穗兔耳草KC413445.1

2.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用CodonCode Aligner V6.0對測序所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行校對拼接，去除引物及低質(zhì)量區(qū)，基于隱馬爾科夫模型（HMMer）的注釋方法去除5.8 S和28 S區(qū)段，即可獲得ITS2序列信息。

采用BLAST法進(jìn)入美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI，https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.Cgi）和中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)（http://barcode. ndctcm.org/china/），應(yīng)用相似性搜索法[10]對實驗樣品的不同單倍型序列進(jìn)行BLAST鑒定分析。

應(yīng)用MEGA6.0軟件進(jìn)行序列比對，對序列的變異位點進(jìn)行分析，不同物種的單倍型為A1、B1，同一物種存在變異位點的單倍型為A1、A2；并基于K2P模型計算種內(nèi)、種間遺傳距離，利用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，同時以Bootstrap自展支持率（1000次）重復(fù)檢驗各分支的支持率。

登錄http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuer- zburg.de/，對不同物種的主導(dǎo)單倍型進(jìn)行ITS2二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。

3 結(jié)果與分析

3.1 序列信息分析

短筒兔耳草、短穗兔耳草、紫葉兔耳草及圓穗兔耳草的ITS2序列長度均為202 bp，全緣兔耳草與革葉兔耳草的ITS2序列長度為203 bp。所有樣品GC量為59.4%～62.7%，平均GC量為61.02%。6種兔耳草間存在32個變異位點，種內(nèi)革葉兔耳草、紫葉兔耳草及圓穗兔耳草的ITS2序列變異較小，不存在變異位點，形成1個單倍型；全緣兔耳草、短筒兔耳草、短穗兔耳草ITS2序列分析分別存在7、3、2個種內(nèi)變異位點，分別形成5、3、2個單倍型。

3.2 K2P遺傳距離分析

短筒兔耳草、全緣兔耳草、革葉兔耳草、短穗兔耳草、紫葉兔耳草及圓穗兔耳草種內(nèi)和種間遺傳距離見表3，結(jié)果顯示，除全緣兔耳草與革葉兔耳草種間與種內(nèi)遺傳距離有部分重合外，種內(nèi)最大遺傳距離0～0.015；除全緣兔耳草與革葉兔耳草外，種間最小遺傳距離0.016～0.023，種內(nèi)最大遺傳距離遠(yuǎn)小于種間最小遺傳距離，具有明顯的條形碼間距（barcoding gap），說明K2P距離可很好地區(qū)分開此6種兔耳草，但無法完全區(qū)分全緣兔耳草與革葉兔耳草。

表3 不同基原兔耳草的種內(nèi)種間遺傳距離分析

Table 3 Analysis of intraspecific and interspecific genetic distances of different origins of Lagotidis Herba

物種種內(nèi)（種間）遺傳距離 短筒兔耳草全緣兔耳草短穗兔耳草圓穗兔耳草革葉兔耳草紫葉兔耳草 短筒兔耳草00.028（0.026～0.041）0.028（0.026～0.035）0.037（0.029～0.045）0.029（0.026～0.035）0.029（0.026～0.035） 全緣兔耳草0.028（0.026～0.041）00.033（0.029～0.045）0.043（0.038～0.051）0.003（0.006～0.011）0.034（0.032～0.042） 短穗兔耳草0.028（0.026～0.035）0.033（0.029～0.045）00.035（0.029～0.042）0.029（0.029～0.033）0.026（0.025～0.029） 圓穗兔耳草0.037（0.029～0.045）0.043（0.038～0.051）0.035（0.029～0.042）00.041（0.038～0.045）0.016（0.016～0.023） 革葉兔耳草0.029（0.026～0.035）0.003（0.006～0.011）0.029（0.029～0.033）0.041（0.038～0.045）00.032 紫葉兔耳草0.029（0.026～0.035）0.034（0.032～0.042）0.026（0.025～0.029）0.016（0.016～0.023）0.0320

3.3 聚類分析

基于ITS2序列構(gòu)建兔耳草及其易混品間的NJ系統(tǒng)聚類樹，Bootstrap 1000次重復(fù)，支上數(shù)值僅顯示自展支持率≥50%，見圖1?？梢钥闯?，除全緣兔耳草與革葉兔耳草外，各物種均能以大于50%的自展支持率各自聚為1支，表現(xiàn)出了良好的單系性。四川甘孜所產(chǎn)全緣兔耳草均與革葉兔耳草聚為一支，其他均單獨(dú)聚為一支。

3.4 ITS2二級結(jié)構(gòu)分析

因全緣兔耳草聚成了2類，故分別建立其二級結(jié)構(gòu)，根據(jù)ITS2二級結(jié)構(gòu)預(yù)測數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站得到7類兔耳草（短筒兔耳草、全緣兔耳草I類、全緣兔耳草II類、革葉兔耳草、短穗兔耳草、紫葉兔耳草及圓穗兔耳草）的二級結(jié)構(gòu)模型，見圖2。通過莖環(huán)數(shù)目、大小及位置能有效區(qū)分，分析結(jié)果如下：均為典型的1環(huán)4臂結(jié)構(gòu)，即1個中心環(huán)（主環(huán)）及4個螺旋區(qū)（helix），每個螺旋上又有大大小小、或多或少的莖環(huán)（loop）結(jié)構(gòu)，其中螺旋III最長。

通過莖環(huán)數(shù)目（表4）可區(qū)分短筒兔耳草、短穗兔耳草、紫葉兔耳草及圓穗兔耳草，但無法區(qū)分全緣兔耳草I類、全緣兔耳草II類及革葉兔耳草。但通過莖環(huán)的大小及位置可以區(qū)分三者，螺旋I中三者均具有3環(huán)，但全緣兔耳草I類第一環(huán)大小大于第2環(huán)及第3環(huán)，全緣兔耳草II類與革葉兔耳草3環(huán)大小相似，但在螺旋III中全緣兔耳草II類第一環(huán)大小大于其余3環(huán)，而革葉兔耳草4環(huán)大小相似，能將其區(qū)分。

圖1 基于ITS2序列構(gòu)建不同基原兔耳草的NJ樹

圖2 不同基原兔耳草的ITS2二級結(jié)構(gòu)

表4 不同基原兔耳草的莖環(huán)數(shù)目

Table 4 Number of stem loops of different origins of Lagotidis Herba

基原莖環(huán)數(shù)目 螺旋I螺旋II螺旋III螺旋IV 短筒兔耳草2241 全緣兔耳草（I類）3241 全緣兔耳草（II類）3241 短穗兔耳草2241 圓穗兔耳草2221 革葉兔耳草3241 紫葉兔耳草2221

3.5 不同基原兔耳草在市場中的使用情況

針對購買的兔耳草樣品（59批），基于NCBI的BLAST鑒定結(jié)果和NJ系統(tǒng)聚類樹分析結(jié)果表面，6種兔耳草均有使用，以全緣兔耳草（27批，占總批次的45.8%）占比最高，短筒兔耳草（16批，占總批次的27.1%）次之，短穗兔耳草（7批，占總批次的11.9%）及圓穗兔耳草（6批，占總批次的10.2%）較低，紫葉兔耳草（1批，占總批次的1.7%）及革葉兔耳草（2批，占總批次的3.4%）最低。

4 討論

傳統(tǒng)的鑒別方法難以將6種兔耳草的基原完全的區(qū)分，故使用《中國藥典》2020年版四部通則[4]收載的中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則的ITS2作為該藥材鑒定的方法。其不受個體形態(tài)特征和完整性的影響，方法易于統(tǒng)一、標(biāo)準(zhǔn)化，是傳統(tǒng)鑒定方法的有效補(bǔ)充[10]，同時本研究在ITS2一級核酸序列的基礎(chǔ)上，對其二級結(jié)構(gòu)也進(jìn)行了預(yù)測，ITS2二級結(jié)構(gòu)是由RNA中的核苷酸在氫鍵作用下發(fā)生堿基互補(bǔ)配對，導(dǎo)致自身回折形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，是實現(xiàn)細(xì)胞功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，包含著額外的系統(tǒng)發(fā)育信息[11]，可以作為DNA條形碼鑒別中藥材的輔助手段。結(jié)合ITS2一級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)的分析可以區(qū)分此6種基原。此方法可用于洪連基原種的鑒別，無疑是對洪連資源的合理開發(fā)與利用有著非常重要的價值。

本研究通過聚類分析及K2P遺傳距離分析可知，全緣兔耳草與革葉兔耳草的親緣關(guān)系非常近；紫葉兔耳草及圓穗兔耳草親緣關(guān)系也近，以大于50%的置信度聚為一支，同時有著所有種最低的種間遺傳距離（0.016～0.023）。同時通過聚類分析還發(fā)現(xiàn)，中國植物志中歸屬于兔耳草屬分萼組的短穗兔耳草、紫葉兔耳草及圓穗兔耳草以97%的置信度聚為一大支，歸屬于兔耳草屬合萼組的短筒兔耳草、全緣兔耳草及革葉兔耳草以83%的置信度聚為一大支，從分子生物學(xué)的角度驗證了其歸屬的可信度。

市場使用情況分析可知，以國家藥品標(biāo)準(zhǔn)收載的短筒兔耳草及全緣兔耳草使用得最為普遍，地方標(biāo)準(zhǔn)收載的短穗兔耳草、圓穗兔耳草及革葉兔耳草的使用次之，未被標(biāo)準(zhǔn)收載的紫葉兔耳草使用的最低。有必要增加紫葉兔耳草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，規(guī)范其用藥的安全及有效性。同時從自采的批次（短筒兔耳草8批、全緣兔耳草19批、革葉兔耳草4批、短穗兔耳草3批、紫葉兔耳草4批及圓穗兔耳草4批）也可以看出，全緣兔耳草的資源較其他資源更為豐富，短筒兔耳草現(xiàn)為國家保護(hù)植物，常年的采摘導(dǎo)致其資源的匱乏，以資源更為豐富的全緣兔耳草來代替短筒兔耳草，以緩解其資源的劣勢。

綜上所述，DNA分子鑒定技術(shù)的ITS2序列可鑒別市場中常見的6種兔耳草，其中短穗兔耳草又作為藥材“志達(dá)薩增”使用，其收載的功效均與傳統(tǒng)的洪連相悖[12-15]；同時圓穗兔耳草、短管兔耳草及紫葉兔耳草同屬于“雄洪連”，全緣兔耳草與革葉兔耳草屬“雌洪連”，雄洪連的臨床療效優(yōu)于雌洪連[2]，但現(xiàn)有研針對此6種兔耳草的化學(xué)成分和藥效學(xué)研究甚少[9]，仍需進(jìn)一步深入研究，為其資源的合理開發(fā)及使用奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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[15] 青海省藏藥材標(biāo)準(zhǔn)[S]. 甘肅民族出版社, 2019: 105.

Identification of commonly used origins of Tibetan medicinebased on ITS2 barcode and market analysis

GAO Bi-xing1, 2, QI Jing-liang2, ZHONG Hong4, MA Lu-ling4, LI Qian2, LIAN Yan2, JIANG Gui-hua1, JIANG Yun-bin3

1. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. Sichuan Institute for Drug Control/Key Laboratory of Quality Evaluation of Chinese Patent Medicines, NMPA, Chengdu 611731, China 3. College of Pharmaceutical Sciences and Chinese Medicine, Southwest University, Chongqing 400715, China 4. Chengdu Pidu District Hospital of TCM, Chengdu 611137, China

To establish a rapid method to identify different origin offrom self-harvesting and distribution samples based on ITS2 sequences of DNA barcode technology, and analyze the mainstream varieties in the market.The DNA of 101samples was extracted by using the Plant Genomic DNA Extraction kit, and then their ITS2 sequence was amplified by PCR and sequenced in both directions to obtain the information of ITS2 sequence; Meanwhile, 28 related sequences were downloaded from GenBank. Subsequently, 129 ITS2sequenceswere analyzed by MEGA6.0, and the intra- and inter- specific K2P genetic distances were calculated to construct aneighbor joining (NJ) phylogenetic treeand predict the secondary structure of ITS2. The origins ofin circulation samples were analyzed by the BLAST and NJ cluster analysis methods.The results showed that the maximum intraspecific genetic distance was far less than the minimum interspecific genetic distance among,,,,and, exceptfrom some areas of Sichuan and, indicating there were an obvious barcoding gap among them. The NJ tree showed that,,andshared respectively a clade, andfrom some areas of Sichuan andshared a clade, and othershared a clade. ITS2 secondary structures for six kinds ofwere significantly different enough to identifyand, and the difference were the number, size and location of the stem ring. Market analysis showed that the usage rate of different origins of L. herba from high to low was,and,.The ITS2 sequence can be used as DNA barcode to identify the origins ofaccurately and quickly. Market mainstream varieties were,and.

; ITS2 barcode;Maxim.;W. W. Smith;Batalin;W. W. Smith;Maxim.;W. W. Smith; mainstream varieties

R286.12

A

0253 - 2670(2022)21 - 6857 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.21.024

2022-03-06

國家食藥監(jiān)總局藥化司專項“特色民族藥材檢驗方法示范性研究”；四川省藥品監(jiān)督管理局科技計劃項目（2021002）；國家自然科學(xué)基金項目（82173928）；四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)計劃課題（2020YJ0369）；四川省中醫(yī)藥管理局項目（2021MS022）；四川省民族藥標(biāo)準(zhǔn)提升項目（510201202200504）

高必興，男，主管中藥師，主要從事中藥及民族藥質(zhì)量研究。E-mail: laughgao@foxmail.com

蔣桂華，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥及民族藥學(xué)研究。Tel: 18980923782 E-mail: 11469413@qq.com

蔣運(yùn)斌，男，講師，主要從事民族藥學(xué)研究。E-mail: yunbinjiang@swu.edu.cn

[責(zé)任編輯 時圣明]