酸棗仁總皂苷改善對氯苯丙氨酸誘導失眠大鼠模型學習記憶損傷機制的研究

衡依然，段慧竹，杜 鶴，閆 艷，杜晨暉*

酸棗仁總皂苷改善對氯苯丙氨酸誘導失眠大鼠模型學習記憶損傷機制的研究

衡依然1，段慧竹1，杜 鶴1，閆 艷2*，杜晨暉1*

1. 山西中醫(yī)藥大學 中藥與食品工程學院，山西 太原 030619 2. 山西大學 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006

基于代謝組學技術(shù)考察酸棗仁總皂苷（total saponins of，SZSS）對失眠大鼠內(nèi)源性代謝物的影響，并探討酸棗仁總皂苷改善學習記憶的藥效及其作用機制。采用對氯苯丙氨酸（-4-chlorophenylalanine，PCPA）誘導大鼠失眠模型，給予地西泮和酸棗仁總皂苷干預(yù)后，進行曠場實驗及Morris水迷宮實驗；采用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察海馬組織病理變化；采用ELISA測定海馬組織5-羥色氨（5-hydroxytryptamine，5-HT）、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）及NO（nitric oxide，NO）水平。利用UPLC-Orbitrap-MS/MS技術(shù)對大鼠海馬組織代謝輪廓進行分析，結(jié)合多元統(tǒng)計分析篩選差異性代謝物，并基于MetaboAnalyst 5.0數(shù)據(jù)庫進行代謝通路及代謝網(wǎng)絡(luò)分析，多角度探討酸棗仁總皂苷改善學習記憶的代謝特征及作用途徑。與模型組比較，酸棗仁總皂苷組大鼠學習能力顯著提高（＜0.05、0.01），海馬組織病理結(jié)構(gòu)明顯改善，海馬組織中5-HT、GABA及NO水平顯著升高（＜0.05、0.01）；代謝組學共鑒定出18種與學習記憶損傷相關(guān)的潛在生物標志物，酸棗仁總皂苷主要通過苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等7條主要氨基酸代謝通路發(fā)揮改善記憶損傷的作用。酸棗仁總皂苷能夠通過回調(diào)海馬組織內(nèi)源性差異代謝物，并調(diào)控相關(guān)氨基酸代謝通路，從而改善失眠引起學習記憶減退。

酸棗仁總皂苷；失眠；學習記憶；海馬；差異代謝物

酸棗仁為鼠李科植物酸棗Millvar.(Bunge) Hu ex H. F. Chou的干燥成熟種子，具有補肝、寧心、斂汗、生津的功效[1]。酸棗仁中主要含有皂苷、黃酮、脂肪油和揮發(fā)油等多種成分。其中，酸棗仁皂苷是酸棗仁中含量較高、化學結(jié)構(gòu)復(fù)雜及藥理作用廣泛的一類有效成分[2-3]。目前已從酸棗仁中鑒定到31種皂苷類成分[4]，主要有達瑪烷型四環(huán)三萜類皂苷和齊墩果烷型、羽扇豆烷型、ceanothane型等五環(huán)三萜類皂苷。現(xiàn)代藥理學研究表明，酸棗仁皂苷是酸棗仁發(fā)揮鎮(zhèn)靜安神作用的主要藥效成分，在神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)等方面亦表現(xiàn)出廣泛的藥理活性[5-11]。

失眠在睡眠障礙的分類中占主導地位，并在近年來成為一個日益嚴重的公共問題，根據(jù)我國睡眠研究會公布的最新調(diào)查結(jié)果顯示，2022年中國成年人的失眠發(fā)生率高達38.2%[12]。失眠會影響學習記憶的形成和鞏固，并引發(fā)焦慮、抑郁等精神疾病，嚴重影響工作和生活[13-15]。研究表明，失眠通過影響海馬結(jié)構(gòu)及神經(jīng)遞質(zhì)的水平進而影響海馬神經(jīng)可塑性[16]，造成學習記憶損傷；失眠通過引起氧化應(yīng)激反應(yīng)抑制海馬中抗氧化酶的生成、活性氧的過度增加、脂質(zhì)過氧化和DNA修飾等生理或病理過程而引起神經(jīng)元損傷，間接造成學習記憶損傷[17]；失眠可通過激活海馬中炎癥因子，導致神經(jīng)損傷，進而造成學習記憶損傷[18]。海馬對睡眠覺醒也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[19]。達瑪烷型皂苷如人參皂苷[20-21]、知母皂苷[22]、三七皂苷[23]等均能夠改善實驗動物的學習記憶能力，酸棗仁皂苷類成分能夠改善癡呆[24]、阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）[25]等動物模型的學習記憶能力，但對于失眠引起的學習記憶能力減退研究未見報道。酸棗仁皂苷能否改善失眠導致的學習記憶損傷，并且如何發(fā)揮作用值得進一步研究。

對氯苯丙氨酸（-4-chlorophenylalanine，PCPA）失眠模型是評價藥物鎮(zhèn)靜催眠作用中最常用的誘導睡眠障礙藥理模型[26-27]。PCPA是一種特異的、不可逆的色氨酸羥化酶（tryptophan hydroxylase，TPH）抑制劑，TPH是5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）生物合成的限速酶。色氨酸可經(jīng)TPH催化生成5-羥色氨酸（5-hydroxytryptamine，5-HTA），5-HTA進一步脫羧生成5-HT。因此，ip PCPA會抑制色氨酸羥基化而阻斷5-HT的合成[28]，從而導致動物外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT水平顯著降低，晝夜節(jié)律消失，幾乎完全失眠[29]。5-HT是與睡眠關(guān)系最密切的神經(jīng)遞質(zhì)之一，在慢波睡眠誘導和維持中具有重要作用[30]。目前以5-HT水平的顯著變化作為PCPA失眠模型評價指標在文獻中較為常見[31-34]。海馬區(qū)是大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最復(fù)雜的部位，主要參與機體近期記憶中的情節(jié)記憶及空間位置的學習[35]。外源性注射PCPA后，海馬結(jié)構(gòu)受到損傷，引起單胺類神經(jīng)遞質(zhì)（5-HT、去甲腎上腺素、多巴胺等）、氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)[γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、谷氨酸等]及與記憶相關(guān)的細胞因子[一氧化氮（nitric oxide，NO）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α等]水平變化[36]，進而導致學習記憶損傷[37]。

近年來，代謝組學作為一種新型技術(shù)手段，能夠更加可靠、靈敏地反映疾病或藥物作用引起的機體生物功能變化，篩選調(diào)節(jié)機體的潛在生物標志物。孟喜勝等[38]對恒清II號方干預(yù)的APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠進行了代謝組學研究，發(fā)現(xiàn)其抗AD作用及改善認知障礙與氨基酸生物合成和代謝通路相關(guān)。邵曉妮等[39]基于1H-NMR的代謝組學技術(shù)對高尿酸血癥認知功能障礙大鼠的皮層和海馬進行檢測，分析其誘發(fā)認知功能障礙機制可能與能量代謝的糖酵解和三羧酸循環(huán)、氨基酸代謝等有關(guān)。目前代謝組學已被廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)類疾病，包括疾病的診斷和機制研究、尋找藥物作用靶點和生物標志物等研究[40]。

為深入探討酸棗仁總皂苷改善失眠大鼠學習記憶的作用及其機制，本研究復(fù)制PCPA失眠大鼠模型，采用曠場實驗總路程、靜止時間及血清中5-HT水平評價失眠模型；通過逃逸潛伏期、目標象限停留時間、目標象限總路程、平均速度、進入目標象限次數(shù)等水迷宮行為學指標、海馬組織生理病理結(jié)構(gòu)變化及海馬中神經(jīng)遞質(zhì)含量，評價酸棗仁總皂苷改善PCPA失眠引起的大鼠學習記憶減退作用，結(jié)合代謝組學技術(shù)多角度探索酸棗仁總皂苷改善學習記憶損傷的可能機制。

1 材料

1.1 動物

60只SPF級雄性SD大鼠，8周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（京）2016-0011。動物飼養(yǎng)于濕度（50±10）%、溫度（25±2）℃、12 h晝夜循環(huán)的環(huán)境中，自由進食飲水，給藥前禁食12 h。動物實驗經(jīng)山西中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準（批準號2021DW172）。

1.2 藥品與試劑

酸棗仁總皂苷為本課題組制備，質(zhì)量分數(shù)為45.75%[38]；PCPA（質(zhì)量分數(shù)＞98%，批號GK01-QHLL）購自梯希愛（上海）生化科技股份有限公司；戊巴比妥鈉（批號P11011）購自德國默克公司；地西泮（批號1901023203）購自山東信誼制藥有限公司；羧甲基纖維素鈉（批號J0713A）購自大連美侖生物科技有限公司；生理鹽水（批號1901023203）購自邦標醫(yī)療科技有限公司；5-HT ELISA試劑盒（批號20211110）、GABA ELISA試劑盒（批號20211105）、NO ELISA試劑盒（批號2021021）購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；質(zhì)譜級乙腈、甲醇和甲酸購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 儀器

U3000型超高效液相色譜儀、ExactiveTMOrbitrap質(zhì)譜儀、88880018型渦旋儀、DNA120-230型離心濃縮儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；CPA225D型十萬分之一分析天平（德國Sartorius公司）；MMT-200型大鼠水迷宮測試儀（成都泰盟軟件有限公司）；OFT-100型自主活動測試儀（成都泰盟科技有限公司）。

2 方法

2.1 酸棗仁總皂苷改善失眠大鼠學習記憶藥效學評價

2.1.1 PCPA失眠模型的建立

（1）PCPA懸浮液的制備：用pH 7～8的堿性生理鹽水配制200 mL 0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，少量多次地加入PCPA粉末中，不斷攪拌，制成質(zhì)量濃度為40 mg/mL的懸浮液。

（2）PCPA失眠大鼠模型的復(fù)制：取48只SD大鼠，每日8: 00—9: 30時ip PCPA溶液（400 mg/kg），連續(xù)注射4 d。另取12只大鼠作為對照組。造模第3天眼眶取血，每組隨機取6只。血樣于4 ℃靜置30 min，3500 r/min離心10 min，得血清樣品，按照ELISA試劑盒說明書測定正常大鼠與造模后大鼠血清中5-HT水平，模型大鼠血清中5-HT水平顯著低于正常大鼠（＜0.001），表明PCPA大鼠失眠模型制備成功。

2.1.2 分組及給藥 造模后的大鼠隨機分為模型組、地西泮（2 mg/kg）組和酸棗仁總皂苷低、高劑量（10、20 g/kg）組，每組12只。每日8: 00—9: 00時，各給藥組ig相應(yīng)藥物（20 mL/kg），對照組和模型組ig等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)7 d。

2.1.3 曠場實驗 給藥第3天進行曠場實驗，在給藥30 min后將大鼠放置于中心區(qū)域進行測試，測試時間6 min。前1 min為適應(yīng)期，記錄5 min內(nèi)大鼠總路程和靜止時間。

2.1.4 Morris水迷宮實驗 給藥第4天進行Morris水迷宮實驗。實驗在黑色內(nèi)壁的圓形水池中進行，水池等分為4個象限（平面直角坐標系中里的橫軸和縱軸所劃分的4個區(qū)域，右上的稱為第I象限，左上的稱為第II象限，左下的稱為第III象限，右下的稱為第IV象限），目標平臺位于第IV象限水面下1 cm。水溫恒定（22±2）℃，光線恒定，無日光變化影響。實驗過程采用視頻跟蹤分析系統(tǒng)進行記錄。

（1）定位航行實驗：選擇離目標平臺的最遠方位（第II象限）固定位點將大鼠面朝內(nèi)壁放入水中，記錄各組大鼠從進入水中到找到并爬上目標平臺停留15 s所用的時間，即大鼠的逃避潛伏期。若大鼠在90 s內(nèi)沒有找到目標平臺，則對其進行引導，并在平臺上停留15 s，所有大鼠每天訓練2次，持續(xù)2 d。

（2）空間探索實驗：撤去平臺，將各組大鼠在同一位置面向池內(nèi)壁放入水中，記錄大鼠在60 s內(nèi)行動軌跡圖、游泳速度及其穿越目標象限的次數(shù)、時間、路程。

2.1.5 大鼠取材與處理 末次給藥1 h后，各組大鼠ip 10%戊巴比妥鈉麻醉后處死，斷頭，經(jīng)顱前正中線剪開頭皮，小心撬開顱骨，在冰盒上取下大鼠腦組織，剝離海馬，放入4%多聚甲醛固定液中，每組3份。經(jīng)石蠟切片后進行蘇木素-伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下對海馬組織進行病理觀察并采集圖像。各組剩余大鼠海馬樣品，稱定質(zhì)量后加入10倍量生理鹽水，4 ℃勻漿180 s，3000 r/min離心15 min，收集上清液，按照ELISA試劑盒說明書測定海馬組織中5-HT、GABA和NO水平。

2.2 海馬組織代謝組學分析

2.2.1 海馬組織樣品的處理 精密稱取“2.1.5”項下的對照組、模型組、地西泮組和酸棗仁總皂苷低劑量組大鼠海馬組織30 mg，加入300 μL預(yù)冷的含0.1%甲酸的甲醇溶液，4 ℃勻漿3 min（頻率60 Hz），4 ℃離心10 min，取上清液250 μL置于離心濃縮儀中濃縮至干。加入100 μL 70%甲醇水溶液復(fù)溶，渦旋使完全溶解，4 ℃、13 000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm微孔濾膜進行分析。

2.2.2 質(zhì)控樣品的處理 取20 μL各組海馬組織樣品溶液混合作為質(zhì)控樣品。質(zhì)控樣品在運行之前、樣品組間和運行之后進樣，以評估整個分析過程的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

2.2.3 色譜條件 Acquity UPLC?HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～1 min，2% B；1～3 min，2%～50% B；3～14 min，50%～60% B；14～18 min，60%～90% B；18～19 min，90%～100% B；19～20 min，100% B；20～22 min，100%～2% B。柱溫50 ℃；體積流量0.35 mL/min；進樣量2 μL。

2.2.4 質(zhì)譜條件 ESI離子源；正、負離子掃描；掃描模式Full MS/dd MS2；鞘氣體積流量35 arb（ESI+）、35 arb（ESI?）；輔助氣體積流量10 arb（ESI+）、10 arb（ESI?）；噴霧電壓3.5 kV（ESI+）、2.5 kV（ESI?）；毛細管溫度320 ℃；離子源溫度350 ℃（ESI+）、300 ℃（ESI?）；一級全掃描分辨率70 000、二級掃描分辨率為17 500；掃描范圍/100～1500；動態(tài)排除持續(xù)時間8 s；NCE能量分別設(shè)為20、30、50 V。

2.3 代謝組學數(shù)據(jù)處理

UPLC-MS數(shù)據(jù)收集完畢后，導出raw格式文件，采用Compound Discoverer 3.3軟件進行圖譜對比查看、去噪音、解卷積和歸一化等數(shù)據(jù)預(yù)處理，導出csv格式的二維數(shù)據(jù)矩陣，包括/、保留時間和峰面積。使用SIMCA-P 14.1軟件對處理數(shù)據(jù)依次進行主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），根據(jù)VIP＞1及＜0.05篩選出潛在代謝標記物，將篩選的差異代謝物導入Metabo Analyst 5.0數(shù)據(jù)庫進行高通量代謝通路分析。

2.4 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 曠場實驗結(jié)果

如圖1所示，與對照組比較，模型組大鼠總路程顯著增加（＜0.01），靜止時間顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠總路程顯著降低（＜0.01、0.001），靜止時間顯著升高（＜0.05、0.01），表明酸棗仁總皂苷具有鎮(zhèn)靜催眠的作用。

3.2 Morris水迷宮行為學實驗結(jié)果

3.2.1 定位航行實驗結(jié)果 以逃避潛伏期為指標評價失眠大鼠空間學習能力。在經(jīng)過4次的引導訓練后，各組大鼠逃避潛伏期均有不同程度的下降，第4次訓練即最終定位航行測試結(jié)果，見圖2。與對照組比較，模型組大鼠逃避潛伏期顯著增加（＜0.05）；與模型組比較，地西泮組和酸棗仁總皂苷低劑量組大鼠逃避潛伏期顯著降低（＜0.05、0.01）。

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下圖同

圖2 酸棗仁總皂苷對失眠大鼠定位巡航能力的影響(, n = 8)

3.2.2 空間探索實驗 采用大鼠水迷宮測試儀跟蹤成像系統(tǒng)對各組大鼠在水池中的運動軌跡進行記錄，見圖3。原平臺所在象限為第IV象限，對照組大鼠入水后能夠自主地去第IV象限尋找平臺，軌跡較為松散；模型組大鼠的軌跡集中分布在入水的第I象限內(nèi)，較少去探索其他象限；地西泮組大鼠入水后活動減少，出現(xiàn)靜止漂浮水面的現(xiàn)象，個別大鼠在水中無規(guī)律的運動；酸棗仁總皂苷低、高劑量組大鼠在平臺所在的第IV象限內(nèi)徘徊，并在入水后有直線進入第IV象限的趨勢，提示給予酸棗仁總皂苷后，大鼠學習記憶能力有所回調(diào)。

圖3 各組大鼠Morris水迷宮運動軌跡圖

利用GraphPad Prism軟件對目標象限停留時間、進入目標象限路程、平均速度和進入目標象限次數(shù)4個指標進行分析。如圖4所示，與對照組比較，模型組大鼠在撤去平臺后進入第IV象限時間、路程、次數(shù)及平均速度均顯著降低（＜0.01），在實驗中觀察到其多在入水處徘徊或無目的的探索情況；與模型組比較，各給藥組大鼠進入目標象限的路程、停留時間、次數(shù)及平均速度均顯著延長（＜0.05、0.01），表明酸棗仁總皂苷能夠改善失眠大鼠的學習記憶能力。

3.3 大鼠海馬病理切片結(jié)果

如圖5所示，模型組大鼠海馬組織出現(xiàn)明顯損傷，在海馬齒狀回區(qū)胞質(zhì)空泡化嚴重，同時神經(jīng)元細胞出現(xiàn)皺縮，染色加深，胞核胞質(zhì)分界不清，可能影響到信號的傳導及神經(jīng)元的產(chǎn)生。與模型組相比較，各給藥組大鼠海馬胞質(zhì)空泡化損傷均有不同程度改善，但仍存在神經(jīng)元萎縮現(xiàn)象，酸棗仁總皂苷低劑量組大鼠海馬切片較為接近對照組，與行為學結(jié)果一致。

圖4 酸棗仁總皂苷對失眠大鼠空間探索能力的影響(, n = 8)

黑色箭頭表示胞核胞質(zhì)分界不清，黃色箭頭表示神經(jīng)元胞質(zhì)空泡化

3.4 酸棗仁總皂苷對失眠大鼠海馬組織中5-HT、GABA和NO水平的影響

如圖6所示，與對照組比較，模型組大鼠海馬組織中5-HT、GABA和NO水平均顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組海馬組織中5-HT、GABA和NO水平均顯著升高（＜0.05、0.01）。

3.5 海馬代謝組學研究結(jié)果

3.5.1 海馬組織樣品液質(zhì)輪廓分析 為考察各組大鼠體內(nèi)代謝組學的整體變化，對原始數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，采用SIMCA-P軟件對海馬組織樣品進行PCA分析，在正、負離子模式下質(zhì)控樣品中分別有100%、99%峰的RSD值＜30%，表明該方法有較好的穩(wěn)定性及重復(fù)性，數(shù)據(jù)可靠。如圖7所示，正、負離子模式下對照組與模型組明顯分開，且組間距離較遠，表明模型組與對照組大鼠的內(nèi)源性代謝物存在較大差異，而各給藥組均可回調(diào)這種差異。

3.5.2 潛在標志物預(yù)測分析 為了對比酸棗仁總皂苷對大鼠海馬組織樣品內(nèi)源性代謝物的影響，進一步對對照組和模型組、模型組和酸棗仁總皂苷低劑量組進行有監(jiān)督的OPLS-DA分析，結(jié)合VIP＞1、＜0.05篩選潛在生物標志物的候選變量。圖8-A、B為對照組和模型組的OPLS-DA圖，2組可沿X軸明顯分開，組間差異較大，表明模型組大鼠代謝輪廓發(fā)生改變，即在正、負離子模式下，ip PCPA顯著影響了大鼠海馬中的內(nèi)源性代謝物。200次模型驗證結(jié)果表明（正離子模式下2＝0.996、2＝0.954，負離子模式下2＝0.996、2＝0.967），模型可靠，具有良好的預(yù)測能力，可用于后續(xù)差異代謝物的篩選。S-plot圖中紅色點即為VIP＞1的代謝物，表明這些代謝物對組間貢獻度較大，可能是兩組間的差異代謝物。同時對模型組和酸棗仁總皂苷低劑量組進行OPLS-DA分析，結(jié)果見圖8-C、D。

圖6 酸棗仁總皂苷對失眠大鼠海馬組織中5-HT、GABA和NO水平的影響(, n = 6)

圖7 正 (A)、負(B) 離子模式下各組大鼠海馬樣品PCA分析

圖8 正 (A, C)、負離子 (B, D) 模式下各組大鼠海馬樣品的OPLS-DA得分圖、模型驗證圖及S-plot圖

3.5.3 海馬組織樣品差異代謝物的確定 將篩選得到的差異性代謝物與mzcloud、mzvault、HMDB等數(shù)據(jù)庫對化合物信息進行比對，共鑒定出18個差異代謝物。為了進一步分析模型組及各給藥組海馬組織樣品中18個內(nèi)源性差異代謝物的動態(tài)變化規(guī)律，將各組差異性代謝物的峰面積數(shù)據(jù)導入Graphpad軟件繪制箱圖，結(jié)果見圖9。與對照組比較，模型組10種氨基酸類（精氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、賴氨酸、色氨酸、組氨酸、焦谷氨酸、蘇氨酸）及2種酰胺類（谷氨酰胺、油酰胺）和其他類（二芐胺、膽堿、肌苷、胞嘧啶）共16種代謝物含量均顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），十六酰胺、十八烯酸2種差異代謝物含量顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，酸棗仁總皂苷低劑量組10種氨基酸、2種酰胺類代謝物和肌苷、胞嘧啶共14種差異代謝物含量顯著上調(diào)（＜0.05、0.01、0.001），十六酰胺、十八烯酸2種差異代謝物含量顯著下調(diào)（＜0.05、0.001）。

3.5.4 代謝通路分析 將酸棗仁總皂苷顯著回調(diào)的16種差異代謝物（精氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、賴氨酸、色氨酸、組氨酸、焦谷氨酸、蘇氨酸、油酰胺、谷氨酰胺、肌苷、胞嘧啶、十六酰胺、十八烯酸）分別導入MetaboAnalyst 5.0數(shù)據(jù)處理中心進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）代謝通路富集和網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，基于拓撲分析進行權(quán)重計算，通過對值、Holm、誤判率（FDR）及通路影響值的綜合分析，得到代謝通路富集氣泡圖，結(jié)果見圖10。酸棗仁總皂苷可通過7條主要代謝通路調(diào)控大鼠海馬代謝，最重要的是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成代謝通路，其通路影響值可達到1。其余比較關(guān)鍵的代謝通路按通路影響值由高到低排列依次為苯丙氨酸代謝、精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝、組氨酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等。本研究中所涉及到的代謝通路均是氨基酸代謝通路，提示酸棗仁總皂苷能夠調(diào)控海馬組織中氨基酸代謝水平。

圖9 各組大鼠海馬樣品差異代謝物的相對含量(, n = 6)

圖10 酸棗仁總皂苷調(diào)控的代謝通路圖

代謝組學結(jié)果表明，酸棗仁總皂苷能夠通過多種途徑調(diào)控失眠大鼠體內(nèi)異常代謝，主要涉及到7條主要相關(guān)氨基酸代謝通路，為了進一步明確酸棗仁總皂苷在體內(nèi)代謝機制，結(jié)合KEGG及相關(guān)富集分析方法，繪制代謝途徑網(wǎng)絡(luò)圖，見圖11。

4 討論

本研究建立PCPA大鼠失眠模型，利用曠場及Morris水迷宮等行為學實驗評價酸棗仁總皂苷對學習記憶損傷的藥效作用，采用HE染色法觀察大鼠海馬組織病理變化，ELISA測定海馬組織中5-HT、GABA及NO水平，并結(jié)合代謝組學技術(shù)對大鼠海馬組織代謝輪廓進行分析，采用多元統(tǒng)計分析篩選差異性代謝物，基于MetaboAnalyst 5.0數(shù)據(jù)庫進行代謝通路及代謝網(wǎng)絡(luò)分析，從多角度探索酸棗仁總皂苷改善失眠大鼠學習記憶損傷的作用途徑。

紫色為氨基酸，綠色為神經(jīng)遞質(zhì)及激素類物質(zhì)，紅色箭頭為酸棗仁總皂苷顯著上調(diào)的內(nèi)源性物質(zhì)

研究表明，慢波睡眠與快速眼動睡眠能夠鞏固學習記憶的形成，且與神經(jīng)遞質(zhì)水平的變化有關(guān)[41]。5-HT能夠參與機體睡眠-覺醒過程，并且與動物覺醒呈正相關(guān)，對慢波睡眠的發(fā)生和維持起著重要作用[42]，5-HT水平升高有利于維持睡眠狀態(tài)[43]，本研究結(jié)果顯示，酸棗仁總皂苷可通過上調(diào)海馬組織中5-HT水平維持睡眠狀態(tài)。GABA是抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，可阻斷中樞神經(jīng)興奮傳導和過度放電，當其表達下降時，促覺醒核團功能增強，誘發(fā)覺醒[44]。酸棗仁總皂苷能夠顯著上調(diào)海馬組織中GABA水平，從而發(fā)揮改善學習記憶的作用。NO能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放、突觸可塑性的發(fā)育，與學習記憶的形成過程有著緊密的聯(lián)系[45-46]。本研究表明酸棗仁總皂苷可顯著回調(diào)海馬組織中5-HT、GABA與NO水平，從而發(fā)揮直接改善學習記憶損傷的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，低、高劑量的酸棗仁總皂苷均能顯著減少大鼠曠場實驗的總路程，延長靜止時間，增加水迷宮指標中目標象限停留時間、平均速度及進入次數(shù)，提高海馬組織中5-HT、GABA、NO的水平，但低劑量組效果稍優(yōu)于高劑量組，為非線性量-效關(guān)系。中藥的內(nèi)在成分極其復(fù)雜，不符合中藥劑量-效應(yīng)關(guān)系，可能是中藥各種成分之間產(chǎn)生拮抗作用的結(jié)果，從而降低其藥理活性[47]。此外，中藥通常還具有雙向調(diào)節(jié)的作用，低劑量具有促進效應(yīng)，高劑量具有抑制效應(yīng)。研究表明，GABAA受體參與調(diào)節(jié)學習記憶[48]，酸棗仁皂苷B能激活GABAA受體的表達[49]，從而改善學習記憶，但高劑量的酸棗仁皂苷B會使GABAA過表達，造成學習記憶損傷[50]。因此，酸棗仁總皂苷改善學習記憶損傷未呈現(xiàn)量效關(guān)系可能是上述原因造成的。

苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成途徑是酸棗仁總皂苷調(diào)控海馬組織中最為主要的一條代謝途徑。苯丙氨酸和酪氨酸與體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平息息相關(guān)，苯丙氨酸可以經(jīng)過苯丙氨酸羥化酶的作用合成酪氨酸[51]，進而產(chǎn)生多巴胺、去甲腎上腺素以及腎上腺素，這些興奮性神經(jīng)遞質(zhì)均密切參與睡眠-覺醒過程，是引起失眠的重要神經(jīng)遞質(zhì)[52-53]。色氨酸是參與控制神經(jīng)中樞的重要代謝物，可由TPH催化合成重要的神經(jīng)遞質(zhì)5-HT[54]。本研究結(jié)果顯示，酸棗仁總皂苷可能通過苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成途徑，調(diào)控苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等氨基酸及代謝途徑的中間產(chǎn)物多巴胺、去甲腎上腺素等神經(jīng)遞質(zhì)水平改善失眠，進而改善模型動物的學習記憶損傷。

精氨酸與脯氨酸代謝途徑是調(diào)控學習記憶的重要途徑[55]。精氨酸是NO的直接前體，可促進腦內(nèi)神經(jīng)元型一氧化氮合酶、c-Fos的表達及新生神經(jīng)元的生成，增強學習記憶能力。NO作為重要的信號分子，介導、參與學習記憶相關(guān)的特定生理過程[56-57]。脯氨酸是組成酪氨酸激酶2（proline-rich tyrosine kinase 2，Pyk2）的重要氨基酸。Pyk2通過激活蛋白酪氨酸激酶通路，增強-甲基--天冬氨酸受體活性，使蛋白質(zhì)磷酸化增強，促使鈣離子大量流入突觸后神經(jīng)元，因而產(chǎn)生較強的興奮性突觸后電位，影響海馬突觸可塑性，進而改善記憶損傷[58]。本研究中酸棗仁總皂苷能夠顯著回調(diào)海馬組織中NO水平，上調(diào)精氨酸和脯氨酸的水平，進而改善失眠引起的記憶損傷。組氨酸代謝途徑是維持腦內(nèi)組胺穩(wěn)態(tài)的重要途徑[59]。組氨酸是組胺的前體，組胺是促進覺醒和維持覺醒狀態(tài)的一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。研究表明，下丘腦后部的結(jié)節(jié)乳頭體核內(nèi)組胺能神經(jīng)元具有促進和維持覺醒的作用[60]。組胺也可以通過增強基底核的膽堿能神經(jīng)的活性，增加海馬內(nèi)膽堿含量而改善認知能力[61]。本研究表明酸棗仁總皂苷可以顯著上調(diào)海馬組織中組氨酸水平，從而改善學習記憶損傷。

綜上所述，本研究采用PCPA復(fù)制失眠大鼠模型，整合藥效學和代謝組學的方法，從整體水平上探討了酸棗仁總皂苷改善失眠導致學習記憶損傷的作用機制。酸棗仁總皂苷能夠顯著回調(diào)水迷宮行為學指標，改善失眠引起的大鼠記憶損傷，并使海馬胞質(zhì)空泡化損傷恢復(fù)，顯著上調(diào)海馬組織中5-HT、GABA、NO水平，進而改善學習記憶損傷。此外，酸棗仁總皂苷能夠恢復(fù)PCPA引起的海馬中氨基酸代謝紊亂和代謝輪廓異常，進而發(fā)揮改善學習記憶損傷的作用。本研究在代謝層面發(fā)現(xiàn)調(diào)控學習記憶的氨基酸通路，并提供了代謝物類別和相對含量層面的信息。失眠模型動物海馬代謝譜的改變對研究失眠模型下的學習記憶損傷過程具有重要價值，但其代表的生物學意義仍需要謹慎解釋和驗證，需進一步在細胞、蛋白等分子水平上深入研究。本研究將為進一步深入探討酸棗仁總皂苷改善PCPA失眠大鼠學習記憶提供研究基礎(chǔ)，為酸棗仁總皂苷的新藥創(chuàng)制研究提供科學參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國藥典 [S]. 一部. 2020: 382.

[2] KIM J H. Chemical compounds in the seeds ofvar.[J]., 2016, 4(1): 13-28.

[3] Zhang F X, Li M, Qiao L R,. Rapid characterization ofby UPLC/Qtof MS with novel informatics platform and its application in evaluation of two seeds fromspecies [J]., 2016, 122: 59-80.

[4] 李旭, 和建政, 陳徹, 等. 酸棗仁鎮(zhèn)靜催眠活性成分及藥理作用研究進展 [J]. 中華中醫(yī)藥學刊, 2022, 40(2): 23-31.

[5] 任曉宇, 李廷利. 酸棗仁湯對慢性睡眠剝奪小鼠肝功能和特定腸道菌的影響[J]. 藥物評價研究, 2020, 43(2): 226-231.

[6] You Z L, Xia Q, Liang F R,. Effects on the expression of GABAA receptor subunits by jujuboside A treatment in rat hippocampal neurons [J]., 2010, 128(2): 419-423.

[7] Manayi A, Nabavi S M, Daglia M,. Natural terpenoids as a promising source for modulation of GABAergic system and treatment of neurological diseases [J]., 2016, 68(4): 671-679.

[8] Wang X X, Ma G J, Xie J B,. Influence of JuA in evoking communication changes between the small intestines and brain tissues of rats and the GABAA and GABAB receptor transcription levels of hippocampal neurons [J]., 2015, 159: 215-223.

[9] Liang Y, Yang X, Zhang X J,. Antidepressant-like effect of the saponins part of ethanol extract from SHF [J]., 2016, 191: 307-314.

[10] Fu Q, Yuan H M, Chen J,. Dammarane-type saponins fromjujube and their inhibitory effects against TNF-α release in LPS-induced RAW246.7 macrophages [J]., 2016, 16: 169-173.

[11] 杜晨暉, 裴香萍, 張敏, 等. 基于1H-NMR代謝組學的酸棗仁改善失眠大鼠睡眠作用機制研究[J]. 中草藥, 2019, 50(10): 2405-2412.

[12] 王俊秀. 中國睡眠研究報告 [M]. 北京: 社會科學文獻出版社, 2022: 11.

[13] Cordeira J, Kolluru S S, Rosenblatt H,. Learning and memory are impaired in the object recognition task during metestrus/diestrus and after sleep deprivation [J]., 2018, 339: 124-129.

[14] 李雪麗, 張斌. 睡眠障礙與焦慮抑郁障礙的聯(lián)系 [J]. 中國臨床醫(yī)生雜志, 2018, 46(2): 131-133.

[15] Lopez J, Roffwarg H P, Dreher A,. Rapid eye movement sleep deprivation decreases long-term potentiation stability and affects some glutamatergic signaling proteins during hippocampal development [J]., 2008, 153(1): 44-53.

[16] 劉雪平, 鄭敏, 郝躍偉, 等. 吡格列酮對胰島素抵抗大鼠認知功能及腦組織AGE-RAGE損傷途徑的影響 [J]. 山東大學學報: 醫(yī)學版, 2008, 46(10): 954-958.

[17] Gupta Y K, Gupta M, Kohli K. Neuroprotective role of melatonin in oxidative stress vulnerable brain [J]., 2003, 47(4): 373-386.

[18] Wadhwa M, Prabhakar A, Ray K,. Inhibiting the microglia activation improves the spatial memory and adult neurogenesis in rat hippocampus during 48 h of sleep deprivation [J]., 2017, 14(1): 222.

[19] 魏文靜, 仝立國, 仲啟明, 等. 蛇床子催眠活性組分對對氯苯丙氨酸致失眠大鼠海馬鐘基因與氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)表達的影響 [J]. 中草藥, 2018, 49(11): 2614-2619.

[20] Yan X D, Hu G Y, Yan W M,. Ginsenoside Rd promotes non-amyloidogenic pathway of amyloid precursor protein processing by regulating phosphorylation of estrogen receptor alpha [J]., 2017, 168: 16-23.

[21] 楊巖濤, 趙佳柱, 肖佳妹, 等. 人參皂苷治療阿爾茨海默病的藥理作用研究進展 [J]. 中國藥理學通報, 2021, 37(12): 1638-1643.

[22] Kopra J J, Panhelainen A, Af Bjerkén S,. Dampened amphetamine-stimulated behavior and altered dopamine transporter function in the absence of brain GDNF [J]., 2017, 37(6): 1581-1590.

[23] Yan S J, Li Z, Li H,. Notoginsenoside R1increases neuronal excitability and ameliorates synaptic and memory dysfunction following amyloid elevation [J]., 2014, 4: 6352.

[24] 范軍朝, 宋俊杰, 陳勇. 酸棗仁皂苷緩解阿爾茨海默病模型小鼠的機制研究 [J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2020, 30(9): 32-37.

[25] 朱潔, 蔡玉芳, 袁紅衛(wèi), 等. 酸棗仁皂苷對Alzheimer病大鼠認知功能障礙改善的實驗研究 [J]. 江西中醫(yī)藥大學學報, 2017, 29(5): 74-76.

[26] 全世建, 林杏娥, 劉妮. PCPA大鼠失眠模型的證候?qū)傩匝芯?[J]. 中醫(yī)藥學刊, 2006, 24(3): 450-451.

[27] 任俊華. 基于質(zhì)譜分析技術(shù)的針刺對失眠模型大鼠腦組織蛋白差異表達的研究 [D]. 鄭州: 河南中醫(yī)學院, 2014.

[28] Borbély A A, Neuhaus H U, Tobler I. Effect of-chlorophenylalanine and tryptophan on sleep, EEG and motor activity in the rat [J]., 1981, 2(1): 1-22.

[29] 夏天吉, 閆明珠, 王智, 等. 大小鼠失眠模型和評價方法研究進展 [J]. 中國實驗動物學報, 2022, 30(3): 428-435.

[30] Nieto R, Kukuljan M, Silva H. BDNF and schizophrenia: From neurodevelopment to neuronal plasticity, learning, and memory [J]., 2013, 4: 45.

[31] Hua Y, Guo S, Xie H,.mill. var.(Bunge) Hu ex H. F. Chou seed ameliorates insomnia in rats by regulating metabolomics and intestinal flora composition [J]., 2021, 12: 653767.

[32] Yan Y, Li Q, Du H Z,. Determination of five neurotransmitters in the rat brain for the study of the hypnotic effects ofaqueous extract on insomnia rat model by UPLC-MS/MS [J]., 2019, 17(7): 551-560.

[33] Murray N M, Buchanan G F, Richerson G B. Insomnia caused by serotonin depletion is due to hypothermia [J]., 2015, 38(12): 1985-1993.

[34] Persico A M, Altamura C, Calia E,. Serotonin depletion and barrel cortex development: Impact of growth impairment vs. serotonin effects on thalamocortical endings [J]., 2000, 10(2): 181-191.

[35] 王金鑫, 惠洋, 高旭. 成體海馬神經(jīng)再生與神經(jīng)退行性疾病 [J]. 國際遺傳學雜志, 2018, 41(3): 207-211.

[36] Díaz A, de Jesús L, Mendieta L,. The amyloid-beta25-35 injection into the CA1 region of the neonatal rat hippocampus impairs the long-term memory because of an increase of nitric oxide [J]., 2010, 468(2): 151-155.

[37] 郭杰, 尹曉剛. 酸棗仁湯對老年失眠模型大鼠學習記憶能力及腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響 [J]. 中國藥房, 2016, 27(22): 3085-3087.

[38] 孟勝喜, 霍清萍, 王兵, 等. 恒清II號方對阿爾茨海默病小鼠認知功能和糞便代謝組學影響研究 [J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2020, 29(24): 2628-2634.

[39] 邵曉妮, 黑亞南, 孫英凱, 等. 高尿酸血癥認知功能障礙模型大鼠皮層和海馬的代謝組學研究 [J]. 中國藥理學通報, 2021, 37(2): 196-202.

[40] 崔小芳. 酸棗仁總皂苷的腸道菌群體外代謝轉(zhuǎn)化研究 [D]. 太原: 山西中醫(yī)藥大學, 2020.

[41] Venner A, de Luca R, Sohn L T,. An inhibitory lateral hypothalamic-preoptic circuit mediates rapid arousals from sleep [J]., 2019, 29(24): 4155-4168.e5.

[42] 胡文卓, 賈力莉, 馬瀾, 等. 佛手柑內(nèi)酯對PCPA失眠大鼠神經(jīng)遞質(zhì)及學習記憶的影響 [J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2020, 31(4): 821-823.

[43] 王婷婷, 郝蕾, 王芮, 等. 酸棗仁-延胡索配伍對肝郁型失眠小鼠的作用及機制研究 [J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2021, 32(5): 619-626.

[44] 劉靜, 郭欣, 黃娜娜, 等. 柴胡桂枝干姜湯治療失眠的功效網(wǎng)絡(luò)研究[J]. 中草藥, 2019, 50(21): 5145-5153.

[45] Moosavi M, Abbasi L, Zarifkar A,. The role of nitric oxide in spatial memory stages, hippocampal ERK and CaMKII phosphorylation [J]., 2014, 122: 164-172.

[46] Sestakova N, Puzserova A, Kluknavsky M,. Determination of motor activity and anxiety-related behaviour in rodents: Methodological aspects and role of nitric oxide [J]., 2013, 6(3): 126-135.

[47] 何婷, 趙薇, 華國棟. 從中藥量效關(guān)系論臨床用藥劑量的適當性 [J]. 現(xiàn)代中醫(yī)臨床, 2014, 21(6): 37-39.

[48] Liu Y, Zong X D, Huang J,. Ginsenoside Rb1regulates prefrontal cortical GABAergic transmission in MPTP-treated mice [J]., 2019, 11(14): 5008-5034.

[49] Song P P, Zhang Y, Ma G J,. Gastrointestinal absorption and metabolic dynamics of jujuboside A, A saponin derived from the seed of[J]., 2017, 65(38): 8331-8339.

[50] Amani M, Mohammadian F, Golitabari N,. Postnatal GABA A receptor activation alters synaptic plasticity and cognition in adult wistar rats [J]., 2022, 59(6): 3585-3599.

[51] 鄧媛媛, 王軍, 姚佳希, 等. 雙酚S暴露對小鼠腦-腸-菌軸神經(jīng)遞質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)的影響 [J]. 南京醫(yī)科大學學報: 自然科學版, 2020, 40(5): 663-668.

[52] Xiao F, Du Y, Lv Z Q,. Effects of essential amino acids on lipid metabolism in mice and humans [J]., 2016, 57(4): 223-231.

[53] Trushina E, Dutta T, Persson X M T,. Identification of altered metabolic pathways in plasma and CSF in mild cognitive impairment and Alzheimer’s disease using metabolomics [J]., 2013, 8(5): e63644.

[54] 周恩, 朱磊, 沈洪. 中醫(yī)藥對色氨酸代謝的研究進展 [J]. 中醫(yī)藥臨床雜志, 2022, 34(3): 580-585.

[55] Lv X F, Feng Y Y, Ma R,. Effects of peppermint essential oil on learning and memory ability in APP/PS1transgenic mice [J]., 2022, 27(7): 2051.

[56] 淮盼盼, 趙建強, 王奕, 等. 長時間應(yīng)用大劑量的左旋精氨酸對幼鼠學習記憶功能和神經(jīng)系統(tǒng)可塑性的抑制作用 [J]. 山西醫(yī)科大學學報, 2011, 42(11): 864-868.

[57] 呂夢, 王雅澤, 趙迪, 等. 基于糞便代謝組學技術(shù)的逍遙散抗抑郁作用機制研究 [J]. 中草藥, 2020, 51(13): 3482-3492.

[58] 杜雨生, 張釗, 何新. 富含脯氨酸的酪氨酸激酶2與突觸可塑性 [J]. 中國藥理學與毒理學雜志, 2019, 33(10): 860.

[59] Mahmood D. Histamine H3receptors and its antagonism as a novel mechanism for antipsychotic effect: A current preclinical & clinical perspective [J]., 2016, 10(4): 564-575.

[60] Chen Z, Shen Y J. Effects of brain histamine on memory deficit induced by nucleus basalis-lesion in rats [J]., 2002, 23(1): 66-70.

[61] 何超. 組胺促覺醒系統(tǒng)對內(nèi)嗅皮層神經(jīng)元活動的調(diào)控及空間學習記憶的影響 [D]. 重慶: 第三軍醫(yī)大學, 2015.

Mechanism of total saponins ofon learning and memory impairment in-4-chlorophenylalanine-induced insomnia rats

HENG Yi-ran1, DUAN Hui-zhu1, DU He1, YAN Yan2, DU Chen-hui1

1. School of Chinese Medicine and Food Engineering, Shanxi University of Chinese Medicine, Taiyuan 030619, China 2. Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, Shanxi University, Taiyuan 030006, China

To study the effect of total saponins of Suanzaoren (, SZSS) on endogenous metabolites in insomnia model rats based on metabolomics, and explore the effect and mechanism of SZSS on learning and memory.-4-chlorophenylalanine (PCPA) was used to induce insomnia model in rats, diazepam and SZSS were given for intervention. Open field experiment and Morris water maze experiment were carried out; Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the pathological changes of hippocampus; Levels of 5- hydroxytryptamine (5-HT), γ-aminobutyric acid (GABA) and NO (nitric oxide) in hippocampus were measured by ELISA. UPLC-Orbitrap-MS/MS was used to analyze the metabolic profile of hippocampus, combined with multivariate statistical analysis to screen out the different metabolites, and based on MetaboAnalyst 5.0 database, metabolic pathway and metabolic network were analyzed, metabolic characteristics and action ways of SZSS to improve learning and memory were discussed from various angles.Compared with model group, learning ability of rats in SZSS group was significantly improved (< 0.05, 0.01), pathological structure of hippocampus was significantly improved, levels of 5-HT, GABA and NO in hippocampus were significantly increased (< 0.05, 0.01). A total of 18 potential biomarkers related to learning and memory impairment had been identified by metabonomics. SZSS mainly played a role in improving memory impairment through seven major amino acid metabolic pathways such as phenylalanine, tyrosine and tryptophan.SZSS can improve the learning and memory loss caused by insomnia by regulating endogenous differential metabolites in hippocampus and regulating related amino acid metabolic pathways.

total saponins of; insomnia; learning and memory; hippocampus; differential metabolites

R285.5

A

0253 - 2670(2022)21 - 6759 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.21.013

2022-07-15

山西省科技廳中央引導地方科技發(fā)展資金項目（YDZJSX2021C025）；山西省自然科學基金面上項目（20210302123237，20210302123470）；山西省衛(wèi)生健康委“十大晉藥”項目（ZYCZL2020007）；山西中醫(yī)藥大學青年科學家培育項目（2021PY-QN-07）

衡依然（1995—），女，碩士研究生，研究方向為中藥新產(chǎn)品開發(fā)與利用。Tel: 18622138832 E-mail: hengyiran1@163.com

閆 艷，副教授，博士，研究方向為中藥質(zhì)量控制及中藥體內(nèi)過程分析。Tel: (0351)7018379 E-mail: yanyan520@sxu.edu.cn

杜晨暉，教授，博士，研究方向為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。Tel: (0351)179982 E-mail: dch@sxtcm.edu.cn

[責任編輯 李亞楠]