HPLC-PDA聯(lián)合Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選五苓散低極性部位提取工藝

王慧森，劉 明，李更生，梁瑞峰，葛文靜，夏書梼

HPLC-PDA聯(lián)合Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選五苓散低極性部位提取工藝

王慧森1，劉 明1，李更生1，梁瑞峰1，葛文靜1，夏書梼2

1. 河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004 2. 鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院，河南 鄭州 450052

應(yīng)用HPLC-PDA聯(lián)合響應(yīng)曲面法，篩選五苓散低極性部位乙醇提取最佳工藝。采用多波長切換定量測定，以23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、麥角甾醇、茯苓酸、白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯II、白術(shù)內(nèi)酯III、肉桂酸、桂皮醛9種有效成分為評價指標(biāo)，采用Box-Behnken響應(yīng)曲面法考察提取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間對提取工藝的影響，確定最佳工藝。色譜柱為Agilent Proshell 120 EC-C18柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm），體積流量為0.8 mL/min，柱溫為40 ℃。流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～10 min，37%～60%乙腈；10～20 min，60%乙腈；20～23 min，60%～95%乙腈；23～36 min，95%乙腈；36～37 min，95%～37%乙腈；37～42 min，37%乙腈。檢測波長為280、247、220、208 nm多波長切換。最佳提取工藝為10倍量75%乙醇提取2次，每次1.5 h。建立的HPLC-PDA法穩(wěn)定可行，適合多種成分同時測定。響應(yīng)曲面法所建模型準(zhǔn)確，可以較好地預(yù)測9種成分含量綜合評分；優(yōu)選的提取工藝方法重現(xiàn)性良好，穩(wěn)定可行，為五苓散臨床應(yīng)用、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究和新藥開發(fā)提供技術(shù)參考。

五苓散；提取工藝；HPLC-PDA；響應(yīng)曲面法；多指標(biāo)綜合評價；23-乙酰澤瀉醇B；23-乙酰澤瀉醇C；麥角甾醇；茯苓酸；白術(shù)內(nèi)酯I；白術(shù)內(nèi)酯II；白術(shù)內(nèi)酯III；肉桂酸；桂皮醛

五苓散（Wuling Powder）出自東漢末年名醫(yī)張仲景的《傷寒論》，由澤瀉、豬苓、茯苓、白術(shù)、桂枝5味藥組成，為中藥利水滲濕劑代表方；具有利水滲濕、溫陽化氣的功效[1]；可用于治療膀胱蓄水證、水逆證和津虧液燥證[2]?，F(xiàn)代臨床應(yīng)用和藥理研究表明，五苓散對改善泌尿系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)[3]、腹水[4]、骨質(zhì)疏松[5]等疾病的臨床癥狀、相關(guān)指標(biāo)等有明顯的優(yōu)勢和應(yīng)用前景。醫(yī)家張仲景臨床遣方用藥多以湯劑為主，但經(jīng)臨床療效反復(fù)實踐宜散不宜湯有其科學(xué)內(nèi)涵。有文獻報道[6]，對41例五苓方湯劑和散劑治療水濕內(nèi)停證患者的隨機對照臨床研究，結(jié)果顯示五苓方散劑組的療效顯著優(yōu)于湯劑組。該作者進一步對五苓方湯劑和散劑的化學(xué)成分進行比較研究發(fā)現(xiàn)，湯劑的一組非揮發(fā)低極性分子僅為其同方散劑1/450，可見低極性部位成分是該復(fù)方不可缺少的重要藥效物質(zhì)[7]。有關(guān)五苓散化學(xué)成分的報道目前多集中在各單味藥材上，而對復(fù)方整體研究則較少。文獻報道有檢測五苓散復(fù)方中桂皮醛含量[8]，單味藥材澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇C含量[8-10]，豬苓中麥角甾醇含量[8]，茯苓中茯苓酸含量[11-12]，白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯I、II、III含量[13-14]，桂枝中桂皮醛、肉桂酸含量測定[15]等，未見五苓散HPLC多個成分同時測定的研究報道。本研究以五苓散中活性代表成分23-乙酰澤瀉醇B[16-18]、23-乙酰澤瀉醇C[17-19]、麥角甾醇[20]、茯苓酸[21-22]、白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯II、白術(shù)內(nèi)酯III[23-24]、桂皮醛[25]、肉桂酸[26]等為指標(biāo)成分，建立穩(wěn)定可行的多波長切換同時測定方中9種成分含量的HPLC-PDA方法。采用響應(yīng)曲面法（response surface methodology）以多指標(biāo)量化綜合評分結(jié)合出膏率篩選五苓散乙醇提取最佳方案，為中藥新藥開發(fā)及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)參考。

1 儀器和材料

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀，2996 PDA檢測器，美國Waters公司；AUY120型萬分之一電子天平，日本島津公司；AE240型十萬分之一電子天平，瑞士梅特勒托利多公司；UL UP-IV-10T超純水器，四川優(yōu)普；SB-5200DTD超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；FW100型高速萬能粉碎機，北京科偉永興儀器有限公司；DZKW-2型電熱恒溫水浴鍋，北京用光明醫(yī)療儀器廠；DHG型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.2 試劑

對照品麥角甾醇（批號111845-201604）、23-乙酰澤瀉醇B（批號111846-201504）、23-乙酰澤瀉醇C（批號112062-202001）、白術(shù)內(nèi)酯I（批號111975-201501）、白術(shù)內(nèi)酯II（批號111976-201501）、白術(shù)內(nèi)酯III（批號111978-201501）、肉桂酸（批號110788-201604）、桂皮醛（批號110710-202022），質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%，購自中國食品藥品檢定研究院；對照品茯苓酸，批號Y15A7511814，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，購自上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲醇，色譜級，美國Fisher公司；磷酸，色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙醇，分析純，上海永大化學(xué)試劑有限公司；水為超純水。

1.3 藥材

澤瀉（批號20090104）、豬苓（批號20130101）、茯苓（批號20110102）、白術(shù)（批號20090201）、桂枝（批號20110201）飲片購自河南省鄭州市瑞龍制藥股份有限公司，經(jīng)河南省中醫(yī)藥研究院李更生研究員鑒定，澤瀉為澤瀉科澤瀉屬植物澤瀉-Linn.的干燥塊莖、豬苓為多孔菌科多孔菌屬真菌豬苓(Pers.) Fries的干燥菌核、茯苓為多孔菌科茯苓屬真菌茯苓(Schw.) Wolf的干燥菌核、白術(shù)為菊科蒼術(shù)屬植物白術(shù)Koidz.的干燥根莖、桂枝為樟科樟屬植物肉桂Presl的干燥嫩枝經(jīng)加工制成的飲片。

2 方法與結(jié)果

2.1 五苓散提取液中9種指標(biāo)成分定量測定及綜合評價指標(biāo)確定

2.1.1 色譜條件色譜柱為Agilent Proshell 120 EC-C18柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm），體積流量為0.8 mL/min，柱溫為40 ℃。流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～10 min，37%～60%乙腈；10～20 min，60%乙腈；20～23 min，60%～95%乙腈；23～36 min，95%乙腈；36～37 min，95%～37%乙腈；37～42 min，37%乙腈。檢測波長為280 nm（測定麥角甾醇、白術(shù)內(nèi)酯I、肉桂酸和桂皮醛）、247 nm（測定23-乙酰澤瀉醇C）、220 nm（測定白術(shù)內(nèi)酯II、白術(shù)內(nèi)酯III）、208 nm（測定23-乙酰澤瀉醇B、茯苓酸）。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、麥角甾醇、茯苓酸、白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯II、白術(shù)內(nèi)酯III、肉桂酸、桂皮醛對照品適量，加乙腈溶解定容，制成對照品母液。分別吸取對照品母液各0.5 mL加入超純水定容至10 mL，混勻，制成含23-乙酰澤瀉醇B 59.4 μg/mL、23-乙酰澤瀉醇C 23.0 μg/mL、麥角甾醇20.3 μg/mL、茯苓酸50.2 μg/mL、白術(shù)內(nèi)酯I 10.1 μg/mL、白術(shù)內(nèi)酯II 14.4 μg/mL、白術(shù)內(nèi)酯III 20.3 μg/mL、肉桂酸20.3 μg/mL、桂皮醛513.4 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 樣品及供試品溶液的制備

（1）五苓散的制備：取五苓散處方各藥味粉碎過80目篩，按處方比例（澤瀉15 g、豬苓9 g、茯苓9 g、白術(shù)9 g、桂枝6 g）稱取各藥味細粉適量，均勻混合制成干燥粉末狀制劑，備用。

（2）供試品溶液的制備：根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，按照Design-Expert V8.0.6軟件設(shè)計3因素3水平共17組試驗方案回流提取，每組提取藥液冷卻至室溫，分別混合均勻，濾過，低溫（60 ℃以下）真空濃縮至適量，作為1～17號樣品溶液，分別取樣品溶液10 mL，蒸干，殘渣用40%乙腈溶解，定容至10 mL，0.22 μm 微孔濾膜濾過，制得供試品溶液，備用。

（3）陰性對照樣品溶液的制備：按照供試品溶液的制備方法，分別制備缺桂枝、缺白術(shù)、缺澤瀉、缺茯苓、缺豬苓的陰性對照樣品溶液。

2.1.4 方法學(xué)考察

（1）系統(tǒng)適應(yīng)性試驗和專屬性試驗：分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及各陰性對照樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定。結(jié)果表明23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、麥角甾醇、茯苓酸、白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯II、白術(shù)內(nèi)酯III、肉桂酸、桂皮醛的保留時間依次為24.364、10.339、36.010、24.986、14.340、11.496、8.035、3.357、4.578 min。樣品和對照品對應(yīng)峰最大吸收波長分別為麥角甾醇、白術(shù)內(nèi)酯I、肉桂酸、桂皮醛為280 nm，23-乙酰澤瀉醇C為247 nm，白術(shù)內(nèi)酯II、白術(shù)內(nèi)酯III為220 nm，23-乙酰澤瀉醇B、茯苓酸為208 nm。各對照品與供試品溶液中其他組分色譜峰分離度良好（＞1.5）。各陰性樣品色譜圖中未見所缺中藥藥味對照品。色譜圖見圖1。

1-肉桂酸 2-桂皮醛 3-白術(shù)內(nèi)酯III 4-23-乙酰澤瀉醇C 5-白術(shù)內(nèi)酯II 6-白術(shù)內(nèi)酯I 7-23-乙酰澤瀉醇B 8-茯苓酸 9-麥角甾醇

（2）線性關(guān)系考察：將“2.1.2”項下各對照品配成系列混合對照品溶液，質(zhì)量濃度分別為23-乙酰澤瀉醇B 5.94、11.88、17.82、23.76、29.70、35.64 μg/mL；23-乙酰澤瀉醇C 2.3、4.6、6.9、9.2、11.5、13.8 μg/mL；麥角甾醇2.028、4.056、6.084、8.112、10.140、12.168 μg/mL；茯苓酸5.02、10.04、15.06、20.08、25.10、30.12 μg/mL；白術(shù)內(nèi)酯I 1.008、2.016、3.024、4.032、5.04、6.048 μg/mL；白術(shù)內(nèi)酯II 1.438、2.875、4.313、5.750、7.188、8.626 μg/mL；白術(shù)內(nèi)酯III 2.034、4.068、6.102、8.136、10.170、12.204 μg/mL；肉桂酸2.03、4.06、6.09、8.12、10.15、12.18 μg/mL；桂皮醛0.051 3、0.102 6、0.153 9、0.205 2、0.256 5、0.307 8 mg/mL。按“2.1.1”項下色譜條件各進樣10 μL，測定各指標(biāo)成分峰面積。將所得峰面積（）與各對照品的質(zhì)量濃度（）進行線性回歸，得回歸方程、相關(guān)系數(shù)（）及線性范圍分別為23-乙酰澤瀉醇B＝1 106 808－24 587，＝0.999 0，線性范圍5.94～35.64 μg/mL；23-乙酰澤瀉醇C＝1 873 745－23 870，＝0.999 1，線性范圍2.3～13.8 μg/mL；麥角甾醇＝1 142 505－16 276，＝0.999 2，線性范圍2.028～12.168 μg/mL；茯苓酸＝1 029 570－34 749，＝0.999 3，線性范圍5.02～30.12 μg/mL；白術(shù)內(nèi)酯I＝6 268 197－11 847，＝0.999 2，線性范圍1.008～6.048 μg/mL；白術(shù)內(nèi)酯II＝5 868 314－52 321，＝0.999 1，線性范圍1.432～8.628 μg/mL；白術(shù)內(nèi)酯III＝3 378 531－37 521，＝0.999 3，線性范圍2.034～12.204 μg/mL；肉桂酸＝18 026 680－194 351，＝0.999 3，線性范圍2.03～12.18 μg/mL；桂皮醛＝7 673 681－702 666，＝0.999 2，線性范圍51.34～308.04 μg/mL。

（3）精密度考察：取“2.1.2”項下混合對照品溶液及“2.1.3”項下3號供試品溶液分別重復(fù)進樣6次，進行精密度試驗，結(jié)果各成分在對照品溶液和供試品溶液中峰面積的RSD分別為23-乙酰澤瀉醇B為2.49%及0.93%、23-乙酰澤瀉醇C為2.34%及3.05%、麥角甾醇為1.53%及1.20%、茯苓酸為1.93%及0.56%、白術(shù)內(nèi)酯I為0.79%及3.07%、白術(shù)內(nèi)酯II為1.01%及3.08%、白術(shù)內(nèi)酯III為0.67%及3.05%、肉桂酸為1.85%及2.74%、桂皮醛為1.92%及3.04%，結(jié)果可見精密度良好。

（4）穩(wěn)定性考察：分別于0、2、4、6、12、24 h測定同一份供試品溶液（“2.1.3”項下3號供試品）穩(wěn)定性，測得各成分峰面積，計算峰面積RSD分別為23-乙酰澤瀉醇B 1.96%、23-乙酰澤瀉醇C 1.65%、麥角甾醇1.16%、茯苓酸1.74%、白術(shù)內(nèi)酯I 1.59%、白術(shù)內(nèi)酯II 1.69%、白術(shù)內(nèi)酯III 1.37%、肉桂酸0.90%、桂皮醛為1.57%，結(jié)果可見供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（5）重復(fù)性考察：取同一樣品（“2.1.3”項下3號樣品）平行6份，依法制得供試品溶液。分別精密量取10 μL，按前述色譜條件進樣，測定，分別計算各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD，結(jié)果23-乙酰澤瀉醇B的RSD為1.72%，23-乙酰澤瀉醇C的RSD為1.53%，麥角甾醇的RSD為1.12%，茯苓酸的RSD為1.78%，白術(shù)內(nèi)酯I的RSD為1.13%，白術(shù)內(nèi)酯II的RSD為1.87%、白術(shù)內(nèi)酯III的RSD為1.69%、肉桂酸的RSD為1.82%、桂皮醛的RSD為1.88%，結(jié)果可見本測定方法重現(xiàn)性良好。

（6）加樣回收率試驗：精密量取“2.1.3”項下3號樣品溶液平行6份，按各指標(biāo)成分含量約1∶1精密加入對照品，按“2.1.1”項下色譜條件測定各指標(biāo)成分的含量。計算回收率和RSD值。結(jié)果各指標(biāo)成分回收率和RSD值分別為23-乙酰澤瀉醇B 99.12%、1.81%；23-乙酰澤瀉醇C 102.05%、1.83%；麥角甾醇99.88%、1.68%；茯苓酸100.47%、1.65%，白術(shù)內(nèi)酯I 100.28%、1.95%，白術(shù)內(nèi)酯II 97.34%、1.32%，白術(shù)內(nèi)酯III 101.32%、1.18%，肉桂酸97.21%、1.89%，桂皮醛99.51%、1.84%。

2.1.5 樣品測定 精密吸取單因素及響應(yīng)曲面試驗樣品溶液，按照“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，“2.1.1”色譜條件進樣測定。計算樣品中23-乙酰澤瀉醇B等9種成分含量。

2.1.6 五苓散中9種成分綜合評分 采用多指標(biāo)-響應(yīng)曲面法進行綜合評價，依據(jù)處方配伍君臣佐使及各藥味成分藥理活性進行各個指標(biāo)成分權(quán)重分配，綜合評分＝23-乙酰澤瀉醇B得分×25%＋23-乙酰澤瀉醇C得分×25%＋麥角甾醇得分×22.5%＋茯苓酸得分×22.5%＋白術(shù)內(nèi)酯I得分×1%＋白術(shù)內(nèi)酯II得分×1%＋白術(shù)內(nèi)酯III得分×1%＋肉桂酸得分×1%＋桂皮醛得分×1%。指標(biāo)成分得分＝該指標(biāo)含量/該指標(biāo)組最高含量。本實驗單因素和響應(yīng)曲面實驗結(jié)果均以綜合評分進行分析。

2.2 五苓散乙醇提取液出膏率的測定

精密吸取單因素或響應(yīng)曲面試驗樣品溶液20 mL置于恒定質(zhì)量蒸發(fā)皿中，水浴揮干，置于105 ℃烘箱干燥至恒定質(zhì)量，放至室溫迅速稱定質(zhì)量，計算出膏率。

2.3 影響五苓散醇提工藝的單因素考察試驗

2.3.1 提取溶媒乙醇體積分?jǐn)?shù)的考察 按處方比例稱取五苓散各藥味細粉共計48 g混勻，分別加入10倍量不同體積分?jǐn)?shù)乙醇超聲處理30 min，提取液濾過，取濾液按“2.1.1”項下色譜條件測定各指標(biāo)成分的含量，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對各指標(biāo)成分影響。結(jié)果見表1。各成分提取量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)提高而增大，55%～95%乙醇時9種成分均可以提出且綜合評分具有較優(yōu)值，考慮到提取過程的安全性，大量提取時乙醇體積分?jǐn)?shù)不宜過高，故取55%、70%、85%乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)3個點進行響應(yīng)曲面實驗。

2.3.2 提取時間的考察 按處方比例稱取五苓散各藥味細粉共計48 g混勻，取6份分別加入10倍量75%乙醇回流提取20、40、60、80、100、120 min，提取液放涼濾過，取濾液按“2.1.1”項下色譜條件測定各指標(biāo)成分的含量，考察提取時間對各指標(biāo)成分影響。結(jié)果見表2。各成分提取量隨提取時間增加而增大，在40～120 min時9種成分均有較高提取量且綜合評分具有較優(yōu)值，故取40、80、120 min 3個點進行響應(yīng)曲面實驗。

表1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對各成分含量及綜合評分的影響

Table 1 Effect of ethanol concentration the content of each component and comprehensive score

乙醇/%質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg?g?1)綜合評分 桂皮醛白術(shù)內(nèi)酯III23-乙酰澤瀉醇C白術(shù)內(nèi)酯II白術(shù)內(nèi)酯I23-乙酰澤瀉醇B茯苓酸麥角甾醇 150.8140.027 50.047 30.017 20.010 6???0.151 351.8300.037 20.079 40.060 60.018 10.2790.111?0.526 552.2990.044 50.087 20.083 40.023 00.3970.2310.0270.763 752.4520.080 80.088 60.083 10.033 90.4210.2420.2030.982 952.2300.063 80.073 00.083 80.031 30.4120.2460.2170.947

表2 提取時間對各成分含量及綜合評分的影響

Table 2 Effect of extraction time on content of each component and comprehensive score

提取時間/min質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg?g?1)綜合評分 桂皮醛白術(shù)內(nèi)酯III23-乙酰澤瀉醇C白術(shù)內(nèi)酯II白術(shù)內(nèi)酯I23-乙酰澤瀉醇B茯苓酸麥角甾醇 201.990.1150.050 90.070 30.013 10.3120.2070.2550.797 402.250.1120.055 00.071 80.013 70.3370.2420.3300.883 602.270.1080.054 70.070 80.012 80.3130.2790.3390.875 802.750.1100.057 20.073 10.013 40.3360.3890.3880.975 1003.52 0.1200.057 50.073 80.014 40.3290.3700.3780.980 1201.94 0.1320.051 10.073 00.013 50.2710.3670.3660.881

2.3.3 提取溶媒液料比的選擇 藥材質(zhì)地不同蓬松度和吸水率不同，很大程度影響藥材提取時液料比的選擇。經(jīng)實驗藥粉加入定量75%乙醇浸泡1 h，考察吸水率約為220%。藥材粉碎后蓬松度降低且考慮到大量提取后期濃縮，故響應(yīng)面實驗時選擇液料比范圍在6～12倍量，同時第1次提取時考慮吸水率多加入2倍量提取溶媒。

2.3.4 提取次數(shù)考察 按處方比例稱取五苓散各藥味共計48 g粉碎混勻，加入75%乙醇回流提取5次，第1次10倍量，其余8倍量，每次提取90 min。平行操作3份。每次提取液分別濾過，取濾液20 mL置于恒定質(zhì)量蒸發(fā)皿中，水浴揮干乙醇，置于105 ℃烘箱干燥至恒定質(zhì)量，放至室溫迅速稱定質(zhì)量，考察不同提取次數(shù)干膏量，計算出膏率。結(jié)果提取液平均出膏率第1～5次分別為12.33%、2.06%、1.15%、0.50%、0.27%，可見提取液總出膏率16.31%，前2次提取液總出膏率14.39%占5次總提取量的近90%，故選擇確定提取次數(shù)為2次。

2.4 響應(yīng)曲面實驗

2.4.1 響應(yīng)面法試驗設(shè)計與實驗結(jié)果 結(jié)合上述單因素實驗結(jié)果，以提取時間（1）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（2）、液料比（3）為3個考察因素，以23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、麥角甾醇、茯苓酸、白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯II、白術(shù)內(nèi)酯III、肉桂酸、桂皮醛9種成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的綜合評分和出膏率為響應(yīng)值，按處方比例稱取五苓散各藥味共計48 g粉碎混勻，平行制成17份試驗樣品，設(shè)計3因素3水平試驗設(shè)計方案，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計，經(jīng)Design-Expert V8.0.6軟件分析處理，設(shè)計3因素3水平17組試驗，試驗方案及結(jié)果見表3。

2.4.2 實驗結(jié)果分析 應(yīng)用Design-Expert.V8.0.6軟件對五苓散乙醇提取工藝實驗數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果如下：9種成分提出量的綜合得分對1、2、3的2次多元回歸模型方程為綜合評分＝0.93＋0.0171＋0.0502＋0.0493＋6.200×10?312－0.01313－1.550×10?323－0.06412－0.07622－0.22032，回歸模型方差分析結(jié)果見表4。五苓散乙醇提取工藝的回歸模型＝40.66，＝0.001＜0.05，結(jié)果表明2次多元回歸模型顯著，模型系數(shù)2＝0.981 2，adj2＝0.957 1，變異系數(shù)（CV）＝3.78%，結(jié)果表明模型擬合良好；失擬＝2.05，＝0.249 2＞0.05，模型失擬度不顯著，結(jié)果表明模型選擇合適，可用于五苓散乙醇提取工藝分析。1次項2、3對模型有顯著影響，交互項均未有顯著影響，2次項均有顯著影響。

表3 五苓散乙醇提取響應(yīng)曲面實驗設(shè)計與結(jié)果

Table 3 Design and results of response surface test of Wuling Powder extracted by ethanol

序號X1/minX2/%X3/倍質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg?g?1)綜合評分出膏率/% 肉桂酸桂皮醛白術(shù)內(nèi)酯III23-乙酰澤瀉醇C白術(shù)內(nèi)酯II白術(shù)內(nèi)酯I23-乙酰澤瀉醇B茯苓酸麥角甾醇 1807090.042.250.050.070.100.040.511.610.260.899 415.91 21207060.031.470.040.050.060.020.361.130.180.640 015.30 3807090.042.150.070.070.100.040.551.860.260.947 515.98 41208590.041.840.050.060.080.030.501.650.230.842 915.79 51205590.042.130.030.070.070.030.471.590.100.730 615.45 612070120.031.730.040.050.090.030.421.350.210.726 915.73 7807090.042.120.070.070.090.040.541.760.250.919 415.87 8805560.031.460.040.060.060.020.391.070.040.542 215.55 9408590.042.090.070.060.100.040.561.470.210.836 614.81 10407060.031.430.080.050.120.050.210.850.180.542 314.38 118055120.031.620.030.050.050.010.411.360.110.627 815.27 12807090.042.150.080.070.090.040.531.800.250.923 415.75 13808560.031.470.050.050.060.030.381.140.180.646 315.44 14807090.042.120.060.080.090.030.551.730.270.959 715.92 158085120.031.690.030.060.050.020.391.430.210.725 715.77 16405590.042.080.050.070.090.040.511.620.080.749 114.55 174070120.031.750.060.050.070.030.401.510.150.680 314.67

表4 五苓散乙醇提取工藝回歸模型方差分析結(jié)果

Table 4 Results of variance analysis of regression model of Wuling Powder extracted by ethanol

來源9種成分綜合評分出膏率 平方和自由度離差平方和F值P值平方和自由度離差平方和F值P值 模型0.30090.03440.660＜0.000 14.21090.47035.490＜0.000 1 X12.180×10?312.180×10?32.6400.148 51.86011.860141.410＜0.000 1 X20.02010.02024.3900.001 70.12010.1209.3000.018 6 X30.01910.01922.9700.002 00.07410.0745.6300.049 5 X1X21.540×10?411.540×10?40.1900.679 41.600×10?311.600×10?30.1200.737 7 X1X36.530×10?416.530×10?40.7900.403 94.900×10?314.900×10?30.3700.561 2 X2X39.610×10?619.610×10?60.0120.917 20.09310.0937.0600.032 6 X120.01710.01720.9100.002 61.58011.580119.640＜0.000 1 X220.02410.02429.3800.001 00.06510.0654.9400.061 7 X320.20010.200242.760＜0.000 10.27010.27020.6700.002 6 殘差5.790×10?378.270×10?4 0.09270.013 失擬項3.510×10?331.170×10?32.0500.249 20.06330.0212.8600.168 1 純誤差2.280×10?345.700×10?4 0.02947.330×10?3 總和0.31016 4.30016

出膏率對1、2、3的2次多元回歸模型方程為：出膏率＝15.89＋0.481＋0.122＋0.0963＋0.02012＋0.03513－0.1523－0.6112－0.1222－0.2532，回歸模型方差分析結(jié)果見表4。回歸模型＝35.49，＝0.001＜0.05，表明2次多元回歸模型顯著，模型系數(shù)2＝0.978 6，adj2＝0.951 0，CV＝0.74%，結(jié)果表明模型擬合良好；失擬＝2.86，＝0.168 1＞0.05，模型失擬度不顯著，結(jié)果表明模型選擇合適，可用于五苓散乙醇提取工藝分析。1次項均對模型有顯著影響，交互項23有顯著影響，2次項12、32對模型有顯著影響。

由響應(yīng)面3D和等高線圖（圖2、3）的傾斜度反應(yīng)兩者對響應(yīng)值的影響，傾斜度越高表明兩者交互作用越顯著。從3D和等高線圖的顏色變化也可以初步判定，變化趨勢增加，其顏色也呈加深趨勢。

圖2 以綜合得分考察X1、X2和X3的交互作用

圖3 以出膏率考察X1、X2和X3的交互作用

因此，以綜合得分為指標(biāo)，提取時間、乙醇濃度和液料比在響應(yīng)范圍內(nèi)，23-乙酰澤瀉醇B等9種成分含量以最大值為響應(yīng)值，最后得出五苓散醇提取工藝為75.03%乙醇9.32倍量提取2次，每次85.41 min，23-乙酰澤瀉醇B等9種成分綜合得分預(yù)測值為0.941 994；以出膏率為指標(biāo)，使提取時間、乙醇濃度和液料比在響應(yīng)范圍內(nèi)，出膏率最大值為響應(yīng)值，最后得出五苓散醇提取工藝條件為76.59%乙醇10.78倍量提取2次，每次92.07 min，出膏率預(yù)測值為16.022 6%。

綜上，結(jié)合單因素實驗與綜合評分和出膏率考察結(jié)果，五苓散乙醇提取工藝條件為以75%乙醇10倍量提取2次，每次90 min。

2.4.3 驗證實驗 按處方比例稱取五苓散各藥味共計144 g粉碎混勻，根據(jù)優(yōu)選出的最佳工藝平行制備五苓散提取液3份，分別按照上述實驗條件進行分析檢測，實驗結(jié)果見表5。提取工藝驗證結(jié)果平均綜合評分為0.926 629、出膏率為15.495 8%與模型預(yù)測值（0.941 994、16.022 6%）相近，相對誤差為1.63%、3.29%，結(jié)果表明建立的模型預(yù)測性良好，提取工藝穩(wěn)定合理。

表5 工藝驗證試驗結(jié)果

Table5 Results of process verification test

序號質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg?g?1)綜合評分出膏率/% 肉桂酸桂皮醛白術(shù)內(nèi)酯III23-乙酰澤瀉醇C白術(shù)內(nèi)酯II白術(shù)內(nèi)酯I23-乙酰澤瀉醇B茯苓酸麥角甾醇 10.064 42.840.040 70.096 80.097 60.031 10.4332.400.3460.929 515.79 20.061 02.830.039 30.094 40.098 20.029 40.4262.420.3560.928 615.81 30.066 42.980.046 50.097 30.099 00.029 70.4492.270.3550.931 514.90

3 討論

五苓散被認(rèn)為是中醫(yī)的“利尿劑”，既能祛除體內(nèi)有形的水分潴留，也可消除無形之痰飲，臨床應(yīng)用于水腫、泌尿系統(tǒng)、關(guān)節(jié)病、眩暈、頭痛、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)疾病等[27]。五苓散方中重用澤瀉為君，利水滲濕；臣以茯苓、豬苓助君藥利水滲濕；佐以白術(shù)補氣健脾以運化水濕，又佐以桂枝溫陽化氣以助利水。中藥復(fù)方是多種成分的集合體，按照中醫(yī)君臣佐使配伍理論相互協(xié)調(diào)制約，以多成分調(diào)控多靶點，從而達到臨床治療效果。

《傷寒論》收載方劑共113首，絕大多數(shù)以湯劑應(yīng)用，僅有五苓散、四逆散等10余首方以散劑使用。散劑復(fù)方宜散不宜湯是由于湯劑以水為媒介對低極性成分提取能力有限，導(dǎo)致低極性部位化學(xué)成分不能被充分提取。五苓方湯劑和散劑的化學(xué)成分比較研究發(fā)現(xiàn)，湯劑非揮發(fā)低極性分子僅為其同方散劑1/450，可見低極性部位成分是該復(fù)方不可缺少的重要藥效物質(zhì)[7]，故對五苓散低極性部位提取工藝的研究將為進一步新藥開發(fā)及藥效物質(zhì)研究提供技術(shù)支持。

以澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C，豬苓中麥角甾醇，茯苓中茯苓酸，白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯II、白術(shù)內(nèi)酯III，桂枝中肉桂酸、桂皮醛為指標(biāo)成分，著重建立了多波長切換同時測定該9種有效成分的HPLC-PDA方法。實驗篩選了多種型號規(guī)格層析柱，最終確定Agilent Proshell 120 EC-C18柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm），填料細柱效高，柱溫40 ℃，體積流量0.8 mL/min時柱壓適中穩(wěn)定，各成分達到良好分離。

在樣品和對照品HPLC圖譜中相同保留時間點，23-乙酰澤瀉醇B和茯苓酸的最大吸收波長為208 nm，白術(shù)內(nèi)酯II和白術(shù)內(nèi)酯III的最大吸收波長為220 nm，23-乙酰澤瀉醇C的最大吸收波長為247 nm，麥角甾醇、白術(shù)內(nèi)酯I、肉桂酸和桂皮醛的最大吸收波長為280nm。PDA波長切換程序為：0～6 min，280 nm；6.1～9 min，220 nm；9.1～10.5 min，247 nm；10.6～13.5 min，220 nm；13.6～20 min，280 nm；20.1～25.3 min，208 nm；25.31～42 min，280 nm。

在藥學(xué)提取工藝優(yōu)化過程中，常需同時考察多個因素對結(jié)果的影響，并對結(jié)果進行優(yōu)化。常用的均勻設(shè)計和正交試驗設(shè)計方法在試驗時精度不夠，篩擇的試驗取值僅是接近最佳值而非精確的最佳點，不能考察各因素間的交互作用。響應(yīng)曲面法（response surface methodology，RSM）[28]是一種新型的試驗設(shè)計方法，以建立連續(xù)變量曲面模型對影響工藝過程的因子及其交互作用進行評價，可以確定精確的最佳試驗點，具有試驗次數(shù)少、精度高等特點，在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用比較成熟[29]。本實驗針對乙醇提取工藝的影響因素，應(yīng)用響應(yīng)曲面法展開工藝考察研究。

響應(yīng)曲面法試驗中以各成分來源藥味在復(fù)方中君臣佐使的配伍關(guān)系分配權(quán)重系數(shù)，君藥澤瀉中的成分23-乙酰澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇C權(quán)重各占25%，臣藥豬苓中成分麥角甾醇和茯苓中成分茯苓酸權(quán)重各占22.5%，佐使藥白術(shù)中3種成分共占3%，桂枝中2種成分共占2%。以該9種有效成分含量的綜合評分為指標(biāo)進行考察更好體現(xiàn)評價的合理性，所建立的工藝穩(wěn)定可行，響應(yīng)模型擬合度良好，達到工藝優(yōu)化的目的。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Optimization of low polarity components extraction process of Wuling Powder by HPLC-PDA combined with Box-Behnkenresponse surface methodology

WANG Hui-sen1, LIU Ming1, LI Geng-sheng1, LIANG Rui-feng1, GE Wen-jing1, XIA Shu-chou2

1. Henan Academy of Chinese Medicine, Zhengzhou 450004, China 2. Institute of Medical and Pharmaceutical Sciences, Zhengzhou University,Zhengzhou 450052, China

The optimal ethanol extraction process for the low polarity components of Wuling Powder (五苓散) was established using HPLC-PDA combined response surface method.The quantitative analysis method of HPLC-PDA multi-wavelength switching was used to analyze the contents of nine active components including 23-acetate alisol B, 23-acetate alisol C, ergosterol, pachymic acid, atractylenolide Ⅰ, atractylenolide Ⅱ, atractylenolide Ⅲ, cinnamic acid and cinnamaldehyde. Box-Behnken response surface methodology was used to investigate the effects of extraction ethanol volume fraction, solid-liquid ratio and extraction time on Wuling Powder low polarity components extraction process to determine the optimal extraction process.The determination was performed on an Agilent Proshell 120 EC-C18column (100 mm × 4.6 mm, 2.7 μm) with a volume flow rate of 0.8 mL/min and a column temperature of 40 ℃. The mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid aqueous solution with gradient elution: 0—10 min, 37%—60% acetonitrile; 10—20 min, 60% acetonitrile; 20—23 min, 60%—95% acetonitrile; 23—36 min, 95% acetonitrile; 36—37 min, 95%—37% acetonitrile; 37—42 min, 37% acetonitrile. The detection wavelength was multi-wavelength switched for 280, 247, 220, 208 nm.The established HPLC-PDA method is stable and suitable to analyze multiple components. The model established by response surface method is accurate and can be used to predict the comprehensive score of nine components well. The optimized extraction method had good reproducibility, stability and feasibility, which provided technical reference for clinical application, research of effective substances and development of new medicine of Wuling Powder.

Wuling Powder; extraction process; HPLC-PDA; response surface methodology; multiple indicators comprehensive evaluation; 23-acetate alisol B; 23-acetate alisol C; ergosterol; pachymic acid; atractylenolide Ⅰ; atractylenolide Ⅱ; atractylenolide Ⅲ; cinnamic acid; cinnamaldehyde

R283.6

A

0253 - 2670(2022)21 - 6741 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.21.011

2022-05-22

河南省中醫(yī)藥科學(xué)研究專項重點課題（2018ZY1021）；河南省中醫(yī)藥科學(xué)研究專項重點課題（2019ZY1041）

王慧森，女，副研究員，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及中藥新藥開發(fā)研究。Tel:(0371)66331718 E-mail: whs_zz@126.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]