梁紅寶,孫建之,姜宇珺,袁曉梅,姚景春,關(guān)永霞,張貴民,李 峰
基于GC-MS和UPLC-Q-Exactive MS技術(shù)的首薈通便膠囊質(zhì)量標(biāo)志物研究
梁紅寶1, 2, 3,孫建之2, 3,姜宇珺2, 3,袁曉梅2,姚景春2, 3,關(guān)永霞2,張貴民1, 2, 3,李 峰1*
1. 山東中醫(yī)藥大學(xué),山東 濟(jì)南 250355 2. 魯南制藥集團(tuán)股份有限公司 中藥制藥共性技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 臨沂 276006 3. 山東新時代藥業(yè)有限公司,山東 臨沂 276006
對首薈通便膠囊化學(xué)成分及其裂解規(guī)律進(jìn)行系統(tǒng)分析,并探索其治療便秘的潛在質(zhì)量標(biāo)志物(quality marker,Q-Marker)。采用GC-MS和UPLC-Q-Exactive MS技術(shù)對首薈通便膠囊中化學(xué)成分進(jìn)行定性分析,并根據(jù)Q-Marker判定的“五原則”,對其潛在的Q-Marker進(jìn)行研究。通過GC-MS數(shù)據(jù)庫匹配,從揮發(fā)油中共鑒定出7個化合物,包括炔醇類1個和6個脂肪酸類。通過質(zhì)譜信息并結(jié)合對照品、相關(guān)文獻(xiàn)、數(shù)據(jù)庫檢索,LC-MS共鑒別出了60個化合物,包括蒽醌類10個、蒽醌苷類5個、糖苷類12個、黃酮類11個、黃酮苷類4個、皂苷類4個、香豆素類2個、萘并吡喃酮類1個、內(nèi)酯類2個、蒽酮苷類2個、脂肪酸類1個、有機(jī)酸類1個、倍半萜類1個、多酚類1個和其他類化合物3個。結(jié)合有效、特有、傳遞與溯源、可測和處方配伍的原則,預(yù)測出2,3,5,4-四羥基二苯乙烯-2β葡萄糖苷、蘆薈大黃素、橙黃決明素、槲皮素、-羥脯氨酸、人參皂苷、蒼術(shù)酮和柚皮素等8種成分可能為首薈通便膠囊的Q-Marker。建立了首薈通便膠囊的GC-MS和UPLC-Q-Exactive MS的分離鑒定方法,并預(yù)測了首薈通便膠囊的Q-Marker,為闡釋該復(fù)方的功效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供了依據(jù)。
GC-MS;UPLC-Q Exactive MS;首薈通便膠囊;裂解規(guī)律;質(zhì)量標(biāo)志物;2,3,5,4-四羥基二苯乙烯-2β葡萄糖苷;蘆薈大黃素;橙黃決明素;槲皮素;-羥脯氨酸;人參皂苷;蒼術(shù)酮;柚皮素
首薈通便膠囊為2015年經(jīng)國家藥監(jiān)局批準(zhǔn)的中藥創(chuàng)新藥,在臨床上用于功能型便秘,中醫(yī)辨證屬氣陰兩虛兼毒邪內(nèi)蘊(yùn)證。全方以何首烏、蘆薈、決明子、枸杞子、阿膠、人參、白術(shù)、枳實(shí)8種藥材配伍而成,其中人參味甘、微苦,性微溫,有大補(bǔ)元?dú)?、益智安神、生津止渴的功效,本方取其生津以潤腸、大補(bǔ)元?dú)庖灾竽c推進(jìn)之功。蘆薈長于清肝、通便,二藥配伍,可益氣生津、瀉下熱結(jié),共為君藥。何首烏因其味苦能瀉,養(yǎng)血滋陰、潤腸通便,可治血虛津虧之腸燥便秘。阿膠作為滋陰補(bǔ)血要藥,配伍人參增其滋陰潤燥之效,配伍首烏以助養(yǎng)血潤腸之功,二藥共為臣藥。決明子味微苦微甘,有清肝明目、潤腸通便之功,可助蘆薈、首烏瀉熱通便。枸杞子具有滋補(bǔ)肝腎、益精明目、滋陰養(yǎng)血之功效。《本草匯言》稱枸杞“潤肺生津,補(bǔ)腎添精”,可助首烏、阿膠益精補(bǔ)血潤腸。白術(shù)苦甘性溫,益氣健脾,枳實(shí)苦辛酸微寒,可破氣消積、化痰散瘡。概而方之,枳實(shí)、決明子助君、臣藥瀉熱行滯通便,枸杞子、白術(shù)助君、臣藥補(bǔ)氣滋陰潤腸,俱為佐藥。同時枳實(shí)兼為使藥,引藥入經(jīng),可引方中諸藥直達(dá)大腸腑[1]。諸藥配伍,攻下之力緩,扶正之效著,符合“補(bǔ)氣行舟、增水行舟”理論,治療氣陰不足,燥熱內(nèi)結(jié)之便秘,是通便排毒、減肥調(diào)脂的國家專利組方[2-3]。
首薈通便膠囊化學(xué)成分及質(zhì)量控制的研究報(bào)道不多。其中,彭艷等[4]采用HPLC-MS/MS 法同時對首薈通便膠囊中8種成分進(jìn)行分析;馬云等[5]建立了測定首薈通便膠囊中2,3,5,4-四羥基二苯乙烯- 2β葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、蘆薈苷A、蘆薈苷B、蘆薈大黃素和大黃酚等7種成分的HPLC方法。這些報(bào)道,為首薈通便膠囊的質(zhì)量控制水平的提高提供了新方法,但這些指標(biāo)成分不一定是效應(yīng)成分,不能真正反映全方的質(zhì)量。中藥質(zhì)量標(biāo)志物(quality marker,Q-Marker)概念的提出,為中藥質(zhì)量控制提供了新的思路和方法。為了完善首薈通便膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),本研究利用GC-MS和UPLC-Q-Exactive MS技術(shù)對首薈通便膠囊中的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析,并基于鑒定的成分,結(jié)合Q-Marker判定的五原則,預(yù)測首薈通便膠囊的潛在Q-Marker。
Thermo scientific trace 1310 ISQ/LT氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(賽默飛世爾科技公司,美國),UPLC-Q-Exactive MS四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(賽默飛世爾科技公司,美國),Thermo TR-V1色譜柱(30 m×0.25 mm,1.4 μm,賽默飛世爾科技公司,美國),Waters ACQUITY UPLC HSS C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm,沃特世科技有限公司,美國),萬分之一天平和十萬分之一天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司),GTSONIC-P13型超聲波清洗器(江蘇蘇州江東精密儀器有限公司),揮發(fā)油提取裝置,電子調(diào)溫電熱套(河南豫華儀器有限公司)。對照品二苯乙烯苷(19COX0141-SL-OL,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.6%)、大黃素(110756-201913,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.2%)和大黃酚(110796-201922,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.6%)購自標(biāo)準(zhǔn)藥物(中國)有限公司;新橙皮苷(111857-201804,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.4%)、橙皮苷(110721-202019,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95.3%)、蘆薈苷(110787-202109,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥94.8%)、蘆薈大黃素(110795-201710,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97.5%)、柚皮苷(110722-202116,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥93.5%)、木犀草素(111520-201605,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥96.3%)購自中國食品藥品檢定研究院。首薈通便膠囊(批號26220211),由魯南厚普制藥有限公司提供。乙腈(質(zhì)譜級,德國Merck KGaA公司),無水甲酸(分析純,西隴科學(xué)股份有限公司),甲酸[質(zhì)譜級,梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司]。
2.1.1 GC-MS供試品的制備 按照《中國藥典》2020年版揮發(fā)油測定法(通則2204甲法)提取揮發(fā)油,稱取首薈通便膠囊內(nèi)容物100 g,置圓底燒瓶中,加10倍量水,加熱回流提取至揮發(fā)油提取器中油量不再增加,用無水硫酸鈉干燥,精密量取首薈通便膠囊揮發(fā)油100 μL,即得供試品溶液,備用。
2.1.2 UPLC-Q-Exactive MS供試品溶液的制備 精密稱取首薈通便膠囊內(nèi)容物0.6 g,置25 mL量瓶中,加50%甲醇超聲30 min,放冷,定容,取1 mL稀釋10倍,即得。置于冰箱中4 ℃,備用。
分別精密稱取各對照品適量,加甲醇配制成含二苯乙烯苷0.126 mg/mL、柚皮苷0.105 mg/mL、大黃酚0.117 mg/mL、大黃素0.125 mg/mL、蘆薈苷0.138 mg/mL、蘆薈大黃素0.117 mg/mL、木犀草素0.138 mg/mL、橙皮苷0.112 mg/mL、新橙皮苷0.132 mg/mL的混合對照品溶液,置于4 ℃冰箱內(nèi),備用。
2.3.1 色譜條件 Thermo TR-V1色譜柱(30 m×0.25 mm,1.4 μm),以高純氦氣為載氣,初始溫度為80 ℃,保持5 min,以5 ℃/min速率升溫至220 ℃,保持20 min。進(jìn)樣口溫度為200 ℃,分流比10∶1,柱體積流量為1.0 mL/min,進(jìn)樣量為0.1 μL。
2.3.2 質(zhì)譜條件 電離方式為EI,電子能量為70 eV,傳輸線和離子源溫度均為230 ℃,掃描質(zhì)量范圍為/30~500。
2.4.1 色譜條件 色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm),0.2%甲酸溶液為流動相A,乙腈為流動相B,梯度洗脫(0~25 min,12%~23% B;25~33 min,23%~30% B;33~40 min,30%~70% B;40~42 min,70%~90% B;42~50 min,90% B),體積流量0.2 mL/min,柱溫為30 ℃,進(jìn)樣量為0.8 μL。
2.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(HESI),正離子模式,掃描模式為Full MS/dd-MS2,F(xiàn)ull MS掃描質(zhì)量范圍為/150~1500,分辨率為70 000,MS2掃描分辨率為17 500,輔助氣體積流量10.5 L/min,鞘氣體積流量3 L/min,毛細(xì)管溫度350 ℃,輔助氣溫度350 ℃,霧化電壓3.0 kV,碰撞能量梯度為20、30、40 eV。
氣質(zhì)數(shù)據(jù)結(jié)果經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后,利用氣質(zhì)工作站NIST 14質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)和標(biāo)準(zhǔn)圖庫對各色譜峰進(jìn)行檢索,并參照相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)一步確認(rèn)揮發(fā)油的化學(xué)成分,按色譜峰面積歸一化法計(jì)算各成分的相對百分含量。通過液質(zhì)質(zhì)譜所得數(shù)據(jù)中精確的相對分子質(zhì)量,在可能的元素組成范圍內(nèi)推斷其分子式。并參照相關(guān)文獻(xiàn)以及TCMSP數(shù)據(jù)庫并結(jié)合對照品、特征性多級質(zhì)譜裂解碎片及相對豐度等信息,分析各化合物裂解規(guī)律,進(jìn)一步確認(rèn)化學(xué)成分。同時,參考相關(guān)文獻(xiàn)以及TCMSP數(shù)據(jù)庫確定各化合物歸屬?;贕C-MS和LC-MS技術(shù)檢測到的成分,結(jié)合Q-Marker判斷的“五原則”預(yù)測首薈通便膠囊的Q-Marker。
首薈通便膠囊氣質(zhì)總離子流圖和在正、負(fù)離子模式下首薈通便膠囊液質(zhì)的總離子流圖,初步觀察發(fā)現(xiàn)儀器較穩(wěn)定且總離子流圖清晰,可以用來進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,且其結(jié)果有較高的可靠性。
通過所得數(shù)據(jù)中的精確相對分子質(zhì)量,并在可能的元素組成范圍內(nèi)推斷其分子式。本實(shí)驗(yàn)從首薈通便膠囊中共鑒定出67個化合物,其中通過氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù),從首薈通便膠囊揮發(fā)油中共鑒定出7個化合物,包括炔醇類1個和6個脂肪酸類。GC-MS總離子流圖見圖1,具體化合物信息見表1。
圖1 首薈通便膠囊GC-MS總離子流圖
通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù),從首薈通便膠囊中共鑒定出60個化合物,包括蒽醌類10個、蒽醌苷類5個、糖苷類12個、黃酮類11個、黃酮苷類4個、皂苷類4個、香豆素類2個、萘并吡喃酮類1個、內(nèi)酯類2個、蒽酮苷類2個、脂肪酸類1個、有機(jī)酸類1個、倍半萜類1個、多酚類1個和其他類化合物3個。通過比對9個對照品質(zhì)譜信息,其中8個化合物與樣品質(zhì)譜鑒定結(jié)果相符,分別為二苯乙烯苷(9)、柚皮苷(15)、新橙皮苷(19)、蘆薈苷(25)、木犀草素(30)、蘆薈大黃素(46)、大黃素(55)、大黃酚(57)。首薈通便膠囊正、負(fù)離子的總離子流圖見圖2,混合對照品負(fù)離子總離子流圖見圖3,正、負(fù)離子裂解信息及鑒定結(jié)果如表2所示。
表1 首薈通便膠囊揮發(fā)油中鑒定的揮發(fā)油成分及其相對百分含量
Table 1 Volatile composition and relative percentage content of Shouhui Tongbian Capsule
序號tR/min相對分子質(zhì)量(m/z)分子式化合物名稱相對百分含量/%分類歸屬 139.688288.208 93C14H28O2肉豆蔻酸[6-8]3.12脂肪酸類枸杞子、決明子、蘆薈、人參 243.245284.271 53C18H36O2棕櫚酸乙酯[8-10]0.84脂肪酸類枸杞子、決明子、蘆薈、人參 343.477254.224 58C16H30O2棕櫚油酸[7]0.94脂肪酸類蘆薈、決明子 443.783256.240 23C16H32O2棕櫚酸[8,10]10.42脂肪酸類枸杞子、蘆薈、人參、白術(shù)、決明子 545.153244.182 72C17H24O人參炔醇[8,11]1.81炔醇類人參 646.650308.271 53C20H36O2亞油酸乙酯[8,10]0.94脂肪酸類枸杞子、人參 747.150282.255 88C18H34O2反式-13-十八碳烯酸[8]1.15脂肪酸類人參
圖2 首薈通便膠囊UPLC-Q-Exactive MS負(fù)離子 (A)、正離子 (B) 模式總離子流圖
1-二苯乙烯苷 2-柚皮苷 3-橙皮苷 4-新橙皮苷 5-蘆薈苷 6-木犀草素 7-蘆薈大黃素 8-大黃素 9-大黃酚
3.2.1 蒽醌類 該類化合物在首薈通便膠囊中數(shù)量較多,主要來自蘆薈和決明子。蒽醌類化合物在質(zhì)譜裂解過程中多見苯環(huán)上取代基斷裂產(chǎn)生的碎片,而游離蒽醌常見依次脫2分子CO后得到豐度很高的離子峰。以化合物46和57為例,在[M-H]?的準(zhǔn)分子離子峰分別為269.045 29(C15H10O5)和/253.050 89(C15H10O4)?;衔?6首先失去苯環(huán)上的羥甲基取代基,得到/240 [M-H-CH2O]?碎片,其次保留共軛體系,失去1分子O,得到/225 [M-H-CH2O-O]?碎片。化合物57首先失去2分子羥基和1分子甲基,得到/207 [M-H-2OH-CH3]?碎片,然后連續(xù)脫去2分子CO得到/180 [M-H-2OH-CH3-CO]?和/152 [M-H-2OH-CH3-CO]?碎片。因此,化合物46和57被初步確定為蘆薈大黃素和大黃酚。推測裂解途徑見圖4。
3.2.2 內(nèi)酯類 該類化合物在首薈通便膠囊中主要來自白術(shù),以化合物58為例,在[M+H]+的準(zhǔn)分子離子峰為/233.153 44(C15H20O2)??赏茰y其在離子源轟擊下內(nèi)酯首先斷裂,得到/187 [M+H-CH2O2]+、/159 [M+H-CH2O2-C2H4]+和/145 [M+H-CH2O2-C3H6]+碎片,其次斷裂環(huán)烷烴,形成新環(huán)烷烴,得到/133 [M+H-CH2O2-C4H6]+碎片,后繼續(xù)斷裂而產(chǎn)生/105 [M+H-CH2O2-C4H6-C2H4]+碎片,與文獻(xiàn)記載碎片相符,因此,化合物58被初步確定為白術(shù)內(nèi)酯II[25]。其裂解過程見圖5。
表2 正負(fù)離子模式下首薈通便膠囊的化學(xué)成分分析
Table 2 Identification of compounds in Shouhui Tongbian Capsule in positive and negative ion mode
峰號tR/min離子模式相對分子質(zhì)量 (m/z)偏差(×10?6)碎片離子(m/z)化合物名稱分子式歸屬分類實(shí)際值理論值 14.03M-H395.134 00395.134 21?0.53395.134 00, 51.108 34(2'R)-8-C-glucosylaloesol[12]C19H24O9a其他 M+H397.149 44397.149 86?1.06397.149 44, 53.122 44 25.56M-H409.149 51409.149 86?0.86409.149 51, 47.096 65異蘆薈素[12]C20H26O9a蒽醌 M+H411.165 16411.165 51?0.85411.165 16, 249.102 55 36.19M-H409.115 05409.113 473.84409.115 05, 247.060 84蘆薈寧[12]C19H22O10a蒽醌 M+H411.129 00411.129 13?0.32411.129 00, 249.075 87 49.84M-H405.119 54405.118 562.42405.119 54, 243.065 93順式-2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷*[13]C24H30O12b糖苷 510.99M-H395.134 70395.134 211.24395.134 70, 275.092 358-C-葡萄糖基-(S)-蘆薈醇[13]C19H24O9a其他 M+H397.148 68397.149 86?2.97397.148 68, 233.080 99 612.42M+H259.096 47259.097 04?2.20259.096 47異丹葉大黃素[13]C15H14O4 b其他 714.06M-H433.112 30433.113 47?2.70433.112 30, 270.053 1910-羥基蘆薈素B[12]C21H22O10a蒽酮苷 814.20M+H433.110 47433.113 47?6.93433.110 47, 271.057 46異牡荊黃素C21H20O10f黃酮苷 914.98M-H405.118 80405.118 560.59405.118 68, 243.065 83反式-2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷[13]C20H22O9b糖苷 1015.22M+H289.070 47289.071 22?2.59289.070 47, 242.958 11圣草酚[14]C15H12O6f黃酮 1115.61M-H595.166 81595.166 300.86595.166 81紅鏈霉素-龍膽二糖苷[15]C27H32O15c糖苷 1216.80M-H433.113 16433.113 47?0.72433.113 16, 270.053 2210-羥基蘆薈素A[12]C21H22O10a蒽酮苷 1317.47M-H509.166 60509.165 901.37509.166 60, 363.108 438-(α-L-吡喃鼠李糖基)-3-(β-D-吡喃木糖基)[12]C24H30O12a糖苷 1419.18M-H571.182 19571.181 551.12571.182 19, 179.034 12isorabaichromoneC29H32O12a糖苷 M+H573.196 47573.197 20?1.27573.196 47, 163.039 02 1519.91M-H579.171 57579.171 380.33579.171 57, 271.061 13柚皮苷*[14,16]C27H32O14f黃酮苷 1619.93M-H271.061 16271.060 651.88271.061 16, 151.002 62柚皮素[14,16]C15H12O5f黃酮 M+H273.075 62273.076 30?2.49273.075 62, 153.018 31 1722.22M-H247.060 85247.060 650.81247.060 85蘆薈苷元C13H12O5a蒽醌苷 M+H249.075 76249.076 30?2.17249.075 76 1822.92M-H301.071 62301.071 221.33301.071 62, 283.047 61橙皮素[14,16]C16H14O6f黃酮 M+H303.086 24303.086 86?2.05303.086 24, 285.075 23 1923.01M-H609.181 52609.181 95?0.71609.181 52, 301.071 47新橙皮苷*[14,16]C28H34O15f黃酮苷 M+H611.193 48611.197 60?6.74611.193 48, 303.086 00 2023.03M+H449.145 36449.144 771.31449.145 36, 165.018 31異櫻花苷[14]C22H24O10f黃酮苷 2123.75M-H417.119 17417.118 561.46417.119 17, 297.076 60蘆薈苷B[12]C21H22O9a糖苷 M+H419.133 88419.134 21?0.79419.133 88, 299.091 89 2224.20M-H555.185 49555.186 64?2.07555.185 49, 511.160 31異蘆薈樹脂D[12]C29H32O11a糖苷 M+H557.202 03557.202 29?0.47557.202 03, 513.175 72 2324.22M+H273.075 68273.076 30?2.27273.075 68決明內(nèi)酯[17]C15H12O5c萘并吡喃酮 2424.43M-H595.166 73595.166 300.72595.166 73, 271.061 04圣草次苷[14]C27H32O15f糖苷 M+H597.182 50597.181 950.92597.182 50, 273.075 59 2525.96M-H417.118 84417.118 560.67417.118 84, 297.076 63蘆薈苷A* [12]C21H22O9a糖苷 M+H419.134 91419.134 211.67419.137 91 2626.56M-H563.177 06563.176 472.01563.177 06, 401.124 51蘆薈糖苷B[12]C27H32O13a糖苷 2728.53M-H431.098 66431.097 831.93431.098 66, 311.092 41大黃素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[13]C21H20O10b蒽醌苷 M+H433.112 79433.113 47?1.57433.112 79 2829.98M-H563.176 45563.176 47?0.04563.176 45, 401.124 30蘆薈糖苷A[12]C27H32O13a糖苷
續(xù)表2
*對照品比對后確定的化合物;a-蘆薈 b-何首烏 c-決明子 d-白術(shù) e-人參 f-枳實(shí) g-枸杞子;正、負(fù)離子模式下均檢出的化合物見圖2-A
*Compounds identified by comparison with the reference substance; a-b-c-d-e-etf-g-; Compounds detected in both positive and negative ion modes are shown in Fig. 2-A.
圖4 蘆薈大黃素和大黃酚裂解途徑圖
3.2.3 皂苷類 該類化合物在首薈通便膠囊中主要來自人參,皂苷類化合物以糖苷鍵斷裂,失去糖基為主要開裂方式。以化合物38為例,在[M-H]?的準(zhǔn)分子離子峰為/1 107.594 48(C54H92O23),文獻(xiàn)研究表明,在正負(fù)離子模式下,C3位糖基取代不易發(fā)生斷裂,而C20位糖基取代較易發(fā)生斷裂[26],所以化合物38首先斷裂C20位雙糖鏈,失去2分子葡萄糖,得到/783 [M-H-2glc]?碎片,其次斷裂C3位雙糖鏈,再次失去2分子葡萄糖,得到/459 [M-H-2glc-2glc]?碎片,或者連續(xù)失去2個葡萄糖分別得到/621 [M-H-2glc-glc]?和/459 [M-H-2glc-2glc]?碎片,因此,化合物38被初步確定為人參皂苷Rb1。裂解過程見圖6。
3.2.4 黃酮類 該類化合物在首薈通便膠囊中數(shù)量較多,主要來自枳實(shí)。該類化合物在質(zhì)譜裂解過程中容易發(fā)生重排、RDA裂解,以及CO、CO2等一些中性分子丟失。以化合物10和31為例,在[M+H]+的準(zhǔn)分子離子峰為/289.070 47(C15H12O6)和/271.059 84(C15H10O5)?;衔?0包含3種裂解方式,裂解方式I為準(zhǔn)分子離子峰B環(huán)開裂,同時C環(huán)失去1分子OH,得到/242 [M+H-CH2O2]+碎片;裂解方式II為準(zhǔn)分子離子峰C環(huán)斷裂,得到/179 [M+H-C6H6O2]+碎片;裂解方式III為準(zhǔn)分子離子峰發(fā)生RDA裂解,得到/153和/135碎片?;衔?1首先B環(huán)開裂并重排,生成中間體,其次C環(huán)上丟失C2H2O碎片,得到/229 [M+H-C2H2O]+碎片。因此,化合物10和31被初步確定為圣草酚和芹菜素。裂解途徑見圖7、8。
圖5 白術(shù)內(nèi)酯II裂解途徑圖
圖6 人參皂苷Rb1裂解途徑圖
圖7 圣草酚裂解途徑圖
圖8 芹菜素裂解途徑圖
Q-Marker的研究和確定應(yīng)基于有效、特有、傳遞與溯源、可測和處方配伍的“五原則”,既反映了與有效性和安全性的關(guān)聯(lián)關(guān)系,又體現(xiàn)中藥成分的專屬性、差異性特征,體現(xiàn)針對疾病的中藥有效性表達(dá)方式及其物質(zhì)基礎(chǔ)的客觀實(shí)質(zhì)[27-28]。首薈通便膠囊現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測的指標(biāo)成分相對簡單,很難真正反映藥物整體質(zhì)量?;贕C-MS和LC-MS技術(shù)檢測到的成分,結(jié)合Q-Marker判斷的“五原則”預(yù)測首薈通便膠囊的Q-Marker,以期為提高該藥物的整體質(zhì)量控制水平提供參考。
3.3.1 基于質(zhì)量傳遞與溯源的Q-Marker預(yù)測分析 本研究采用GC-MS和LC-MS技術(shù)從首薈通便膠囊中共鑒定出67個化合物,含7種揮發(fā)性成分和60種非揮發(fā)性成分。其中揮發(fā)性成分主要包括炔醇類1個和6個脂肪酸類;非揮發(fā)性(或不易揮發(fā)性)成分主要包括蒽醌類10個、蒽醌苷類5個、糖苷類12個、黃酮類11個、黃酮苷類4個、皂苷類4個、多酚類1個,香豆素類2個、萘并吡喃酮類1個、內(nèi)酯類2個、蒽酮苷類2個、脂肪酸類1個、有機(jī)酸類1個、倍半萜類1個和其他類化合物3。所有化合物都找到了具體的歸屬,其中何首烏、蘆薈共鑒定出33個成分;決明子和枸杞子共鑒定出18個成分,另外由于阿膠中主要含有多種氨基酸,這類成分極性較大且不易被常規(guī)色譜柱分離,因此本研究中基本沒鑒別出氨基酸類成分。人參、白術(shù)中共鑒定出13個成分;枳實(shí)中共鑒別出16個成分。
梁紅寶等[18]利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)和中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具(bioinformatics analysis tool for molecular mechANism of traditional Chinese medicine,BATMAN-TCM)查找首薈通便膠囊中“何首烏”“蘆薈”“決明子”“枸杞子”“阿膠”“人參”“白術(shù)”“枳實(shí)”相關(guān)的分子信息。按照口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug likeniss,DL)≥0.18的條件篩選并剔除無對應(yīng)靶點(diǎn)的成分,得到92個化合物。其中大多與本研究中鑒定的化合物一致。
3.3.2 基于復(fù)方配伍與成分特有性的Q-Marker預(yù)測分析 首薈通便膠囊方中的何首烏和蘆薈為君藥,具有潤腸通便、清肝瀉熱以及益精養(yǎng)血的功效;決明子與枸杞子以及阿膠共為臣藥,具有滋補(bǔ)肝腎、清肝明目、滋陰潤燥通便、補(bǔ)血止血的功效;人參與白術(shù)則為佐藥,具有補(bǔ)氣健脾的功效,且可促使瀉不傷正;并以枳實(shí)破氣消積,引經(jīng)入藥,共奏益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)瀉兼施、標(biāo)本兼治之功[29-30]。何首烏中主要存在二苯乙烯苷類、蒽醌糖苷類及白藜蘆醇等化合物為主的特有成分[31];蒽醌類成分是蘆薈的主要功效物質(zhì),且以蘆薈苷、蘆薈大黃素等成分為主[32];決明子中主要有橙黃決明素、決明素及決明子苷等特征性成分[33];枸杞子除含枸杞多糖等大分子成分外,還有槲皮素、異綠原酸、亞麻酸等小分子成分[34];阿膠中主要含-羥脯氨酸、賴氨酸和精氨酸等多種氨基酸類成分[35];人參炔醇類揮發(fā)性成分為人參特有,且還含有人參皂苷Rf、Rb1、Rc和Rb2等多種皂苷類成分[36];白術(shù)中的白術(shù)內(nèi)酯、蒼術(shù)酮等為特征性成分[37];枳實(shí)中主要含有新橙皮苷、川陳皮素和柚皮素等多種黃酮類化合物[38]。
3.3.3 基于成分與有效性關(guān)聯(lián)的Q-Marker預(yù)測分析 何首烏中含有的2,3,5,4-四羥基二苯乙烯- 2β葡萄糖苷顯示出多種生物活性,如調(diào)血脂、抗氧化、抗腫瘤等[31];蘆薈中蘆薈苷、蘆薈大黃素等成分具有潤腸通便、抗炎、抗菌、保護(hù)肝臟和神經(jīng)的多重活性[32];決明子、枸杞子、阿膠和枳實(shí)所含有的槲皮素、決明素、決明內(nèi)酯、木犀草素、柚皮素等多種黃酮、內(nèi)酯類成分、氨基酸類成分及枸杞多糖等大分子成分具有調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)、滋潤胃腸道、調(diào)脂、抗炎[33-35,38]等作用;人參、白術(shù)中含有的豐富的人參皂苷、蒼術(shù)內(nèi)酯、蒼術(shù)酮等活性分子具有提高免疫力的作用[36-37,39],類似于扶正、健脾的功效。
郭強(qiáng)等[40]通過分析靶點(diǎn)蛋白的生物學(xué)功能,發(fā)現(xiàn)首薈通便膠囊主要通過作用于三羧酸循環(huán)、嘧啶代謝、硫代謝、脂肪酸降解及氨基酸代謝相關(guān)通路的靶點(diǎn)蛋白群,發(fā)揮促進(jìn)腸道動力學(xué)、抗炎、改善腸道細(xì)胞屏障功能、改善腸道水分泌、改善腸道菌群等多種作用,最終發(fā)揮潤腸通便的臨床藥效。梁紅寶等[18]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究發(fā)現(xiàn),首薈通便膠囊中多種活性成分通過作用于RAC-α-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase,AKT1)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL6)、活化蛋白1(activator protein 1,AP1)等關(guān)鍵靶點(diǎn),調(diào)節(jié)多條信號通路,增加腸道的滑潤度和蠕動功能,保證腸道管腔通暢,發(fā)揮治療便秘的作用。其中degree值較高的化合物有:槲皮素(枸杞子和蘆薈)、白藜蘆醇(何首烏)、賴氨酸(阿膠)、大黃素(何首烏、蘆薈)、蘆薈大黃素(蘆薈)、木犀草素(枳實(shí))、柚皮素(枳實(shí))、川陳皮素(枳實(shí))等,可能為關(guān)鍵活性組分,協(xié)同治療、共同起效。
綜上分析可知,二苯乙烯苷類、蘆薈大黃素、枸杞多糖、槲皮素、決明素、柚皮素、人參皂苷和蒼術(shù)酮等成分在首薈通便膠囊臨床治療中發(fā)揮了重要作用,可以作為首薈通便膠囊Q-Marker的預(yù)測分析。
3.3.4 基于成分可測性的Q-Marker預(yù)測分析 中藥成分復(fù)雜,明確有效成分無疑是研究藥效的關(guān)鍵所在,Q-Marker應(yīng)具備可測性。彭艷等[4]采用HPLC-MS/MS法,以電噴霧離子源,通過SIM模式,同時測定了何首烏中大黃素、蘆薈中蘆薈大黃素、決明子中橙黃決明素、枸杞子中枸杞多糖、阿膠中羥脯氨酸、人參中人參皂苷、白術(shù)中蒼術(shù)酮、枳實(shí)中橙皮苷等8種成分。馬云等[5]建立了測定首薈通便膠囊中2,3,5,4-四羥基二苯乙烯-2β葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、蘆薈苷A、蘆薈苷B、蘆薈大黃素和大黃酚7種成分的HPLC方法。關(guān)永霞等[41]采用HPLC波長切換法,同時測定其中2,3,5,4-四羥基二苯乙烯-2β葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷和蘆薈苷4種活性成分的含量,該法簡便、快速、準(zhǔn)確,可更為全面、客觀評價(jià)首薈通便膠囊的質(zhì)量提供參考依據(jù)。
根據(jù)“五原則”的復(fù)方中藥Q-Marker研究思路,在Q-Marker預(yù)測分析過程中,發(fā)現(xiàn)首薈通便膠囊成分復(fù)雜繁多,采用通過常規(guī)技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)分離鑒別,故而應(yīng)當(dāng)選取成分特有、與首薈通便膠囊藥效關(guān)聯(lián)且便于檢測的化合物。綜上可知,2,3,5,4-四羥基二苯乙烯-2β葡萄糖苷、蘆薈大黃素、橙黃決明素、槲皮素、-羥脯氨酸、人參皂苷、蒼術(shù)酮和柚皮素等與首薈通便膠囊有效性較為密切,且廉價(jià)易得、特征性強(qiáng)、可測性好,可視為首薈通便膠囊的Q-Marker。
首薈通便膠囊具有養(yǎng)陰益氣、瀉濁通便之功效。用于功能性便秘,中醫(yī)辨證屬氣陰兩虛兼毒邪內(nèi)蘊(yùn)證者,癥見便秘、腹脹、口燥咽干、神疲乏力、五心煩熱,舌質(zhì)紅嫩或淡,舌苔白或白膩,脈沉細(xì)或滑數(shù)。
本實(shí)驗(yàn)首次對首薈通便膠囊的揮發(fā)油進(jìn)行定性鑒定,通過氣質(zhì)數(shù)據(jù)庫匹配,從揮發(fā)油中共鑒定出7個化合物,包括炔醇類1個和6個脂肪酸類,含量均非常低,不宜作為指標(biāo)成分進(jìn)行含量檢測。液質(zhì)實(shí)驗(yàn)前期,為篩選最佳提取方法,分別用水、50%甲醇水溶液、甲醇作為提取溶劑,考察最佳提取溶劑和提取時間,結(jié)果表明采用50%甲醇水超聲提取30 min時,各分析物出峰多、響應(yīng)好、提取率最高,提取效果最優(yōu)。通過質(zhì)譜信息并結(jié)合對照品、相關(guān)文獻(xiàn)、數(shù)據(jù)庫檢索,液質(zhì)聯(lián)用共鑒別出了60個化合物,包括蒽醌類10個、蒽醌苷類5個、糖苷類12個、黃酮類11個、黃酮苷類4個、皂苷類4個、香豆素類2個、萘并吡喃酮類1個、內(nèi)酯類2個、蒽酮苷類2個、脂肪酸類1個、有機(jī)酸類1個、倍半萜類1個、多酚類1個和其他類化合物3個。與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物相比,鑒定出的化合物數(shù)量偏少,主要原因可能是極性大的小分子化合物,如阿膠中的多種氨基酸,往往需要特殊的色譜柱進(jìn)行衍生檢測,本研究選擇了通用型廣譜性色譜柱,會造成部分成分的缺失;另外,有些化合物在藥材中的含量極微,而在提取、制劑過程中損失掉一部分,從而造成無法檢出的情況。通常來講,制劑中可檢測到的,能夠吸收入血的化合物才可能為藥效成分。目前未檢索到關(guān)于首薈通便膠囊入血成分相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道,下一步本課題組可開展相關(guān)研究。
本研究在鑒定首薈通便膠囊化學(xué)成分的基礎(chǔ)上,以中藥Q-Marker新概念為指導(dǎo),從質(zhì)量傳遞與溯源、復(fù)方配伍、化學(xué)成分特有性、有效性及成分可測性等5個方面對首薈通便膠囊Q-Marker的篩選進(jìn)行初步分析和論證,預(yù)測出2,3,5,4-四羥基二苯乙烯-2β葡萄糖苷、蘆薈大黃素、橙黃決明素、槲皮素、-羥脯氨酸、人參皂苷、蒼術(shù)酮和柚皮素8種活性成分可作為首薈通便膠囊治療便秘的Q-Marker。本研究將為闡釋該藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升方面提供重要的數(shù)據(jù)支持。
利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突
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Study on quality markers of Shouhui Tongbian Capsule based on GC-MS and UPLC-Q-Exactive MS technology
LIANG Hong-bao1, 2, 3, SUN Jian-zhi2, 3, JIANG Yu-jun2, 3, YUAN Xiao-mei2, YAO Jing-chun2, 3, GUAN Yong-xia2, ZHANG Gui-min1, 2, 3, LI Feng1
1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,China 2. State Key Laboratory of Generic Manufacture Technology of Chinese Traditional Medicine, Lunan Pharmaceutical Group Co., Ltd., Linyi 276006, China 3. Shandong New Time Pharmaceutical Co., Ltd., Linyi 276006, China
To systematically analyze the chemical composition and fragmentation law of Shouhui Tongbian Capsule (首薈通便膠囊), and explore its potential quality markers for the treatment of constipation.The chemical constituents of Shouhui Tongbian Capsule were qualitatively analyzed by GC-MS and UPLC-Q-Exactive MS. And according to the “five principles” of Q-Marker, the potential Q-Marker is studied.Seven compounds (one alkynols and six fatty acids) were identified from essential oil by GC-MS. And a total of 60 compounds (10 anthraquinones, five anthraquinone glycosides, 12 glycosides, 11 flavonoids, four flavonoid glycosides, four saponins, two coumarins, one naphthopyrones, two lactones, two anthrone glycosides, one fatty acid, one organic acid, one sesquiterpenoid, one polyphenol and three other compounds) were identified by UPLC-Q Exactive MS and combined with reference materials, related literature, database retrieval. Combining the principles of effectiveness, specificity, transmission and traceability, measurability and prescription compatibility, 2,3,5,4-tetrahydroxy stilbene-2-- βglucoside, aloe emodin, aurantio-obtusin, quercetin,-hydroxyproline, ginsenoside, atractylone and naringenin may be the Q-Marker of Shouhui Tongbian Capsule.In this study, the separation and identification methods of Shouhui Tongbian Capsule by GC-MS and UPLC-Q Exactive MS were established, and the Q-Marker of Shouhui Tongbian Capsule was predicted, which provided a basis for explaining the functional material basis and improving the quality standard of Shouhui Tongbian Capsule.
GC-MS; UPLC-Q Exactive MS; Shouhui Tongbian Capsule; fragmentation law; Q-Marker; 2,3,5,4-tetrahydroxy stilbene- 2--βglucoside; aloe emodin; aurantio-obtusin; quercetin;-hydroxyproline; ginsenoside; atractylone; naringenin
R284.1
A
0253 - 2670(2022)21 - 6674 - 12
10.7501/j.issn.0253-2670.2022.21.004
2022-07-12
山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(重大科技創(chuàng)新工程)(2021CXGC010508)
梁紅寶(1985—),男,山東濟(jì)寧人,博士研究生,研究方向?yàn)橹兴巹?chuàng)新藥物。Tel: 18764932621 E-mail: lianghongbao1985@163.com
李 峰(1957—),男,教授,博士生導(dǎo)師,研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制與資源。E-mail: 13969141796@163.com
[責(zé)任編輯 王文倩]