藍(lán)莓葉多酚對(duì)魷魚(yú)上清液中氧化三甲胺高溫?zé)岱纸獾挠绊?/h1>
2020-09-01 01:57:44李穎暢杜鳳霞劉雪飛蔡友瓊楊賢慶勵(lì)建榮
中國(guó)食品學(xué)報(bào) 2020年8期
李穎暢 杜鳳霞 張 笑 劉雪飛 蔡友瓊 楊賢慶 勵(lì)建榮*
（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心遼寧錦州121013 2 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所 上海200090 3 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 廣州540641）
近年來(lái)，從魷魚(yú)、魷魚(yú)制品以及其它水產(chǎn)品中檢測(cè)出甲醛（formaldehyde，F(xiàn)A）[1]，引起人們的關(guān)注，認(rèn)為水產(chǎn)品自身能夠產(chǎn)生甲醛[2]。 水產(chǎn)品在高溫作用下體內(nèi)的氧化三甲胺 （trimethylamine oxide，TMAO）熱分解為三甲胺（trimethylamine，TMA）、二 甲 胺（dimethylamine，DMA）和 甲 醛[3-4]。Lin 等[5]研究發(fā)現(xiàn)200 ℃條件下加熱反應(yīng)1 h 后魷魚(yú)肌肉組織中大部分氧化三甲胺發(fā)生熱分解反應(yīng)。 生物體內(nèi)的還原性的小分子物質(zhì)對(duì)氧化三甲胺分解形成甲醛具有催化作用。 Ferris 等[6]證實(shí)了氧化三甲胺在Fe2+催化下能夠生成甲醛和二甲胺。 Vaisey[7]研究證明了半胱氨酸（Cys）與Fe2+或Cys 與血紅蛋白能催化氧化三甲胺分解產(chǎn)生三甲胺、少量二甲胺和甲醛。 Spinelli 等[8]發(fā)現(xiàn)抗壞血酸和Fe2＋等對(duì)魷魚(yú)體內(nèi)氧化三胺熱分解有促進(jìn)作用。李豐等[9]研究發(fā)現(xiàn)乳糖可以促進(jìn)模擬體系中氧化三甲胺的分解。 陳帥等[10]認(rèn)為半乳糖對(duì)氧化三甲胺的熱分解有促進(jìn)作用。 氧化三甲胺熱分解產(chǎn)生甲醛嚴(yán)重制約魷魚(yú)加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展， 采取有效措施抑制甲醛的產(chǎn)生， 是一項(xiàng)重要的研究任務(wù)。Zhu 等[11]和勵(lì)建榮等[12]研究表明秘魯魷魚(yú)熱加工過(guò)程中有甲醛和自由基形成。朱軍莉等[13-14]研究發(fā)現(xiàn)添加檸檬酸和氯化鈣會(huì)顯著降低（P＜0.05）魷魚(yú)提取物中氧化三甲胺的熱分解， 同時(shí)檸檬酸根離子對(duì)魷魚(yú)提取物中DMA 和FA 的形成也有負(fù)面影響。 藍(lán)莓多酚類(lèi)化合物是藍(lán)莓葉中的一種重要的生物活性成分，具有抗氧化、抗癌、保護(hù)視力、抑制微生物生長(zhǎng)、 降血脂、 降血糖等多種功能特性[15]。 藍(lán)莓葉多酚對(duì)魷魚(yú)中氧化三甲胺熱分解的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。本文以魷魚(yú)上清液為對(duì)象，分析藍(lán)莓葉多酚對(duì)魷魚(yú)上清液中氧化三甲胺高溫分解的影響， 以及對(duì)秘魯魷魚(yú)高溫加熱過(guò)程中甲醛的抑制作用，為尋找天然、高效的甲醛抑制劑提供理論基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料及試劑
藍(lán)莓葉， 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)科學(xué)發(fā)展研究院； 秘魯魷魚(yú)，錦州市林西路水產(chǎn)市場(chǎng)。
三羥甲基氨基甲烷（Tris），天津市百世化工有限公司；甲醛溶液，鄒平恒坤化工有限公司；石油醚，鄭州易興化工產(chǎn)品銷(xiāo)售有限公司；2，4-二硝基苯肼，上海邦成化工有限公司；無(wú)水乙醇，揚(yáng)州德諾化工有限公司；氫氧化鈉，山西天河化工有限公司；苦味酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氯化鈦（TiC13），廣州順平生物科技有限公司；對(duì)甲苯磺酞氯，吳江市博霖實(shí)業(yè)有限公司；乙酸，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；甲苯，天津市密歐化學(xué)試劑有限公司；2-苯叔丁基硝酮（PBN），北京百靈威生物科技有限公司。以上試劑均為分析純級(jí)。甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液、氧化三甲胺標(biāo)準(zhǔn)品，國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所； 甲醇（色譜純）， TEDIA 公司；AB-8 大孔樹(shù)脂，天津市津達(dá)正通環(huán)保科技有限公司。
1.2 設(shè)備與儀器
CF1524R 冷凍高速離心機(jī)， 美國(guó)賽洛捷克（scilogex）公司； AD500S-P 高速分散均質(zhì)機(jī)，蘇州江東精密儀器有限公司；JR10-300 絞肉機(jī)，浙江蘇泊爾股份有限公司；166457 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，北京鼎盛兄弟科技有限公司；BSH-3A 循環(huán)水真空泵，信凱（北京）科技有限公司；Series Ⅱ型高壓輸液泵、恒流泵，北京中教金源科技有限公司；SDY-2 恒溫水浴鍋，北京賽歐華創(chuàng)科技有限公司；Free-Zone 2.5 L 臺(tái)式凍干機(jī)， 美國(guó)Labconco 公司；HPLC1200 高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司；UV1700PC 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)， 上海奧析科學(xué)儀器有限公司；PX2202ZH 電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；安捷倫7890 氣相色譜儀， 美國(guó)安捷倫科技有限公司；SB25-12DT 超聲波，寧波SCIENTZ/新芝公司；電子自旋共振儀，德國(guó)Magnettech 公司。
1.3 試驗(yàn)方法
1.3.1 藍(lán)莓葉多酚的制備 參照李穎暢等[16]的方法。
1.3.2 魷魚(yú)上清液的制備 10 g 秘魯魷魚(yú)，去皮、骨、內(nèi)臟，絞碎。 取碎魷魚(yú)肉，按1∶2（g/mL）與20 mmol/L Tris-乙酸緩沖液（pH 7.0）混合，勻漿，冰浴條件下超聲30 min， 離心15 min （12 000 r/min），取上清液，4 ℃冷藏備用。
1.3.3 藍(lán)莓葉多酚濃度對(duì)魷魚(yú)上清液TMAO 高溫?zé)岱纸獾挠绊?分別取質(zhì)量濃度為0，1，5，10，50，100，150，200 mg/L 的藍(lán)莓葉多酚溶液2 mL，與2 mL 魷魚(yú)上清液混合，反應(yīng)溫度90 ℃，在反應(yīng)時(shí)間15 min 條件下反應(yīng)。 測(cè)定魷魚(yú)上清液中氧化三甲胺、三甲胺、二甲胺和甲醛含量的變化。
1.3.4 加熱時(shí)間對(duì)魷魚(yú)上清液TMAO 高溫?zé)岱纸獾挠绊?取0.05 g/L 藍(lán)莓葉多酚溶液2 mL 與2 mL 魷魚(yú)上清液混合，在反應(yīng)溫度90 ℃，加熱時(shí)間分別為0，15，30，45，60，75，90 min 條件下反應(yīng)。測(cè)定魷魚(yú)上清液中氧化三甲胺、三甲胺、二甲胺和甲醛含量的變化。
1.3.5 反應(yīng)溫度對(duì)魷魚(yú)上清液TMAO 高溫?zé)岱纸獾挠绊?取0.05 g/L 藍(lán)莓葉多酚溶液2 mL 與2 mL 魷魚(yú)上清液混合，在反應(yīng)時(shí)間15 min，反應(yīng)溫度分別為80，90，100，110，120，130 ℃。 測(cè)定魷魚(yú)上清液中氧化三甲胺、三甲胺、二甲胺和甲醛含量變化。
1.3.6 藍(lán)莓葉多酚抑制甲醛產(chǎn)生的自由基機(jī)制在0.25 mL 魷魚(yú)上清中分別添加不同質(zhì)量濃度（0，0.005，0.05，0.1 g/L）的藍(lán)莓葉多酚溶液0.25 mL， 添加2-苯叔丁基硝酮后在100 ℃加熱15 min，以蒸餾水代替藍(lán)莓葉多酚作對(duì)照，檢測(cè)自由基的變化。
1.3.7 甲醛、二甲胺、三甲胺和氧化三甲胺的檢測(cè)方法 甲醛含量測(cè)定參考Li 等[17]的方法；二甲胺含量測(cè)定參考賈佳等[18]的方法；三甲胺含量測(cè)定參考朱軍莉等[19]的方法；氧化三甲胺含量測(cè)定：量取4 mL 反應(yīng)液，加入0.5 mL 1% TiCl3溶液，80 ℃水浴90 s，流水冷卻，測(cè)定步驟與三甲胺的相同。
1.3.8 自由基的檢測(cè)方法 根據(jù)賈佳等[20]的方法。
1.4 數(shù)據(jù)處理
所有試驗(yàn)每組取3 個(gè)平行，結(jié)果為均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。 采用SPSS19.0 的ANOVA 進(jìn)行方差分析，P＜0.05 為顯著性差異。
2 結(jié)果與分析
2.1 不同濃度藍(lán)莓葉多酚對(duì)魷魚(yú)上清液高溫?zé)岱纸獾挠绊?/h3>
Zhu 等[11]研究發(fā)現(xiàn)氧化三甲胺（TMAO）在高溫?zé)岱纸膺^(guò)程中能夠產(chǎn)生二甲胺和甲醛。 由圖1可知， 未加藍(lán)莓葉多酚的魷魚(yú)上清液中甲醛含量是最高的。隨著藍(lán)莓葉多酚濃度的增加，上清液中FA、DMA 和TMA 的含量不斷減少， 分別從1.53，49.49，46.07 mg/L 降 至0.14，41.42 mg/L 和33.29 mg/L；而TMAO 含量的變化卻相反，隨藍(lán)莓葉多酚濃度的增加，TMAO 含量增加，分解量減少，其含量從2027.47 mg/L 升至2 533.90 mg/L。 藍(lán)莓葉多酚質(zhì)量濃度在50～100 mg/L 之間，F(xiàn)A 的生成量和TMAO 的減少量無(wú)顯著性差異（P＞0.05），藍(lán)莓葉多酚質(zhì)量濃度為50 mg/L 時(shí)， 甲醛的減少量和TMAO 的生成量趨于平衡。 藍(lán)莓葉多酚溶液對(duì)魷魚(yú)上清液TMAO 的熱分解反應(yīng)有抑制作用， 可顯著降低魷魚(yú)上清液中甲醛含量， 當(dāng)藍(lán)莓葉多酚質(zhì)量濃度≥50 mg/L 時(shí)抑制效果較好。 Garro Galvez等[21]報(bào)道沒(méi)食子酸能夠和甲醛反應(yīng)，與本研究結(jié)果一致。 Ferris 等[22]研究發(fā)現(xiàn)TMAO 在Fe2+的催化下通過(guò)（CH3）3N 自由基生成FA、DMA 和TMA。藍(lán)莓葉多酚能夠抑制TMAO 的分解和FA 的生成，其原因可能是藍(lán)莓葉多酚中的單寧酸類(lèi)物質(zhì)與Fe2+生成某種物質(zhì)抑制了自由基生成，從而導(dǎo)致上清液中TMAO 的分解受到抑制， 或者藍(lán)莓葉多酚可能與FA 發(fā)生酚醛反應(yīng)使FA 的最終含量減少，達(dá)到抑制效果。
圖1 藍(lán)莓葉多酚質(zhì)量濃度對(duì)魷魚(yú)上清液氧化三甲胺高溫?zé)岱纸獾挠绊慒ig.1 Effects of polyphenols concentration of blueberry leaves on the TMAO thermal decomposition in squid supernatant
2.2 加熱時(shí)間對(duì)魷魚(yú)上清液高溫?zé)岱纸獾挠绊?/h3>
不同加熱時(shí)間下藍(lán)莓葉多酚對(duì)魷魚(yú)上清液中TMAO 熱分解的影響如圖2 所示。Zhu 等[11]報(bào)道隨著加熱時(shí)間的增加，TMAO 熱分解成甲醛和二甲胺加速。 對(duì)照組和藍(lán)莓葉多酚處理組TMAO 含量降低，90 min 內(nèi)對(duì)照組魷魚(yú)上清液中TMAO 含量從2 327.03 mg/L 減至1 230.21 mg/L，氧化三甲胺含量減少了47.13%。 與對(duì)照組相比，添加0.05 g/L藍(lán)莓葉多酚的魷魚(yú)上清液90 min 內(nèi)TMAO 的含量從2 336.04 mg/L 減至2 106.46 mg/L，氧化三甲胺含量減少了9.83%，TMAO 含量的減少被顯著抑制。 對(duì)照組魷魚(yú)上清液中FA、DMA 和TMA 的含量隨著加熱時(shí)間的增加而增加， 分別從0.19，47.10 mg/L 和18.35 mg/L 升 至11.49，104.50 mg/L和51.03 mg/L。 與對(duì)照組相比，藍(lán)莓葉多酚組魷魚(yú)上清液中FA、DMA 和TMA 含量的增加被抑制，加熱90 min 后FA 含量?jī)H0.86 mg/L， 說(shuō)明藍(lán)莓葉多酚使魷魚(yú)上清液中甲醛含量降低， 其原因是藍(lán)莓葉多酚與FA 發(fā)生酚醛縮合反應(yīng)，導(dǎo)致FA 含量減少。 藍(lán)莓葉多酚有可能抑制魷魚(yú)上清液中TMAO 高溫?zé)岱纸猓?導(dǎo)致DMA、TMA 和FA 含量降低。
2.3 反應(yīng)溫度對(duì)魷魚(yú)上清液高溫?zé)岱纸獾挠绊?/h3>
圖2 不同加熱時(shí)間的藍(lán)莓葉多酚對(duì)魷魚(yú)上清液中TMAO 熱分解的影響Fig.2 Effects of polyphenols of blueberry leaves on the TMAO thermal decomposition in squid supernatant at different time
不同加熱溫度下藍(lán)莓葉多酚對(duì)TMAO 熱分解的影響如圖3 所示。隨著加熱溫度的增加，對(duì)照組和藍(lán)莓葉多酚處理組氧化三甲胺含量均降低，溫度越高降低越顯著， 而對(duì)照組魷魚(yú)上清液中氧化三甲胺含量顯著低于（P＜0.05）藍(lán)莓葉多酚組魷魚(yú)上清液中氧化三甲胺含量， 即藍(lán)莓葉多酚使氧化三甲胺熱分解程度降低。隨著加熱溫度的升高，對(duì)照組魷魚(yú)上清液中氧化三甲胺含量從2 179.871 mg/L 降至1 519.392 mg/L，氧化三甲胺含量下降了30.29%。 藍(lán)莓葉多酚處理的魷魚(yú)上清液中TMAO含量從2 356.466 mg/L 降至2 048.813 mg/L，氧化三甲胺含量下降了13.06%。 隨著加熱溫度的升高，對(duì)照組甲醛含量顯著（P＜0.05）增加，而藍(lán)莓葉多酚處理組甲醛含量增加緩慢。 隨著加熱溫度的升高， 對(duì)照組魷魚(yú)上清液中甲醛含量從0.663 mg/L 增至6.541 mg/L， 對(duì)照組甲醛含量增加了9.77倍。 藍(lán)莓葉多酚組魷魚(yú)上清液FA 的最高含量達(dá)0.560 mg/L，說(shuō)明加熱溫度越高，產(chǎn)生的甲醛越多，在藍(lán)莓葉多酚的作用下， 不同加熱溫度的魷魚(yú)上清液中甲醛含量降低。 對(duì)照組和藍(lán)莓葉多酚處理組二甲胺和三甲胺含量隨著加熱溫度的升高也顯著（P＜0.05）上升，而藍(lán)莓葉多酚處理組二甲胺和三甲胺含量顯著（P＜0.05）低于對(duì)照組。 對(duì)照組的三甲胺和二甲胺最高含量分別為57.714，58.597 mg/L。 藍(lán)莓葉多酚處理組三甲胺和二甲胺最高含量分別為49.465，47.527 mg/L。 添加藍(lán)莓葉多酚后，三甲胺含量降低了14.29%，二甲胺含量降低了18.89%。 在藍(lán)莓葉多酚的作用下，魷魚(yú)上清液中氧化三甲胺高溫?zé)岱纸獗灰种疲?導(dǎo)致上清液中三甲胺和二甲胺含量下降。
圖3 不同加熱溫度的藍(lán)莓葉多酚對(duì)魷魚(yú)上清液中TMAO 熱分解的影響Fig.3 Effects of polyphenols of blueberry leaves on the TMAO thermal decomposition in squid supernatant at different temperature
2.4 不同pH 值藍(lán)莓葉多酚溶液對(duì)魷魚(yú)上清液高溫TMAO 熱分解的影響
不同pH 值藍(lán)莓葉多酚溶液對(duì)魷魚(yú)上清液中TMAO 熱分解的影響如圖4 所示。pH＜7 時(shí)對(duì)照組和藍(lán)莓葉多酚組魷魚(yú)上清液中TMAO 含量隨pH值的升高而降低， pH＞7 時(shí)對(duì)照組和藍(lán)莓葉多酚組魷魚(yú)上清液中TMAO 含量升高。與對(duì)照組相比，用藍(lán)莓葉多酚處理的魷魚(yú)上清液TMAO 含量顯著（P＜0.05）高于對(duì)照組魷魚(yú)上清液中TMAO 含量，說(shuō)明藍(lán)莓葉多酚對(duì)魷魚(yú)上清液中TMAO 高溫?zé)岱纸庥幸种谱饔谩H＜7 時(shí)對(duì)照組和藍(lán)莓葉多酚組魷魚(yú)上清液中FA、DMA 和TMA 含量隨pH 值的升高而升高；pH＞7 時(shí)對(duì)照組和藍(lán)莓葉多酚組魷魚(yú)上清液中FA、DMA 和TMA 含量降低。 與對(duì)照組相比， 藍(lán)莓葉多酚處理組的魷魚(yú)上清液中FA 含量顯著（P＜0.05）降低。 TMAO 高溫?zé)岱纸馀cpH 值有關(guān)，pH7.0 時(shí)TMAO 熱分解的量最少，產(chǎn)生甲醛的量也最少。
圖4 不同pH 值的藍(lán)莓葉多酚對(duì)魷魚(yú)上清液中TMAO 熱分解的影響Fig.4 Effects of polyphenols of blueberry leaves on the TMAO thermal decomposition in squid supernatant at different pH
2.5 藍(lán)莓葉多酚對(duì)魷魚(yú)上清液TMAO 熱分解產(chǎn)生自由基的影響
圖5 不同濃度藍(lán)莓葉多酚對(duì)魷魚(yú)上清液中自由基的影響Fig.5 Effects of different concentration polyphenols of blueberry leaves on the generation of free radical in squid supernatant
以PBN 為自由基捕獲劑，利用ESR 技術(shù)檢測(cè)不同濃度藍(lán)莓葉多酚與魷魚(yú)上清液反應(yīng)樣品中的自由基。 如圖5 所示， 在磁場(chǎng)3 460.00～3 560.00 G，對(duì)照組的魷魚(yú)上清液經(jīng)高溫處理產(chǎn)生明顯的六重峰自由基信號(hào)，在添加質(zhì)量濃度為0.005 g/L 和0.05 g/L 的藍(lán)莓葉多酚的魷魚(yú)上清液中也出現(xiàn)明顯的六重峰自由基信號(hào)， 而自由基信號(hào)強(qiáng)度要比對(duì)照組弱。勵(lì)建榮等[12]和李穎暢等[23]在魷魚(yú)上清液中也捕捉到相同的自由基信號(hào)， 并發(fā)現(xiàn)魷魚(yú)中甲醛的產(chǎn)生與自由基存在密切的關(guān)系。 從圖5 可以看出，隨著藍(lán)莓葉多酚濃度的增加，魷魚(yú)上清液中自由基信號(hào)強(qiáng)度逐漸減弱， 當(dāng)藍(lán)莓葉多酚質(zhì)量濃度達(dá)到0.1 g/L 時(shí)，魷魚(yú)上清液中的自由基信號(hào)為基線(xiàn)雜峰。 藍(lán)莓葉多酚對(duì)自由基信號(hào)強(qiáng)度的影響與藍(lán)莓葉多酚抑制甲醛的產(chǎn)生是一致的。 由此可知， 藍(lán)莓葉多酚對(duì)魷魚(yú)上清液高溫?zé)岱纸馔緩降囊种谱饔茫?可能與藍(lán)莓葉多酚能夠清除魷魚(yú)上清液中自由基有關(guān)。
3 結(jié)論
1）不同濃度的藍(lán)莓葉多酚抑制魷魚(yú)上清液中氧化三甲胺的熱分解，使魷魚(yú)上清液中三甲胺、二甲胺和甲醛含量降低，藍(lán)莓葉多酚濃度越大，抑制效果越顯著。 加熱時(shí)間對(duì)氧化三甲胺熱分解影響顯著。 不同加熱時(shí)間的藍(lán)莓葉多酚處理組的氧化三胺含量高于對(duì)照組，甲醛、二甲胺和三甲胺含量低于對(duì)照組。 加熱溫度對(duì)魷魚(yú)上清液中氧化三胺熱分解影響極顯著，當(dāng)溫度90～130 ℃時(shí)氧化三甲胺熱分解增強(qiáng)， 產(chǎn)生大量三甲胺、 二甲胺和甲醛。 藍(lán)莓葉多酚可抑制不同加熱溫度下氧化三甲胺的分解，三甲胺、二甲胺和甲醛含量顯著低于對(duì)照組。
2）魷魚(yú)上清液加熱過(guò)程中產(chǎn)生自由基。加入藍(lán)莓葉多酚后， 魷魚(yú)上清液中自由基信號(hào)強(qiáng)度減弱，藍(lán)莓葉多酚濃度越高，魷魚(yú)上清液中自由基信號(hào)強(qiáng)度越弱。
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李穎暢 杜鳳霞 張 笑 劉雪飛 蔡友瓊 楊賢慶 勵(lì)建榮*
（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心遼寧錦州121013 2 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所 上海200090 3 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 廣州540641）
近年來(lái)，從魷魚(yú)、魷魚(yú)制品以及其它水產(chǎn)品中檢測(cè)出甲醛（formaldehyde，F(xiàn)A）[1]，引起人們的關(guān)注，認(rèn)為水產(chǎn)品自身能夠產(chǎn)生甲醛[2]。 水產(chǎn)品在高溫作用下體內(nèi)的氧化三甲胺 （trimethylamine oxide，TMAO）熱分解為三甲胺（trimethylamine，TMA）、二 甲 胺（dimethylamine，DMA）和 甲 醛[3-4]。Lin 等[5]研究發(fā)現(xiàn)200 ℃條件下加熱反應(yīng)1 h 后魷魚(yú)肌肉組織中大部分氧化三甲胺發(fā)生熱分解反應(yīng)。 生物體內(nèi)的還原性的小分子物質(zhì)對(duì)氧化三甲胺分解形成甲醛具有催化作用。 Ferris 等[6]證實(shí)了氧化三甲胺在Fe2+催化下能夠生成甲醛和二甲胺。 Vaisey[7]研究證明了半胱氨酸（Cys）與Fe2+或Cys 與血紅蛋白能催化氧化三甲胺分解產(chǎn)生三甲胺、少量二甲胺和甲醛。 Spinelli 等[8]發(fā)現(xiàn)抗壞血酸和Fe2＋等對(duì)魷魚(yú)體內(nèi)氧化三胺熱分解有促進(jìn)作用。李豐等[9]研究發(fā)現(xiàn)乳糖可以促進(jìn)模擬體系中氧化三甲胺的分解。 陳帥等[10]認(rèn)為半乳糖對(duì)氧化三甲胺的熱分解有促進(jìn)作用。 氧化三甲胺熱分解產(chǎn)生甲醛嚴(yán)重制約魷魚(yú)加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展， 采取有效措施抑制甲醛的產(chǎn)生， 是一項(xiàng)重要的研究任務(wù)。Zhu 等[11]和勵(lì)建榮等[12]研究表明秘魯魷魚(yú)熱加工過(guò)程中有甲醛和自由基形成。朱軍莉等[13-14]研究發(fā)現(xiàn)添加檸檬酸和氯化鈣會(huì)顯著降低（P＜0.05）魷魚(yú)提取物中氧化三甲胺的熱分解， 同時(shí)檸檬酸根離子對(duì)魷魚(yú)提取物中DMA 和FA 的形成也有負(fù)面影響。 藍(lán)莓多酚類(lèi)化合物是藍(lán)莓葉中的一種重要的生物活性成分，具有抗氧化、抗癌、保護(hù)視力、抑制微生物生長(zhǎng)、 降血脂、 降血糖等多種功能特性[15]。 藍(lán)莓葉多酚對(duì)魷魚(yú)中氧化三甲胺熱分解的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。本文以魷魚(yú)上清液為對(duì)象，分析藍(lán)莓葉多酚對(duì)魷魚(yú)上清液中氧化三甲胺高溫分解的影響， 以及對(duì)秘魯魷魚(yú)高溫加熱過(guò)程中甲醛的抑制作用，為尋找天然、高效的甲醛抑制劑提供理論基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料及試劑
藍(lán)莓葉， 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)科學(xué)發(fā)展研究院； 秘魯魷魚(yú)，錦州市林西路水產(chǎn)市場(chǎng)。
三羥甲基氨基甲烷（Tris），天津市百世化工有限公司；甲醛溶液，鄒平恒坤化工有限公司；石油醚，鄭州易興化工產(chǎn)品銷(xiāo)售有限公司；2，4-二硝基苯肼，上海邦成化工有限公司；無(wú)水乙醇，揚(yáng)州德諾化工有限公司；氫氧化鈉，山西天河化工有限公司；苦味酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氯化鈦（TiC13），廣州順平生物科技有限公司；對(duì)甲苯磺酞氯，吳江市博霖實(shí)業(yè)有限公司；乙酸，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；甲苯，天津市密歐化學(xué)試劑有限公司；2-苯叔丁基硝酮（PBN），北京百靈威生物科技有限公司。以上試劑均為分析純級(jí)。甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液、氧化三甲胺標(biāo)準(zhǔn)品，國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所； 甲醇（色譜純）， TEDIA 公司；AB-8 大孔樹(shù)脂，天津市津達(dá)正通環(huán)保科技有限公司。
1.2 設(shè)備與儀器
CF1524R 冷凍高速離心機(jī)， 美國(guó)賽洛捷克（scilogex）公司； AD500S-P 高速分散均質(zhì)機(jī)，蘇州江東精密儀器有限公司；JR10-300 絞肉機(jī)，浙江蘇泊爾股份有限公司；166457 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，北京鼎盛兄弟科技有限公司；BSH-3A 循環(huán)水真空泵，信凱（北京）科技有限公司；Series Ⅱ型高壓輸液泵、恒流泵，北京中教金源科技有限公司；SDY-2 恒溫水浴鍋，北京賽歐華創(chuàng)科技有限公司；Free-Zone 2.5 L 臺(tái)式凍干機(jī)， 美國(guó)Labconco 公司；HPLC1200 高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司；UV1700PC 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)， 上海奧析科學(xué)儀器有限公司；PX2202ZH 電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；安捷倫7890 氣相色譜儀， 美國(guó)安捷倫科技有限公司；SB25-12DT 超聲波，寧波SCIENTZ/新芝公司；電子自旋共振儀，德國(guó)Magnettech 公司。
1.3 試驗(yàn)方法
1.3.1 藍(lán)莓葉多酚的制備 參照李穎暢等[16]的方法。
1.3.2 魷魚(yú)上清液的制備 10 g 秘魯魷魚(yú)，去皮、骨、內(nèi)臟，絞碎。 取碎魷魚(yú)肉，按1∶2（g/mL）與20 mmol/L Tris-乙酸緩沖液（pH 7.0）混合，勻漿，冰浴條件下超聲30 min， 離心15 min （12 000 r/min），取上清液，4 ℃冷藏備用。
1.3.3 藍(lán)莓葉多酚濃度對(duì)魷魚(yú)上清液TMAO 高溫?zé)岱纸獾挠绊?分別取質(zhì)量濃度為0，1，5，10，50，100，150，200 mg/L 的藍(lán)莓葉多酚溶液2 mL，與2 mL 魷魚(yú)上清液混合，反應(yīng)溫度90 ℃，在反應(yīng)時(shí)間15 min 條件下反應(yīng)。 測(cè)定魷魚(yú)上清液中氧化三甲胺、三甲胺、二甲胺和甲醛含量的變化。
1.3.4 加熱時(shí)間對(duì)魷魚(yú)上清液TMAO 高溫?zé)岱纸獾挠绊?取0.05 g/L 藍(lán)莓葉多酚溶液2 mL 與2 mL 魷魚(yú)上清液混合，在反應(yīng)溫度90 ℃，加熱時(shí)間分別為0，15，30，45，60，75，90 min 條件下反應(yīng)。測(cè)定魷魚(yú)上清液中氧化三甲胺、三甲胺、二甲胺和甲醛含量的變化。
1.3.5 反應(yīng)溫度對(duì)魷魚(yú)上清液TMAO 高溫?zé)岱纸獾挠绊?取0.05 g/L 藍(lán)莓葉多酚溶液2 mL 與2 mL 魷魚(yú)上清液混合，在反應(yīng)時(shí)間15 min，反應(yīng)溫度分別為80，90，100，110，120，130 ℃。 測(cè)定魷魚(yú)上清液中氧化三甲胺、三甲胺、二甲胺和甲醛含量變化。
1.3.6 藍(lán)莓葉多酚抑制甲醛產(chǎn)生的自由基機(jī)制在0.25 mL 魷魚(yú)上清中分別添加不同質(zhì)量濃度（0，0.005，0.05，0.1 g/L）的藍(lán)莓葉多酚溶液0.25 mL， 添加2-苯叔丁基硝酮后在100 ℃加熱15 min，以蒸餾水代替藍(lán)莓葉多酚作對(duì)照，檢測(cè)自由基的變化。
1.3.7 甲醛、二甲胺、三甲胺和氧化三甲胺的檢測(cè)方法 甲醛含量測(cè)定參考Li 等[17]的方法；二甲胺含量測(cè)定參考賈佳等[18]的方法；三甲胺含量測(cè)定參考朱軍莉等[19]的方法；氧化三甲胺含量測(cè)定：量取4 mL 反應(yīng)液，加入0.5 mL 1% TiCl3溶液，80 ℃水浴90 s，流水冷卻，測(cè)定步驟與三甲胺的相同。
1.3.8 自由基的檢測(cè)方法 根據(jù)賈佳等[20]的方法。
1.4 數(shù)據(jù)處理
所有試驗(yàn)每組取3 個(gè)平行，結(jié)果為均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。 采用SPSS19.0 的ANOVA 進(jìn)行方差分析，P＜0.05 為顯著性差異。
2 結(jié)果與分析
2.1 不同濃度藍(lán)莓葉多酚對(duì)魷魚(yú)上清液高溫?zé)岱纸獾挠绊?/h3>
Zhu 等[11]研究發(fā)現(xiàn)氧化三甲胺（TMAO）在高溫?zé)岱纸膺^(guò)程中能夠產(chǎn)生二甲胺和甲醛。 由圖1可知， 未加藍(lán)莓葉多酚的魷魚(yú)上清液中甲醛含量是最高的。隨著藍(lán)莓葉多酚濃度的增加，上清液中FA、DMA 和TMA 的含量不斷減少， 分別從1.53，49.49，46.07 mg/L 降 至0.14，41.42 mg/L 和33.29 mg/L；而TMAO 含量的變化卻相反，隨藍(lán)莓葉多酚濃度的增加，TMAO 含量增加，分解量減少，其含量從2027.47 mg/L 升至2 533.90 mg/L。 藍(lán)莓葉多酚質(zhì)量濃度在50～100 mg/L 之間，F(xiàn)A 的生成量和TMAO 的減少量無(wú)顯著性差異（P＞0.05），藍(lán)莓葉多酚質(zhì)量濃度為50 mg/L 時(shí)， 甲醛的減少量和TMAO 的生成量趨于平衡。 藍(lán)莓葉多酚溶液對(duì)魷魚(yú)上清液TMAO 的熱分解反應(yīng)有抑制作用， 可顯著降低魷魚(yú)上清液中甲醛含量， 當(dāng)藍(lán)莓葉多酚質(zhì)量濃度≥50 mg/L 時(shí)抑制效果較好。 Garro Galvez等[21]報(bào)道沒(méi)食子酸能夠和甲醛反應(yīng)，與本研究結(jié)果一致。 Ferris 等[22]研究發(fā)現(xiàn)TMAO 在Fe2+的催化下通過(guò)（CH3）3N 自由基生成FA、DMA 和TMA。藍(lán)莓葉多酚能夠抑制TMAO 的分解和FA 的生成，其原因可能是藍(lán)莓葉多酚中的單寧酸類(lèi)物質(zhì)與Fe2+生成某種物質(zhì)抑制了自由基生成，從而導(dǎo)致上清液中TMAO 的分解受到抑制， 或者藍(lán)莓葉多酚可能與FA 發(fā)生酚醛反應(yīng)使FA 的最終含量減少，達(dá)到抑制效果。
圖1 藍(lán)莓葉多酚質(zhì)量濃度對(duì)魷魚(yú)上清液氧化三甲胺高溫?zé)岱纸獾挠绊慒ig.1 Effects of polyphenols concentration of blueberry leaves on the TMAO thermal decomposition in squid supernatant
2.2 加熱時(shí)間對(duì)魷魚(yú)上清液高溫?zé)岱纸獾挠绊?/h3>
不同加熱時(shí)間下藍(lán)莓葉多酚對(duì)魷魚(yú)上清液中TMAO 熱分解的影響如圖2 所示。Zhu 等[11]報(bào)道隨著加熱時(shí)間的增加，TMAO 熱分解成甲醛和二甲胺加速。 對(duì)照組和藍(lán)莓葉多酚處理組TMAO 含量降低，90 min 內(nèi)對(duì)照組魷魚(yú)上清液中TMAO 含量從2 327.03 mg/L 減至1 230.21 mg/L，氧化三甲胺含量減少了47.13%。 與對(duì)照組相比，添加0.05 g/L藍(lán)莓葉多酚的魷魚(yú)上清液90 min 內(nèi)TMAO 的含量從2 336.04 mg/L 減至2 106.46 mg/L，氧化三甲胺含量減少了9.83%，TMAO 含量的減少被顯著抑制。 對(duì)照組魷魚(yú)上清液中FA、DMA 和TMA 的含量隨著加熱時(shí)間的增加而增加， 分別從0.19，47.10 mg/L 和18.35 mg/L 升 至11.49，104.50 mg/L和51.03 mg/L。 與對(duì)照組相比，藍(lán)莓葉多酚組魷魚(yú)上清液中FA、DMA 和TMA 含量的增加被抑制，加熱90 min 后FA 含量?jī)H0.86 mg/L， 說(shuō)明藍(lán)莓葉多酚使魷魚(yú)上清液中甲醛含量降低， 其原因是藍(lán)莓葉多酚與FA 發(fā)生酚醛縮合反應(yīng)，導(dǎo)致FA 含量減少。 藍(lán)莓葉多酚有可能抑制魷魚(yú)上清液中TMAO 高溫?zé)岱纸猓?導(dǎo)致DMA、TMA 和FA 含量降低。
2.3 反應(yīng)溫度對(duì)魷魚(yú)上清液高溫?zé)岱纸獾挠绊?/h3>
圖2 不同加熱時(shí)間的藍(lán)莓葉多酚對(duì)魷魚(yú)上清液中TMAO 熱分解的影響Fig.2 Effects of polyphenols of blueberry leaves on the TMAO thermal decomposition in squid supernatant at different time
不同加熱溫度下藍(lán)莓葉多酚對(duì)TMAO 熱分解的影響如圖3 所示。隨著加熱溫度的增加，對(duì)照組和藍(lán)莓葉多酚處理組氧化三甲胺含量均降低，溫度越高降低越顯著， 而對(duì)照組魷魚(yú)上清液中氧化三甲胺含量顯著低于（P＜0.05）藍(lán)莓葉多酚組魷魚(yú)上清液中氧化三甲胺含量， 即藍(lán)莓葉多酚使氧化三甲胺熱分解程度降低。隨著加熱溫度的升高，對(duì)照組魷魚(yú)上清液中氧化三甲胺含量從2 179.871 mg/L 降至1 519.392 mg/L，氧化三甲胺含量下降了30.29%。 藍(lán)莓葉多酚處理的魷魚(yú)上清液中TMAO含量從2 356.466 mg/L 降至2 048.813 mg/L，氧化三甲胺含量下降了13.06%。 隨著加熱溫度的升高，對(duì)照組甲醛含量顯著（P＜0.05）增加，而藍(lán)莓葉多酚處理組甲醛含量增加緩慢。 隨著加熱溫度的升高， 對(duì)照組魷魚(yú)上清液中甲醛含量從0.663 mg/L 增至6.541 mg/L， 對(duì)照組甲醛含量增加了9.77倍。 藍(lán)莓葉多酚組魷魚(yú)上清液FA 的最高含量達(dá)0.560 mg/L，說(shuō)明加熱溫度越高，產(chǎn)生的甲醛越多，在藍(lán)莓葉多酚的作用下， 不同加熱溫度的魷魚(yú)上清液中甲醛含量降低。 對(duì)照組和藍(lán)莓葉多酚處理組二甲胺和三甲胺含量隨著加熱溫度的升高也顯著（P＜0.05）上升，而藍(lán)莓葉多酚處理組二甲胺和三甲胺含量顯著（P＜0.05）低于對(duì)照組。 對(duì)照組的三甲胺和二甲胺最高含量分別為57.714，58.597 mg/L。 藍(lán)莓葉多酚處理組三甲胺和二甲胺最高含量分別為49.465，47.527 mg/L。 添加藍(lán)莓葉多酚后，三甲胺含量降低了14.29%，二甲胺含量降低了18.89%。 在藍(lán)莓葉多酚的作用下，魷魚(yú)上清液中氧化三甲胺高溫?zé)岱纸獗灰种疲?導(dǎo)致上清液中三甲胺和二甲胺含量下降。
圖3 不同加熱溫度的藍(lán)莓葉多酚對(duì)魷魚(yú)上清液中TMAO 熱分解的影響Fig.3 Effects of polyphenols of blueberry leaves on the TMAO thermal decomposition in squid supernatant at different temperature
2.4 不同pH 值藍(lán)莓葉多酚溶液對(duì)魷魚(yú)上清液高溫TMAO 熱分解的影響
不同pH 值藍(lán)莓葉多酚溶液對(duì)魷魚(yú)上清液中TMAO 熱分解的影響如圖4 所示。pH＜7 時(shí)對(duì)照組和藍(lán)莓葉多酚組魷魚(yú)上清液中TMAO 含量隨pH值的升高而降低， pH＞7 時(shí)對(duì)照組和藍(lán)莓葉多酚組魷魚(yú)上清液中TMAO 含量升高。與對(duì)照組相比，用藍(lán)莓葉多酚處理的魷魚(yú)上清液TMAO 含量顯著（P＜0.05）高于對(duì)照組魷魚(yú)上清液中TMAO 含量，說(shuō)明藍(lán)莓葉多酚對(duì)魷魚(yú)上清液中TMAO 高溫?zé)岱纸庥幸种谱饔谩H＜7 時(shí)對(duì)照組和藍(lán)莓葉多酚組魷魚(yú)上清液中FA、DMA 和TMA 含量隨pH 值的升高而升高；pH＞7 時(shí)對(duì)照組和藍(lán)莓葉多酚組魷魚(yú)上清液中FA、DMA 和TMA 含量降低。 與對(duì)照組相比， 藍(lán)莓葉多酚處理組的魷魚(yú)上清液中FA 含量顯著（P＜0.05）降低。 TMAO 高溫?zé)岱纸馀cpH 值有關(guān)，pH7.0 時(shí)TMAO 熱分解的量最少，產(chǎn)生甲醛的量也最少。
圖4 不同pH 值的藍(lán)莓葉多酚對(duì)魷魚(yú)上清液中TMAO 熱分解的影響Fig.4 Effects of polyphenols of blueberry leaves on the TMAO thermal decomposition in squid supernatant at different pH
2.5 藍(lán)莓葉多酚對(duì)魷魚(yú)上清液TMAO 熱分解產(chǎn)生自由基的影響
圖5 不同濃度藍(lán)莓葉多酚對(duì)魷魚(yú)上清液中自由基的影響Fig.5 Effects of different concentration polyphenols of blueberry leaves on the generation of free radical in squid supernatant
以PBN 為自由基捕獲劑，利用ESR 技術(shù)檢測(cè)不同濃度藍(lán)莓葉多酚與魷魚(yú)上清液反應(yīng)樣品中的自由基。 如圖5 所示， 在磁場(chǎng)3 460.00～3 560.00 G，對(duì)照組的魷魚(yú)上清液經(jīng)高溫處理產(chǎn)生明顯的六重峰自由基信號(hào)，在添加質(zhì)量濃度為0.005 g/L 和0.05 g/L 的藍(lán)莓葉多酚的魷魚(yú)上清液中也出現(xiàn)明顯的六重峰自由基信號(hào)， 而自由基信號(hào)強(qiáng)度要比對(duì)照組弱。勵(lì)建榮等[12]和李穎暢等[23]在魷魚(yú)上清液中也捕捉到相同的自由基信號(hào)， 并發(fā)現(xiàn)魷魚(yú)中甲醛的產(chǎn)生與自由基存在密切的關(guān)系。 從圖5 可以看出，隨著藍(lán)莓葉多酚濃度的增加，魷魚(yú)上清液中自由基信號(hào)強(qiáng)度逐漸減弱， 當(dāng)藍(lán)莓葉多酚質(zhì)量濃度達(dá)到0.1 g/L 時(shí)，魷魚(yú)上清液中的自由基信號(hào)為基線(xiàn)雜峰。 藍(lán)莓葉多酚對(duì)自由基信號(hào)強(qiáng)度的影響與藍(lán)莓葉多酚抑制甲醛的產(chǎn)生是一致的。 由此可知， 藍(lán)莓葉多酚對(duì)魷魚(yú)上清液高溫?zé)岱纸馔緩降囊种谱饔茫?可能與藍(lán)莓葉多酚能夠清除魷魚(yú)上清液中自由基有關(guān)。
3 結(jié)論
1）不同濃度的藍(lán)莓葉多酚抑制魷魚(yú)上清液中氧化三甲胺的熱分解，使魷魚(yú)上清液中三甲胺、二甲胺和甲醛含量降低，藍(lán)莓葉多酚濃度越大，抑制效果越顯著。 加熱時(shí)間對(duì)氧化三甲胺熱分解影響顯著。 不同加熱時(shí)間的藍(lán)莓葉多酚處理組的氧化三胺含量高于對(duì)照組，甲醛、二甲胺和三甲胺含量低于對(duì)照組。 加熱溫度對(duì)魷魚(yú)上清液中氧化三胺熱分解影響極顯著，當(dāng)溫度90～130 ℃時(shí)氧化三甲胺熱分解增強(qiáng)， 產(chǎn)生大量三甲胺、 二甲胺和甲醛。 藍(lán)莓葉多酚可抑制不同加熱溫度下氧化三甲胺的分解，三甲胺、二甲胺和甲醛含量顯著低于對(duì)照組。
2）魷魚(yú)上清液加熱過(guò)程中產(chǎn)生自由基。加入藍(lán)莓葉多酚后， 魷魚(yú)上清液中自由基信號(hào)強(qiáng)度減弱，藍(lán)莓葉多酚濃度越高，魷魚(yú)上清液中自由基信號(hào)強(qiáng)度越弱。
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