Streptomyces lavendulae X33遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及其內(nèi)源性啟動子活性的比較

孫亞楠，王園秀，丁忠濤，張 斌，吳曉玉，2*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院/江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室，江西 南昌 330045；2.江西省果蔬采后處理關(guān)鍵技術(shù)及質(zhì)量安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江西 南昌 330045）

【研究意義】淡紫灰鏈霉菌（Streptomyces lavendulae）X33是課題組前期篩選的一株防治柑橘青霉病的生防菌，其所產(chǎn)的活性物質(zhì)具有廣譜抑菌性能，對多種病原菌均有良好的抑制效果[1]，且小鼠毒性試驗表明其安全、無毒，在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[2]。菌株X33 對指狀青霉抑菌機制的研究證實：其發(fā)酵提取物寡肽通過干擾病原菌的多種代謝途徑、影響細胞結(jié)構(gòu)及降低產(chǎn)孢能力等方式有效地抑制柑橘青霉病的發(fā)生[3]。為開展提高菌株產(chǎn)活性物質(zhì)性能的研究，課題組已對菌株X33進行了全基因組測序，擬通過建立菌株X33 穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系、探尋高效啟動子，為次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇研究及構(gòu)建高產(chǎn)菌株奠定基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M展】目前鏈霉菌導(dǎo)入外源基因的方法主要有聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法[4]、接合轉(zhuǎn)移法[5]和電轉(zhuǎn)化法[6]。大多數(shù)鏈霉菌具有自身的限制修飾系統(tǒng)，外源遺傳物質(zhì)難以進入[7]，而接合轉(zhuǎn)移能夠避開胞外核酸酶，在一定程度上可以克服宿主對外源DNA 的限制性修飾[6-7]。自Bierman 等[8]首次成功利用接合轉(zhuǎn)移法將質(zhì)粒由大腸桿菌轉(zhuǎn)入變鉛青鏈霉菌后，接合轉(zhuǎn)移法逐漸成為廣泛應(yīng)用于鏈霉菌的一種高效基因轉(zhuǎn)移方法[9-10]。如：黃霉素產(chǎn)生菌加納鏈霉菌[11]、Xinaomycins產(chǎn)生菌諾爾斯鏈霉菌xinao-4[12]、豐加霉素產(chǎn)生菌淀粉產(chǎn)色鏈霉菌1628[13]、卡那霉素B 產(chǎn)生菌卡那霉素鏈霉菌ATCC12853[14]及固氮鏈霉菌WZS021[15]等的接合轉(zhuǎn)移體系構(gòu)建。在淡紫灰鏈霉菌中，徐萌萌等[16]、Kitani 等[17]成功建立了菌株FRI-5 及菌株gCLA4 的遺傳轉(zhuǎn)化體系。【本研究切入點】國內(nèi)外已建立了多種鏈霉菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系[11-15]，為淡紫灰鏈霉菌X33 的遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立提供了參考。Myronovskyi等[18]、Siegl等[19]、Xu等[20]證實：以β-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因作為報告基因，通過測定GUS 蛋白可準確反映啟動子的轉(zhuǎn)錄活性強弱。故選擇以β-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因作為報告基因比較紅色糖多孢菌來源的permE 啟動子及4 個內(nèi)源性啟動子的轉(zhuǎn)錄活性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用接合轉(zhuǎn)移法初步建立菌株X33的遺傳轉(zhuǎn)化體系，并對接合轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵影響因素進行優(yōu)化，包括熱激溫度、預(yù)萌發(fā)時間、供受體比例、接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基及抗生素覆蓋時間等，同時評估不同啟動子在菌株X33 的啟動活性，為后續(xù)菌株X33生物合成基因簇研究及分子改造提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒菌株：Streptomyces lavendulaeX33、克隆菌株E.coliDH5α、接合轉(zhuǎn)移供體菌E.coliET12567(pUZ8002）均來自實驗室保藏。質(zhì)粒：大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒pIB139，多克隆位點上游含啟動子permE，安普霉素抗性（Apr），由實驗室保藏；含報告基因質(zhì)粒pUC57-gusA，由南京擎科生物科技有限公司合成，氨芐青霉素抗性（Amp）。

1.1.2 培養(yǎng)基及緩沖液高氏一號培養(yǎng)基[21]（g/L）：可溶性淀粉20.0，NaCl 0.5，KNO31.0，K2HPO40.5，MgSO40.5，F(xiàn)eSO40.01，瓊脂20.0，pH 7.4～7.6；2×YT 培養(yǎng)基[21]（g/L）：胰蛋白胨16.0，酵母粉10.0，NaCl 5.0，pH 7.0；LB 培養(yǎng)基[22]（g/L）：酵母粉5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0，pH 7.0；MS 培養(yǎng)基[23]（g/L）：黃豆餅粉20.0，甘露醇20.0，瓊脂20.0，含10 mmol/L MgCl2；TSB培養(yǎng)基[24]（g/L）：胰蛋白胨17.0，大豆蛋白胨3.0，葡萄糖2.5，NaCl 5.0，K2HPO42.5，含10 mmol/L MgCl2，pH 7.5；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：淀粉20.0，牛肉膏3.0，魚粉蛋白胨10.0，NH4Cl 0.6，NaCl 10.0，CaCO30.02，pH 7.0。以上培養(yǎng)基均121 ℃滅菌20 min。TES緩沖液：稱取TES 11.46 g，溶解在1 L ddH2O，調(diào)pH為8.0，121℃20 min滅菌后備用。

1.1.3 試劑氯霉素（Chloramphenicol，Chl）、卡那霉素（Kanamycin，Kan）、安普霉素（Apramycin，Apr）、萘啶酮酸（Nalidixicacid，Nad）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、NdeⅠ、快速裂解液Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR 購于北京寶日醫(yī)（Takara）生物技術(shù)有限公司；DNA 聚合酶Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、一步克隆試劑盒ClonExpress II One Step Cloning Kit 購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；金牌Mix(green）Golden Star T6 DNA PCR Mix、DNA 分子量標準物均購于北京擎科生物科技有限公司。三羥甲基甲胺基乙磺酸（TES）、GUS染色液等其他試劑均購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 大腸桿菌及鏈霉菌的基本分子操作大腸桿菌的培養(yǎng)方法、質(zhì)粒載體的提取克隆與轉(zhuǎn)化以及感受態(tài)細胞的制備等操作方法參照《分子克隆實驗指南》[22]。鏈霉菌的培養(yǎng)和接合轉(zhuǎn)移方法等參照《鏈霉菌遺傳操作手冊》[21]。

1.2.2 菌株X33 對安普霉素的抗性檢測配制濃度為0，1，2，3，4，5，6，7，8，9 mg/mL 安普霉素的高氏一號培養(yǎng)基，分別倒入9 cm平皿制成平板，涂布接種菌株X33孢子懸液（含量為108CFU/mL），30 ℃培養(yǎng)5 d后觀察其生長情況[5]。

1.2.3 大腸桿菌和菌株X33 的接合轉(zhuǎn)移供體菌株E.coilET12567（pUZ8002，pIB139）制備[21]：將整合型質(zhì)粒pIB139 通過電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入E.coilET12567（pUZ8002）中，得到供體菌株ET12567（pUZ8002，pIB139）。挑取單克隆接種至LB 液體培養(yǎng)基（含Apr 50 mg/L、Chl 25 mg/L 及Kan 50 mg/L）中，使用振蕩培養(yǎng)箱（ZQLY-180N，上海知楚儀器有限公司）在37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h以上，按1%的接種量再轉(zhuǎn)接至50 mL 含上述3種相同抗生素的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)；當(dāng)菌濃度OD600約為0.4時，4 ℃離心收集菌體，用等體積不含抗生素的預(yù)冷LB液體培養(yǎng)基洗滌菌體3次，菌體重懸于1 mL的LB 培養(yǎng)基中，稀釋至108CUF/mL 備用。受體菌X33 孢子懸液制備[21]：將高氏一號平板上生長4 d 的菌株X33孢子用TES緩沖液洗脫下來，渦旋振蕩后用8層紗布過濾，50 ℃水浴熱激10 min，待冷卻后加入等體積的2×YT 培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min 預(yù)萌發(fā)振蕩培養(yǎng)3.5 h，使用高速離心機（TGL-20M，上海盧湘儀離心機儀器設(shè)備有限公司），5 000 r/min 常溫離心收集，重懸后測定孢子濃度，稀釋至108CUF/mL 備用。接合轉(zhuǎn)移獲得接合子[21]：將經(jīng)上述備用的供體菌E.coilET12567（pUZ8002、pIB139）和受體菌X33孢子懸液按濃度比1∶10的比例混勻，涂布于高氏一號培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)14 h后，再用含Apr（50 mg/L）和Nad（60 mg/L）的無菌水覆蓋，繼續(xù)培養(yǎng)4～5 d至長出接合子。

1.2.4 接合子的PCR 驗證陽性接合子均應(yīng)獲得Apr 抗性。根據(jù)安普霉素抗性基因序列設(shè)計引物Papr-F和Papr-R（表1），由北京擎科生物科技有限公司合成。將接合子在含Apr（50 mg/L）和Nad（60 mg/L）的高氏一號培養(yǎng)基上劃線純化3 次以上，用槍頭隨機挑取8 個單菌落，采用快速裂解液（Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR）提取接合子的基因組DNA，將裂解后的上清液作為PCR模板，以菌株X33的裂解上清液為陰性對照，以質(zhì)粒pIB139為陽性對照，利用Mix(green）Golden Star T6 DNA PCR Mix 進行擴增，片段大小應(yīng)為783 bp。

表1 試驗所用引物Tab.1 Primers used in study

1.2.5 接合轉(zhuǎn)移體系的優(yōu)化對接合轉(zhuǎn)移過程中的部分關(guān)鍵條件[11-15,23-24]進行優(yōu)化。接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基設(shè)置MS、高氏一號、發(fā)酵培養(yǎng)基及TSB 培養(yǎng)基；菌株X33 的孢子熱激溫度設(shè)置為40，45，50，55，60，65 ℃；孢子預(yù)萌發(fā)時間設(shè)置為0，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5 h；供受體比例設(shè)置為100∶1、10∶1、1∶1、1∶10、1∶100；抗生素覆蓋時間設(shè)置為10，12，14，16，18 h。優(yōu)化實驗中，供體菌E.coliET12567（pUZ8002、pIB139）的濃度保持為108CFU/mL，受體菌菌株X33 孢子濃度保持為108CFU/mL。接合子的計數(shù)以肉眼可分辨的接合子菌落為準，接合轉(zhuǎn)移效率=接合子單菌落數(shù)量/受體菌孢子數(shù)量。

1.2.6 啟動子活性檢測載體的構(gòu)建將pIB139質(zhì)粒進行NdeI和XbaI雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳跑膠回收線性片段，備用[22]。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫公布的GUS（β-葡萄糖苷酸酶）基因及氨基酸序列進行密碼子優(yōu)化，委托北京擎科生物科技有限公司合成目的基因，交付克隆質(zhì)粒pUC57-gusA。根據(jù)合成的gusA基因序列設(shè)計引物，并在引物5’端引入pIB139載體雙酶切末端的同源序列及相應(yīng)的酶切位點，如表1所示引物為PgusA-F 和PgusA-R。以pUC57-gusA為模板，利用DNA 聚合酶（Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase）擴增目的片段，產(chǎn)物大小約為1 850 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收，與備用的線性化pIB139通過一步克隆試劑盒（ClonExpress II One Step Cloning Kit）進行連接，將重組后的質(zhì)粒以熱激法轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)，分子驗證后將質(zhì)粒送至北京擎科生物科技公司測序。將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒pIB139-gusA及其克隆菌株保藏。pIB139-gusA重組質(zhì)粒圖譜如圖1所示。

圖1 pIB139-gusA重組質(zhì)粒圖譜Fig.1 Map of pIB139-gusA recombinant plasmid

以含報告基因的pIB139-gusA為出發(fā)質(zhì)粒，NdeI單酶切處理后回收，根據(jù)質(zhì)粒序列設(shè)計引物PpIB139-gusA-TF 和P-pIB139-gusA-TR（表1），以線性化的pIB139-gusA為模板擴增出不含啟動子permE的DNA片段回收備用。

根據(jù)已測序的菌株X33 全基因組，使用啟動子預(yù)測工具Softberry，隨機篩選出內(nèi)源性啟動子4 個，P116、P4565、P5092、P5500分別為β-半乳糖苷酶、蘋果酸脫氫酶、高絲氨酸脫氫酶、GTP 焦磷酸激酶的啟動子。片段大小截取400 bp，根據(jù)啟動子片段序列及經(jīng)Nde I單酶切處理的線性化質(zhì)粒兩端序列設(shè)計擴增啟動子的引物（表1），擴增回收備用。

將4個啟動子片段分別與線性化質(zhì)粒片段通過一步克隆試劑盒（ClonExpress II One Step Cloning Kit）進行連接，轉(zhuǎn)化及驗證方法與1.2.6 同。獲得4 個含不同啟動子的活性檢測載體pIB139-116-gusA、pIB139-4565-gusA、pIB139-5092-gusA和pIB139-5500-gusA，質(zhì)粒構(gòu)建過程如圖2所示。

圖2 啟動子活性檢測質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.2 Construction of plasmid for promoter activity detection

1.2.7 啟動子表征菌株的構(gòu)建將經(jīng)驗證的表征啟動子質(zhì)粒按照方法1.2.3制備供體菌后與菌株X33接合轉(zhuǎn)移，獲得啟動子表征菌株（X33-116G、X33-4565G、X33-5092G、X33-5500G、X33-permEG），3次純化單菌落后進行PCR驗證，保藏備用。

1.2.8 GUS 的活性檢測分析gusA基因的表達產(chǎn)物為β-葡萄糖苷酸酶（GUS），以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸（X-Gluc）作為反應(yīng)底物，GUS 可將X-Gluc 水解呈現(xiàn)藍色[25]，此方法可用于GUS 的初步定性分析。以4-硝基苯基-β-D-葡糖醛酸（CAS：10344-94-2）為底物進行酶解，底物水解后產(chǎn)生的對硝基苯酚含量可使用可見光分光光度計在415 nm處進行比色測定，此方法可用于GUS的定量檢測[26]。

將含不同啟動子的重組菌株與野生型菌株X33 及含空載質(zhì)粒的X33-pIB39 劃線于高氏一號固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)1～2 d 后，向其中均勻加入過濾除菌的GUS 染色液[27]，避光培養(yǎng)觀察顏色變化；將以上不同菌株分別接種至50 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中30 ℃、180 r/min下培養(yǎng)，至48 h時取樣500 μL于1.5 mL離心管中，并加入500 μL GUS染色液避光培養(yǎng)培養(yǎng)24 h，觀察其顏色變化；同時在培養(yǎng)至48 h時進行取樣，根據(jù)Myronovskyi 等[18]、Siegl 等[19]、Xu 等[20]描述的方法進行定量GUS 活性檢測，所得吸收曲線的斜率用于計算每克菌體干重的酶活性。以上試驗均設(shè)置3個平行進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株X33遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和優(yōu)化

2.1.1 菌株X33對安普霉素的抗性檢測試驗所用接合轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pIB139上攜帶安普霉素抗性基因。參考1.2.2 的方法，結(jié)果見表2。菌株X33 對安普霉素的最小抑制濃度為3 mg/mL，對安普霉素較為敏感。為便于后續(xù)篩選和純化接合子，參考文獻報道[5,11-15]，在以下接合轉(zhuǎn)移實驗中選用Apr濃度50 mg/L作為后續(xù)抗性篩選標記。

表2 菌株X33對不同濃度安普霉素的敏感性Tab.2 Sensitivity of strain X33 to different concentrations of apramycin

2.1.2 接合子的PCR 鑒定及穩(wěn)定性檢測采用1.2.3 方法，將整合型質(zhì)粒pIB139 通過大腸桿菌E.coliET12567（pUZ8002）接合轉(zhuǎn)移到菌株X33，獲得接合子。隨機挑取8 個單菌落的X33 接合子（X33-pIB139）擴大培養(yǎng)后，提取其基因組DNA，以安普霉素抗性基因序列為引物分別進行PCR 擴增，PCR 檢測結(jié)果如圖3 所示，接合子及陽性對照pIB139 均擴增出略大于750 bp 的片段，而野生菌株X33 未擴增出目的片段，表明pIB139 質(zhì)粒已成功導(dǎo)入到菌株X33中。

圖3 菌株X33接合子的PCR鑒定Fig.3 The PCR identification of strain X33 exconjugants

將經(jīng)PCR 鑒定的8 個接合子在含或不含Apr 的高氏一號培養(yǎng)基上，采用抗性交替?zhèn)鞔?0 次后，接合子X33-pIB139 的生長速度、菌落形態(tài)與野生型菌株均無明顯差異。將第10 代的接合子單菌落隨機挑選10 個，提取基因組DNA 進行PCR 擴增鑒定，均可獲得略大于750 bp 的目的片段，表明質(zhì)粒pIB139 在菌株X33 中可以穩(wěn)定遺傳。

2.1.3 接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基對接合轉(zhuǎn)移效率的影響根據(jù)前期實驗中菌株X33在不同培養(yǎng)基上的生長速度以及產(chǎn)孢情況，同時參考其他鏈霉菌的最適接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基[11-15]，選擇MS、高氏一號、發(fā)酵培養(yǎng)基及TSB的固體培養(yǎng)基進行接合轉(zhuǎn)移效率比較。結(jié)果如圖4所示，高氏一號、發(fā)酵培養(yǎng)基、MS上均有接合子生長，且在高氏一號上接合效率最高可達2.68×10-5，而在TSB 培養(yǎng)基上幾乎沒有接合子生長，故高氏一號為菌株X33的最佳接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基。

圖4 不同種類接合培養(yǎng)基對菌株X33接合轉(zhuǎn)移效率的影響Fig.4 Effect of different kinds of mediums on conjugation transfer efficiency of Strain X33

2.1.4 熱激溫度對接合轉(zhuǎn)移效率的影響將孢子分別在40，45，50，55，60，65 ℃6 個熱激溫度下水浴熱激10 min，促進孢子的萌發(fā)。待冷卻后加入等體積2×YT培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)3.5 h。接合轉(zhuǎn)移效率如圖5 所示，熱激溫度在40～65 ℃范圍內(nèi)，接合轉(zhuǎn)移效率隨溫度升高而逐漸增大，至55 ℃時達最大值，為2.78×10-5，隨后不斷下降。因此確定孢子的最佳熱激溫度為55 ℃。

圖5 不同熱激溫度對菌株X33接合轉(zhuǎn)移效率的影響Fig.5 Effect of different heat shock temperature on conjugation transfer efficiency of strain X33

2.1.5 孢子預(yù)萌發(fā)時間對接合轉(zhuǎn)移效率的影響熱激后對孢子進行預(yù)萌發(fā)，預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)時間過長會使孢子芽管萌發(fā)過長，菌體聚集結(jié)團[11]，接合轉(zhuǎn)移時難以充分與供體菌接觸，造成接合效率下降。實驗中設(shè)置預(yù)萌發(fā)時間為0，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5 h 共11 個處理，熱激溫度55 ℃。結(jié)果如圖6 所示，孢子經(jīng)預(yù)萌發(fā)處理1 h 的接合效率最高，為2.62×10-5。隨著預(yù)萌發(fā)時間的增加，接合效率呈下降趨勢。因此確定菌株X33孢子最佳預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)時間為1 h。

圖6 不同預(yù)萌發(fā)時間對菌株X33接合轉(zhuǎn)移效率的影響Fig.6 Effect of different pre-germination time on conjugation transfer efficiency of strain X33

2.1.6 供受體比例對接合轉(zhuǎn)移效率的影響供受體比例在鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移過程中是一個關(guān)鍵因素，且不同鏈霉菌的最佳供受體比例存在差異[5,7,11]。分別將供體菌ET12567（pUZ8002，pIB139）與受體菌菌株X33的濃度比值以100∶1、10∶1、1∶1、1∶10、1∶100進行混勻后涂布培養(yǎng)。結(jié)果如圖7所示，供受體比例為10∶1 時接合轉(zhuǎn)移效率最高，隨著供受體菌濃度比值的降低，接合轉(zhuǎn)移效率不斷下降。

圖7 不同供受體比例對菌株X33接合轉(zhuǎn)移效率的影響Fig.7 Effect of different donor-to-recipent ratio on conjugation transfer efficiency of strain X33

2.1.7 抗生素覆蓋時間對接合轉(zhuǎn)移效率的影響不同覆蓋抗生素的時間會影響接合轉(zhuǎn)移效率以及對陽性接合子的篩選，抗生素覆蓋過早會導(dǎo)致接合轉(zhuǎn)移的效率降低，而覆蓋過晚則會使得假陽性增多影響純化?？股馗采w時間分別設(shè)置10，12，14，16，18 h，計算接合轉(zhuǎn)移效率，結(jié)果如圖8 所示。混勻涂布培養(yǎng)后，在10～12 h隨著覆蓋Apr 時間后延，接合轉(zhuǎn)移效率增大，在12 h 時可達3.26×10-5；而12 h 后，隨著覆蓋時間的推遲，接合轉(zhuǎn)移效率下降，因此12 h 左右覆蓋抗生素為最佳。

圖8 不同抗生素覆蓋時間對菌株X33接合轉(zhuǎn)移效率的影響Fig.8 Effect of different antibiotic coverage time on conjugation transfer efficiency of strain X33

2.2 不同來源啟動子在菌株X33中的啟動活性比較

2.2.1 pIB139-gusA 載體與啟動子活性檢測載體的構(gòu)建質(zhì)粒pIB139 在多克隆位點前有鏈霉菌常用的組成型強啟動子permE，采用1.2.6 方法將報告基因gusA插入到啟動子permE 后，構(gòu)建可表征啟動子permE的質(zhì)粒pIB139-gusA。重組質(zhì)粒pIB139-gusA的雙酶切驗證膠圖如圖9所示。

圖9 重組質(zhì)粒pIB139-gusA的雙酶切驗證Fig.9 Analysis of double enzymes digestion of recombinant plasmid pIB139-gusA

以線性化的pIB139-gusA為模板擴增出不含啟動子permE 的片段回收備用，與擴增出的4 個內(nèi)源性啟動子片段分別連接，轉(zhuǎn)化至克隆菌株DH5α，菌落PCR驗證膠圖如圖10所示。

圖10 啟動子片段PCR特異性驗證結(jié)果Fig.10 The PCR product of promoter fragment

2.2.2 以GUS 為報告基因的啟動子活性比較采用1.2.7 方法獲得5 個表征啟動子的重組菌株X33-permEG、X33-116G、X33-4565G、X33-5092G、X33-5500G，接種至固體和液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，以野生型菌株X33 和含空載的X33-pIB139 作為陰性對照，根據(jù)1.2.7 的方法，GUS 染色后，觀察顏色變化，結(jié)果如圖11的A和B所示。啟動子表達菌株中，菌株X33-permEG產(chǎn)生的藍色較其他菌株更深，而菌株X33-116G未觀察到明顯的顏色變化。

圖11 野生型菌株X33和不同重組菌株GUS活性的可視化比較Fig.11 Visual observation of GUS activity of wild type strain X33 and different recombinant strains

液體培養(yǎng)至48 h時取樣進行GUS定量的活性檢測，根據(jù)所得吸收曲線的斜率來計算每克菌體干重的酶活性。結(jié)果如圖12 所示，與GUS 染色法的結(jié)果相一致。在淡紫灰鏈霉菌X33中，啟動子permE的轉(zhuǎn)錄活性相對較強，而篩選出的4個內(nèi)源性啟動子的轉(zhuǎn)錄活性均小于permE。

圖12 不同啟動子下GUS活性測定Fig.12 Detection of GUS activity under different promoters

3 討論

雖然多種鏈霉菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)建立，但由于鏈霉菌菌種遺傳代謝背景不同，即使同一種鏈霉菌的不同株系間其轉(zhuǎn)化效率也存在較大差別[5]。與其他導(dǎo)入外源基因的方法相比，接合轉(zhuǎn)移法具有明顯優(yōu)勢，其原因在于（1）鏈霉菌具有較強的限制性修飾系統(tǒng)，外源DNA 在其胞內(nèi)難以穩(wěn)定存在，而預(yù)先導(dǎo)入外源DNA 到甲基化修飾缺陷的大腸桿菌（Dam-），再與鏈霉菌進行接合轉(zhuǎn)移時，可有效降低鏈霉菌對外源DNA 的限制作用，提高鏈霉菌的轉(zhuǎn)化效率[29]；（2）插入oriT 位點的穿梭載體，可借助供體菌大腸桿菌內(nèi)pUZ8002 質(zhì)粒上的tra基因區(qū)進行接合轉(zhuǎn)移，實現(xiàn)跨屬種可控性的基因轉(zhuǎn)移[29]。另外，在鏈霉菌中，由于種間變異，鏈霉菌的接合轉(zhuǎn)移條件具有高度菌種特異性，需要為不同種類菌株找到適當(dāng)?shù)慕雍限D(zhuǎn)移條件[12,14,26]。

Du等[30]采用鏈霉菌S.lincolnensisATCC25466孢子作為受體與大腸桿菌接合時，未獲得接合子，而選擇菌絲作為受體后，成功建立了高效的屬間轉(zhuǎn)化體系。Rocha等[28]對不產(chǎn)孢的鏈霉菌S.peucetiusvar.caesiusNRRL B-5337 同樣使用氣生菌絲作為受體，獲得了高效的接合效率，為其他不產(chǎn)孢鏈霉菌的遺傳操作提供了參考。Song 等[24]發(fā)現(xiàn)龜裂鏈霉菌M527 可使用菌絲作為接合轉(zhuǎn)移的受體菌，但效率遠低于孢子。前期課題組同樣嘗試使用菌株X33 的菌絲作為受體菌進行接合轉(zhuǎn)移，但未成功獲得接合子。表明不同種的鏈霉菌在接合轉(zhuǎn)移過程中適用的受體形態(tài)不同。

MS培養(yǎng)基是一般鏈霉菌產(chǎn)孢和接合轉(zhuǎn)移的通用培養(yǎng)基[22]。淡紫灰鏈霉菌gCLA4[17]和鏈霉菌769[10]在MS 上進行接合轉(zhuǎn)移的效率最高，在高氏一號培養(yǎng)基上幾乎無法獲得接合子；而固氮鏈霉菌WZS021[15]在高氏一號上的接合效率明顯高于MS；另一個淡紫灰鏈霉菌菌株FRI-5[16]的最佳培養(yǎng)基為ISP（含10 mm MgCl2）。表明不同種甚至不同株系鏈霉菌最適的接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基不同，且對效率影響較大。接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基既要適合鏈霉菌生長，又要使大腸桿菌生長放緩，縮小兩種菌的生長速度的差距有利于兩者接合轉(zhuǎn)移過程的發(fā)生[10]。淡紫灰鏈霉菌X33在高氏一號上的接合轉(zhuǎn)移效率最佳，因此選擇高氏一號為接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基。

對受體菌進行適當(dāng)溫度的熱激處理可以提高孢子的萌發(fā)頻率，進而提高接合轉(zhuǎn)移效率[11]，而溫度過高可能會導(dǎo)致部分孢子的損傷或失活。淡紫灰鏈霉菌FRI-5[16]的最適熱激溫度為40 ℃，固氮鏈霉菌WZS021[15]、楊凌鏈霉菌KM-1-2[5]和淡紫灰鏈霉菌gCLA4[17]的最適熱激溫度均為50 ℃，而55 ℃處理后，以上四者的接合轉(zhuǎn)移效率都幾乎為0。不同的是，淡紫灰鏈霉菌X33 在55 ℃熱激處理時的接合轉(zhuǎn)移效率最高，在60 ℃和65 ℃處理后仍有一定的接合效率。推測不同種系鏈霉菌孢子的耐熱性不同，菌株X33在55 ℃處理10 min 的孢子存活率無明顯下降，且提高了孢子的萌發(fā)率。故菌株X33 的最佳熱激處理為55 ℃10 min。

孢子在預(yù)萌發(fā)時長出芽管，利于接合轉(zhuǎn)移的發(fā)生，但不同種的鏈霉菌最適預(yù)萌發(fā)時間區(qū)別較大。加納鏈霉菌ATCC 14672 預(yù)萌發(fā)3 h 的接合效率相對較高[11]；鏈霉菌S-28 不進行預(yù)萌發(fā)處理的接合轉(zhuǎn)移效率最高，預(yù)萌發(fā)時間越長，反而使接合轉(zhuǎn)移效率越低[23]；而菌株X33的預(yù)萌發(fā)為1 h時接合效率最高，超過1 h后接合效率持續(xù)下降。

Xu 等[20]通過以β-葡萄糖苷酶（GUS）為報告基因篩選到較強轉(zhuǎn)錄活性的啟動子SPL-21，通過構(gòu)建toyF基因過表達菌株，進一步證明了SPL-21 較強的轉(zhuǎn)錄活性且適用于功能基因的表達。Siegl 等[19]通過以gusA為報告基因表征人工合成的啟動子庫，發(fā)現(xiàn)gusA基因的轉(zhuǎn)錄水平與GUS 蛋白活性高度相關(guān)，證實gusA可作為表征啟動子轉(zhuǎn)錄水平的報告系統(tǒng)。試驗選擇以GUS 蛋白為報告基因，成功獲得了相應(yīng)的4個內(nèi)源性啟動子及permE啟動子表征菌株，通過染色法及酶活測定比色法對不同啟動子下表達GUS進行活性測定，表明啟動子permE 的活性相對較高，后續(xù)考慮利用該啟動子在菌株X33 中進行其他目的基因的表達。

淡紫灰鏈霉菌X33遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立與優(yōu)化是對其進行分子生物學(xué)研究和驗證基因功能的必要前提，為提高活性物質(zhì)的產(chǎn)量、實現(xiàn)基因工程菌株的構(gòu)建及進一步對菌株資源的開發(fā)等奠定基礎(chǔ)。GUS報告系統(tǒng)可繼續(xù)用于篩選其它適用于菌株X33表達的強啟動子。

4 結(jié)論

通過接合轉(zhuǎn)移的方法成功建立淡紫灰鏈霉菌X33 的遺傳轉(zhuǎn)化體系，并優(yōu)化接合轉(zhuǎn)移條件，包括：培養(yǎng)基、熱激溫度、預(yù)萌發(fā)時間、供受體比例及抗生素覆蓋時間等5個因素，確定了最佳接合轉(zhuǎn)移條件，即：菌株X33 的孢子于55 ℃熱激10 min，預(yù)萌發(fā)1 h，供受體比例為10∶1，以高氏一號為接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基，混合培養(yǎng)12 h 后覆蓋含抗生素Apr 和Nad 的無菌水，接合轉(zhuǎn)移效率可達5.8×10-5。通過分析內(nèi)源性啟動子及permE 的啟動活性，表明鏈霉菌常用啟動子permE 的啟動活性遠高于4 個內(nèi)源性啟動子P116、P4565、P5092、P5500。