紅芽芋多糖提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性的研究

李青青，陳 晨，曹艷亭，2，熊建華，王文君，2*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，江西 南昌 330045；2.江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點實驗室，江西 南昌 330045；3.廈門海關技術中心，福建 廈門 361013）

【研究意義】紅芽芋，芋類（Colocasia esculenta（L.）Schott）的一種，又名紅芋、紅眼芋等，為天南星科植物芋的塊莖，富含多糖、維生素、膳食纖維、淀粉及其他功能成分，是熱帶亞熱帶地區(qū)廣泛栽培的作物，原產(chǎn)于中國、馬來西亞、印度等國家[1]。我國江西省上饒市鉛山縣在2016 年特產(chǎn)鉛山紅芽芋年總產(chǎn)量高達15 萬t[2]，目前對紅芽芋的研究主要集中在栽培技術[3-4]，為了進一步開發(fā)和利用紅芽芋資源，將紅芽芋功能成分應用到新藥及功能保健品和綠色食品添加劑等多個領域具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】多糖主要分為植物多糖、動物多糖和微生物多糖，廣泛存在于動植物體內(nèi)和微生物細胞壁中。因其來源廣泛，沒有毒副作用，而且藥物質(zhì)量通過化學手段容易控制等優(yōu)點，成為當今新藥及功能保健品和綠色食品添加劑發(fā)展的新方向[5-7]。芋頭中多糖含量較高，且為具有生物活性的成分之一。研究表明，芋頭多糖具有降血糖[8]、免疫調(diào)節(jié)[9]、抗氧化[10]等作用。植物多糖的提取方法主要有浸提法[11-12]、超聲波輔助法[13]、微波輔助法[9]、脈沖電場輔助法[14]和酶解法。有研究[15]表明，多糖的提取方法會影響其抗氧化活性。楊金濤等[16]采用熱水浸提法、超聲提取法和堿提取法分別提取榆黃蘑多糖，發(fā)現(xiàn)榆黃蘑水提多糖具有更強的自由基清除能力，因此，本研究選擇熱水浸提法提取紅芽芋多糖?！颈狙芯壳腥朦c】雖然已有關于芋頭多糖提取工藝的研究，但對紅芽芋多糖的提取工藝及抗氧化作用未見報道。從紅芽芋分離出具有生物活性的多糖，以此探究紅芽芋多糖的抗氧化活性，因此，優(yōu)化紅芽芋多糖的提取參數(shù)極為重要，從而進一步了解紅芽芋多糖抗氧化活性的強弱?！緮M解決的關鍵問題】本研究以鉛山紅芽芋為試驗材料，通過正交設計優(yōu)化紅芽芋多糖的提取參數(shù)，包括料液比、水浴溫度和水浴時長，采用清除過氧化氫、DPPH 自由基、ABTS+自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基活性和總還原力的能力作為初步考察紅芽芋多糖抗氧化活性的模型，探討紅芽芋多糖的抗氧化活性，以期最大程度地提取紅芽芋多糖，從而提高紅芽芋的資源利用率和經(jīng)濟附加價值，為紅芽芋多糖應用到新藥及功能保健品和綠色食品添加劑等領域提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅芽芋：鉛山紅芽芋（產(chǎn)于江西省鉛山縣葛仙山鄉(xiāng)，采收時間為9月）；木瓜蛋白酶（80萬U/g，北京索萊寶科技有限公司）；α-淀粉酶（3 700 U/g，北京索萊寶科技有限公司）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司）；2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS，北京金克隆生物技術有限公司）；L-抗壞血酸（VC，純度99%，上海藍季生物有限公司）；鄰苯三酚（上海麥克林生化科技有限公司）；Tris-HCl緩沖液（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）；苯酚（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；過氧化氫；葡萄糖；濃硫酸；磷酸鹽緩沖液；鐵氰化鉀；三氯乙酸；三氯化鐵；硫酸亞鐵；水楊酸；氯仿；正丁醇；無水丙酮均為分析純。

1.2 儀器與設備

HC-2518R 高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；GL-21M 高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）SpectraMax M2 酶標儀（Molecular Devices）；XD-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海賢德實驗儀器有限公司）；FE-1D-50 冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；YXQ-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 多糖的制備樣品預處理新鮮紅芽芋→清洗去皮→切片→烘干→粉碎→過篩→多次粉碎后為全粉。

紅芽芋多糖的提?。悍Q取紅芽芋全粉75 g，加入750 mL蒸餾水，混勻，90 ℃水浴提取4.5 h，離心半徑14 cm，4 500 r/min離心15 min，保留上清液，濾渣重新提取。將提取的上清液合并，用95%乙醇（V（樣品）∶V（乙醇）=1∶4）在4 ℃下醇沉12 h；4 500 r/min離心15 min，離心后取沉淀，依次用無水乙醇、無水丙酮和水洗滌沉淀，于50 ℃烘箱中揮發(fā)有機溶劑，復溶至多糖濃度為10 mg/mL，用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)整pH為6，按18 U/g加入α-淀粉酶，60 ℃水浴1.5 h，用I2/KI 溶液檢驗直至碘液不變色；按12 萬U/g 加入木瓜蛋白酶，pH 6，55 ℃水浴1.5 h，沸水浴滅活蛋白酶。再用經(jīng)典的Sevage 法按1∶3（Sevage∶供試液=1∶3）的體積加入Sevage 液（V（氯仿）∶V（正丁醇）=4∶1），反復振蕩10 min，離心半徑14 cm，4 000 r/min，離心15 min 沉淀蛋白，取上清液，重復上述步驟4次。收集上清液濃縮后流動水透析36 h，蒸餾水透析36 h，冷凍干燥得到紅芽芋多糖。

1.3.2 紅芽芋多糖含量測定紅芽芋多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖作為標準品。于試管中依次加入1 mL 不同濃度的葡萄糖標準品、0.3 mL 5%苯酚，然后立即加入2 mL 濃硫酸，搖勻后于60 ℃水浴加熱5 min，冰水浴10 min，冷卻至室溫，在波長483 nm 處測定其吸光度，以葡萄糖濃度為縱坐標，作標準曲線。樣品管以1 mL樣品代替葡萄糖，其余操作與上述標準管步驟相同。記錄其在波長483 nm處的吸光度，平行測定3次取平均值。求出回歸方程為y=0.005 2x+0.114 4，R2=0.994 8，線性關系良好，計算其多糖含量為（70.48±0.10）%。

1.4 單因素及正交設計

1.4.1 紅芽芋多糖水浴提取工藝稱取紅芽芋全粉1 g，加入10 mL蒸餾水，混勻，于70 ℃水浴提取4.5 h，離心半徑8.3 cm，4 500 r/min，離心15 min，保留上清液，濾渣重新提取。將提取的上清液合并，用95%乙醇（V（樣品）∶V（乙醇）=1∶4）在4 ℃下醇沉12 h；離心半徑8.3 cm，4 500 r/min，離心15 min，離心后取沉淀，依次用無水乙醇、無水丙酮和水洗滌沉淀，于50 ℃烘箱中揮發(fā)有機溶劑，復溶至多糖濃度為10 mg/mL，用0.1 mol/L NaOH 溶液調(diào)整pH 為6，按18 U/g 加入α-淀粉酶，60 ℃水浴1.5 h，用I2/KI 溶液檢驗直至碘液不變色；按12萬U/g加入木瓜蛋白酶，pH 6，55 ℃水浴1.5 h，沸水浴滅活蛋白酶。再用經(jīng)典的Sevage法按1∶3（Sevage∶供試液=1∶3）的體積加入Sevage 液（V（氯仿）∶V（正丁醇）=4∶1），反復振蕩10 min，4 000 r/min 離心15 min 離心半徑 min，取上清液，重復上述步驟4 次。收集上清液濃縮后流動水透析36 h，蒸餾水透析36 h，冷凍干燥得到紅芽芋多糖。

1.4.2 單因素試驗設計稱取紅芽芋全粉1 g，根據(jù)預試驗結(jié)果考察料液比1∶4，1∶8，1∶10，1∶16，1∶20 g/mL，水浴溫度50，60，70，80，90 ℃，水浴時長1.5，3.0，4.5，6.0，7.5 h時多糖的得率，每組試驗重復3次。

1.4.3 正交試驗設計根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇料液比、水浴溫度及水浴時長3 個因素設計四因素三水平正交試驗，表1所示為試驗因素和水平。

表1 紅芽芋多糖提取正交試驗的因素和水平Tab.1 Factors and level of extraction of red bud taro polysaccharides by orthogonal test

1.5 體外抗氧化

總還原力的測定：參考初雅潔，龔加順[17]的方法，以VC作為陽性對照組。在波長700 nm處測不同濃度紅芽芋多糖的吸光度，平行測定3次取平均值。

機器學習中的現(xiàn)代個性化的推薦系統(tǒng)與我們的日常生活有著密不可分的聯(lián)系，它使我們的眼界更加開拓。隨著現(xiàn)代計算機科學地迅速發(fā)展，推薦系統(tǒng)中的核心——推薦算法也在不斷的發(fā)展，但每一種算法都還是存在著一定的局限性。在將來的工作中我們可以注重在技術方面上解決這些問題，通過更深入地學習數(shù)學與理論計算機科學知識，去嘗試設計更好的推薦算法，使得推薦系統(tǒng)可以更加成熟。

清除DPPH 自由基能力的測定：參考初雅潔，龔加順[17]的方法，以VC 作為陽性對照組。測不同濃度紅芽芋多糖清除DPPH自由基的效果，平行測定3次取平均值，計算清除50%自由基的樣品濃度（IC50）。

清除ABTS+自由基能力的測定：參考初雅潔，龔加順[17]的方法，以VC 作為陽性對照組。測不同濃度紅芽芋多糖清除ABTS+自由基的效果，平行測定3次取平均值，計算清除50%自由基的樣品濃度（IC50）。

清除羥自由基能力的測定：參考王凱等[18]的方法，以VC 作為陽性對照組。測不同濃度紅芽芋多糖清除自由基的效果，平行測定3次取平均值，計算清除50%羥自由基的樣品濃度（IC50）。

清除超氧陰離子自由基能力的測定：參照趙鶴鵬等[19]的方法，以VC作為陽性對照組。測不同濃度紅芽芋多糖清除自由基的效果，平行測定3次取平均值，計算清除50%超氧陰離子自由基的樣品濃度（IC50）。

清除過氧化氫能力的測定[20]：分別取不同濃度的紅芽芋多糖溶液100 μL 于5 mL 離心管中，分別加入10 mmol/L 過氧化氫溶液600 μL，用pH=7.4 的PBS 緩沖溶液定容到3 mL，均勻混合，在波長230 nm 條件下考察紅芽芋多糖對過氧化氫的清除作用。其中，樣品的吸光度記為Ai，對照組用PBS緩沖液替代樣品，在波長230 nm 條件下的吸光度記為Ac，空白組用蒸餾水代替樣品，在波長230 nm 條件下的吸光度記為A0。用VC作為陽性對照組，平行測定3次取平均值，計算清除50%過氧化氫時的樣品濃度（IC50）。

1.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS Statistics 19 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，結(jié)果均以均值±標準誤差表示，使用Originpro 9.1作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素及正交試驗

2.1.1 料液比、水浴溫度及水浴時長對紅芽芋多糖水浴提取工藝的影響由圖1可知，紅芽芋多糖受料液比、水浴溫度及水浴時長等因素影響，且不同因素對紅芽芋多糖得率的影響不同。由圖1（1）可知，紅芽芋多糖得率隨著料液比的升高先增大后減小，當料液比為1∶8時，紅芽芋多糖得率達到最大（5.56%），各個水平之間存在極顯著差異（P＜0.01），各水平按紅芽芋多糖得率大小依次為1∶8、1∶10、1∶4、1∶16、1∶20（紅芽芋多糖得率分別為5.56%、1.94%、1.49%、0.70%、0.35%），因此，料液比的最佳選擇為1∶8 g/mL，這與楊秀芳等[21]對陜西芋頭多糖的提取結(jié)果基本一致。由圖1（2）可知，紅芽芋多糖得率隨著水浴溫度的升高先減小后增大，水浴溫度為70 ℃時得率最小，僅為1.94%，水浴溫度為90 ℃時，紅芽芋多糖得率可達6.72%，除水浴溫度50 ℃與60 ℃之間不存在極顯著差異（P＞0.01）外，其他水平間均存在極顯著差異（P＜0.01），因此，本試驗水浴溫度的最佳選擇為90 ℃。由圖1（3）可知，紅芽芋多糖得率隨著水浴時間的升高先增大后減小。當水浴時間為6 h 時，多糖得率可達6.38%，各個水平間均存在極顯著差異（P＜0.01），因此，水浴時長的最佳選擇為6 h，這與王瑜等[10]對芋頭多糖的提取結(jié)果一致。

圖1 不同因素對紅芽芋多糖得率的影響Fig.1 Effect of factors on the yield of polysaccharides from red bud taro

2.1.2 正交試驗利用L9（34）正交設計試驗（表1），計算紅芽芋多糖得率，試驗結(jié)果如表2所示。對正交試驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果如表3 所示。從表2 和表3 可知，紅芽芋多糖提取工藝的3 個影響因素中，對得率影響大小依次為：水浴溫度（B）、料液比（A）、水浴時長（C）。方差分析表明，A、B 因素為主要影響因素，A因素對紅芽芋多糖提取工藝有一定影響，B因素對紅芽芋多糖提取工藝有顯著性影響，C因素對紅芽芋多糖提取工藝無顯著性影響，而C因素在單因素試驗中各個水平之間呈極顯著差異（P＜0.01），說明這種混雜因素對C 因素進行了掩蓋，也就是說，在多因素分析中，C 因素在混雜因素的作用下被校正而使得其顯著性消失，這意味著C 因素在紅芽芋多糖的提取工藝存在影響但不是主要因素，又由于C 因素R 值小于誤差列R 值，因此該因素選擇最小值C1，由此得出，在所選水平范圍內(nèi)，紅芽芋多糖最佳工藝為A3B3C1，即：料液比為1∶10 g/mL，水浴溫度為90 ℃，水浴時長為4.5 h。以最佳工藝條件進行紅芽芋多糖提取的放大驗證試驗，平行3 次，紅芽芋多糖的平均得率為（6.34±0.20）%，結(jié)果顯示A3B3C1為最佳提取工藝。

表2 L9（34）正交試驗結(jié)果Tab.2 L9（34）orthogonal test

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

2.2 體外抗氧化

2.2.1 總還原力抗氧化劑能使鐵氰化鉀的三價鐵還原成二價鐵的亞鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀進一步與三氯化鐵反應生成在波長700 nm 處有最大吸光度的普魯士藍，因此，在波長700 nm 處吸光度的高低可以反映抗氧化劑的還原能力大小。由圖2可知，紅芽芋多糖的總還原力與紅芽芋多糖濃度呈正相關，這與蘇穎杰[11]提取的檳榔芋多糖的研究結(jié)果相符合，但是紅芽芋多糖的總還原力相比與VC 更弱，且紅芽芋多糖各個濃度之間總還原力存在極顯著差異（P＜0.01），表明紅芽芋多糖具有一定的還原力。

圖2 紅芽芋多糖總還原力Fig.2 Total reducing power of red bud taro polysaccharides

2.2.2 清除DPPH 自由基能力DPPH 是具有質(zhì)子自由基的重要化合物，一旦接觸質(zhì)子自由基清除劑會使其含量減少，能與有供氫能力的化合物反應，其清除機制主要是氫轉(zhuǎn)移（HAT），DPPH 自由基清除實驗被廣泛應用于評價各種提取物是否具有抗氧化活性或者活性的強度[22-23]。由圖3（1）可知，當紅芽芋多糖濃度從1 mg/mL 增加到6 mg/mL 時，紅芽芋多糖對DPPH自由基清除能力由28.95%增加到62.94%，相同濃度的VC 的DPPH 自由基清除率由88.99%增加到92.53%。當紅芽芋多糖濃度為2 mg/mL 和4 mg/mL 時，DPPH 自由基清除能力存在極顯著差異（P＜0.01）。紅芽芋多糖對DPPH 自由基清除率隨著紅芽芋多糖的濃度的增大而增強，并在一定濃度范圍內(nèi)存在量效關系。由計算可知，紅芽芋多糖IC50為4.46 mg/mL。這說明了紅芽芋多糖可以提供氫原子并對DPPH自由基發(fā)揮強有力地清除活性。

圖3 紅芽芋多糖對自由基清除效果Fig.3 Scavenging effect of red bud taro polysaccharides on free radicals

2.2.3 清除ABTS+自由基能力ABTS 是一種化學性自由基引發(fā)劑，在反應體系中被氧化后會生成穩(wěn)定的藍綠色亞穩(wěn)態(tài)陽離子自由基ABTS+，抗氧化劑與ABTS+自由基發(fā)生反應使溶液褪色生成無色的ABTS，在波長734 nm處有特征吸收，褪色越明顯，則提取物的抗氧化能力越強[24]。亞穩(wěn)態(tài)自由基陽離子可以作為的過氧化物酶底物，作為反映提取多糖的抗氧化活性的指標[22]。由圖3（2）可知，紅芽芋多糖對ABTS+自由基的清除能力較強，當紅芽芋多糖濃度從1 mg/mL 增加到10 mg/mL 時，紅芽芋多糖對ABTS+自由基清除能力由34.81%增加到93.10%，當紅芽芋多糖濃度達到10 mg/mL 時，多糖對ABTS+自由基清除能力與VC對ABTS+自由基的清除能力大致相當，當紅芽芋多糖濃度為1～6 mg/mL時，與10 mg/mL紅芽芋多糖之間對ABTS+自由基清除能力具有極顯著差異（P＜0.01）。由計算可知，紅芽芋多糖的IC50為3.97 mg/mL。ABTS+自由基清除能力隨著紅芽芋多糖濃度增加而增大。有研究[11]表明，檳榔芋多糖對ABTS+自由基的清除能力IC50為4.99 mg/mL，說明紅芽芋多糖比檳榔芋多糖具有更強的清除ABTS+自由基的能力，這可能與多糖的分子量、化學組成等有關[25]。

2.2.4 清除超氧陰離子自由基能力在弱堿環(huán)境下，鄰苯三酚能自氧化反應生成超氧陰離子自由基和有色中間產(chǎn)物，抗氧化劑將超氧陰離子自由基歧化分解為H2O2和O2，從而抑制鄰苯三酚的自氧化反應[22]，而有色中間產(chǎn)物在波長325 nm 處有吸收峰，且產(chǎn)物越多，峰越高。當加入具有·O2-清除能力的抗氧化劑時，抗氧化劑與·O2-迅速發(fā)生反應并阻止有色中間產(chǎn)物的積累，從而吸收峰減弱[26]。由圖3（3）可知，紅芽芋多糖對·O2-的清除能力較差，各濃度之間不存在極顯著差異（P＞0.01），當紅芽芋多糖濃度為6 mg/mL 時，對超氧陰離子自由基的清除能力為18.26%，這和劉楠楠[27]研究荔浦芋多糖對超氧陰離子的結(jié)果基本一致。當VC 濃度從1 mg/mL 增加到10 mg/mL 時，超氧陰離子自由基清除率從26.36%增加到90.17%。這說明紅芽芋多糖存在超氧陰離子清除活性，這可能與多糖結(jié)構(gòu)含有醛或酮、醛或酮，可以釋放O-H穩(wěn)定氫根離子，從而穩(wěn)定·O2-，因此當溶液中的O-H降低時，一些超氧陰離子不穩(wěn)定，導致清除率的降低[28]。

2.2.5 清除羥自由基能力羥自由基易于碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA 發(fā)生反應，導致細胞損傷或死亡，是一類化學性質(zhì)非?；钴S的自由基[29]。水楊酸比色法是反應生成的羥自由基進攻水楊酸分子上的苯環(huán)，生成有色產(chǎn)物[30]，在波長510 nm 處有較強吸收，當反應體系中加入具有清除羥自由基的提取物時會降低其吸光度，所以當有色物質(zhì)越少時，說明提取物對羥自由基的清除能力越強。由圖3（4）可知，當紅芽芋多糖濃度從1 mg/mL 增加到10 mg/mL 時，紅芽芋多糖對羥自由基清除能力由2.81%增加到47.22%，當紅芽芋多糖濃度為6 mg/mL 時，對羥自由基的清除能力為32.95%，這和周東月等[31]研究的黃精多糖對羥自由基的清除能力結(jié)果基本一致。由計算可知，紅芽芋多糖的IC50為9.52 mg/mL，當紅芽芋濃度分別為1 mg/mL 和2 mg/mL 時，它們與濃度為8 mg/mL 的紅芽芋多糖對羥自由基清除能力存在極顯著差異（P＜0.01），同時與濃度為10 mg/mL 的紅芽芋多糖對羥自由基清除能力也存在極顯著差異（P＜0.01）。羥自由基清除能力隨著紅芽芋多糖溶液濃度增加而增大，且羥自由基清除率與質(zhì)量濃度之間存在較好的劑量效應關系，表明紅芽芋多糖具有一定的羥自由基清除能力，這可能是多糖引起電子或氫供體清除羥自由基[28]。

2.2.6 清除過氧化氫能力幾乎所有有氧生物細胞內(nèi)都存在過氧化氫，生物體內(nèi)氧氣在有氧呼吸和光合作用等生命活動過程中由細胞內(nèi)獲取電子和質(zhì)子，在超氧化物歧化酶的作用下生成過氧化氫[32]。過氧化氫是一種弱氧化物，其自身氧化反應不強，但可快速地跨過細胞膜，并與膜內(nèi)二價鐵離子和二價銅離子反應生成羥自由基，從而產(chǎn)生毒性，因此，清除過氧化氫是細胞和人體系統(tǒng)中非常重要的抗氧化防御系統(tǒng)[20]。由圖4 可知，清除過氧化氫能力隨著紅芽芋多糖濃度的升高先增大后減小，且當紅芽芋多糖在1 mg/mL時，清除過氧化氫的清除率已達99.77%，與VC清除過氧化氫的能力相當，當紅芽芋濃度為10 mg/mL時，與6 mg/mL紅芽芋多糖清除過氧化氫存在顯著性差異（P＜0.05），與8 mg/mL紅芽芋多糖清除過氧化氫也存在顯著性差異（P＜0.05）。這說明紅芽芋多糖有很強的清除過氧化氫的清除能力，這可能是因為多糖的組成、單糖類型等不同[33]。

圖4 紅芽芋多糖清除過氧化氫效果Fig.4 The effect of hydrogen peroxide removal by red bud taro polysaccharides

3 討論與結(jié)論

本研究采用熱水浸提法提取紅芽芋多糖，根據(jù)預試驗及單因素試驗發(fā)現(xiàn)紅芽芋多糖得率與料液比、水浴溫度和水浴時長等因素有關。紅芽芋多糖得率隨料液比的升高先增大后減小，當料液比小于1∶8（g/mL）時，紅芽芋多糖得率增大，這可能是當料液比升高時，根據(jù)“相似相溶”原理，多糖溶解度增強得以溶出，當料液比大于1∶8（g/mL）時，相對分子質(zhì)量較小的多糖、低聚糖會提前沉淀[21]，使得多糖溶出率下降，從而導致多糖的得率下降。紅芽芋多糖得率隨水浴溫度的升高先減小后增大，紅芽芋多糖得率水浴溫度為70 ℃時得率最小，水浴溫度為90 ℃時，紅芽芋多糖得率達到最大，為6.72%，這可能是溫度的增加改善了多糖的溶解性。這說明較高的溫度有利于多糖溶解，但溫度過高會破壞多糖的結(jié)構(gòu)。至于水浴溫度小于70 ℃紅芽芋多糖得率下降，蘇穎杰[11]在水浴提取檳榔芋多糖時發(fā)現(xiàn)多糖在60，70 ℃時不易提取。紅芽芋多糖得率隨水浴時間的增加先增大后減小，當水浴時間小于6 h時，多糖得率不斷增大，這可能是水浴時間增加導致多糖的溶出率升高，當水浴時間大于6 h時，多糖得率下降，這可能是因為水浴時間過長導致部分多糖支鏈破壞[34]，多糖黏度降低，使得多糖溶解度下降，且水浴時間過長溶解出來的雜質(zhì)增多，得率降低。因此，進一步采用L9（34）正交設計對這3 個相關因素選擇紅芽芋多糖得率較高且水平間存在極顯著差異的3 水平對水浴提取參數(shù)優(yōu)化，對正交實驗結(jié)果采用事后比較SNK 分析發(fā)現(xiàn)水浴溫度（P＜0.1）和料液比（P＜0.25）為主要影響因素，水浴時長對紅芽芋多糖得率無顯著性差異（P＞0.25），這可能是由于多因素分析時混雜因素調(diào)整了水浴時長因素使得其顯著性消失。通過分析選擇料液比1∶10（g/mL）、水浴溫度90 ℃、水浴時長4.5 h作為紅芽芋多糖的最佳提取工藝，該條件下紅芽芋多糖平均得率為（6.34±0.20）%。有研究表明不同的提取參數(shù)會影響芋頭多糖的得率。蘇穎杰[11]通過響應面設計優(yōu)化提取參數(shù)提取檳榔芋時，其提取溫度為80 ℃、提取時長為0.7 h、料液比為1∶33，多糖得率為5.28%。廖燕玲等[35]通過正交設計優(yōu)化熱水浸提法參數(shù)提取檳榔芋，當提取溫度為70 ℃、提取時長為3 h、料液比為1∶35 時，芋頭多糖的得率為4.89%。多糖的得率是多糖提取工藝的測定指標，可用于評價其提取效果，因此，提取工藝的優(yōu)化是否合理需要考慮提取參數(shù)是否得到優(yōu)化。

不同的提取參數(shù)不僅會影響多糖的得率，還會影響其抗氧化活性，這可能是由于提取參數(shù)的不同會影響多糖的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或構(gòu)象，從而導致抗氧化活性的不同。本研究在水浴溫度為90 ℃，料液比為1∶10（g/mL），水浴提取4.5 h 的條件下紅芽芋多糖平均得率為（6.34±0.20）%，此時紅芽芋多糖具有較好地清除過氧化氫、DPPH 自由基、ABTS+自由基和羥自由基活性，但紅芽芋多糖的總還原力不強，對·O2-清除能力較弱。其原因可能有以下三種：

一是多糖的單糖類型不同。蘇穎杰[11]采用熱水浸提法檳榔芋多糖，發(fā)現(xiàn)檳榔芋多糖由葡萄糖（90.64%）、半乳糖醛酸（3.72%）、半乳糖（3.66%）、阿拉伯糖（0.74%）、甘露糖（0.62%）和鼠李糖（0.61%）組成，并具有良好的清除DPPH 自由基、ABTS 自由基和羥自由基活性。而Sokolova 等[36]認為紅藻多糖清除羥自由基的能力很大程度上依賴于其濃度，多糖的結(jié)構(gòu)在清除羥自由基過程中并不重要，同時研究發(fā)現(xiàn)紅藻多糖對過氧化氫是惰性的。而紅芽芋多糖卻具有較強的清除過氧化氫能力，這可能是因為多糖的組成、單糖類型等不同。據(jù)報道[33]，淀粉葡糖苷酶水解物半乳糖（27.3%）、葡萄糖（64.5%）和甘露糖（8.3%）組對過氧化氫具有較強的抗氧化作用，且呈劑量依賴性。

二是芋頭多糖中含有半縮醛還原基、伯仲羥基等與氧自由基有明顯的化學作用[10]，此外，其抗氧化作用與單糖相連的糖基鍵密切相關。研究發(fā)現(xiàn)[9,14-15,27,37]，芋頭多糖其單糖組成均為葡萄糖、木糖、半乳糖、鼠李糖和甘露糖，這些單糖中含有半縮醛還原基、伯仲羥基等基團可以與氧自由基發(fā)生作用。Klaus 等[38]也發(fā)現(xiàn)不同方法提取的野生擔子菌實體多糖中最主要的單糖均是葡萄糖，且DPPH 自由基、總還原力與α-葡聚糖含量呈正相關。Lo 等[39]則采用多元線性回歸（MLRA）分析研究了多糖的抗氧化性能與單糖或糖基連接的關系，結(jié)果表明單糖的組成和比例以及糖基鍵的類型會影響多糖的抗氧化活性。具體來說，鼠李糖和甘露糖在所有4 種抗氧化模型（共軛雙烯模型、還原力模型、DPPH 清除模型和亞鐵離子螯合模型）的MLRA 分析中都顯示出正相關，同時，側(cè)鏈上的糖基鍵，特別是側(cè)鏈上的阿拉伯糖1→4 和甘露糖1→2 與還原能力密切相關，而葡萄糖1→6 和阿拉伯糖1→4 與清除DPPH 自由基能力密切相關。

三是多糖與其他化合物結(jié)合的雜質(zhì)存在，也會使得紅芽芋多糖展現(xiàn)出一定的抗氧化活性。本研究中紅芽芋多糖的含量為70.48%，還有部分其他化合物的存在。而有研究報道芋頭中含有花青素、矢車菊素-3-葡萄糖苷等黃酮類化合物等[40]，該類物質(zhì)具有一定的抗氧化活性。

本研究采用正交設計結(jié)合熱水浸提法提取紅芽芋多糖，當水浴溫度為90 ℃，料液比為1∶10（g/mL），水浴提取4.5 h 時多糖平均得率為（6.34±0.20）%，同時發(fā)現(xiàn)紅芽芋多糖具有較好地清除過氧化氫、DPPH自由基、ABTS+自由基和羥自由基活性，但多糖的總還原力不強，對·O2-清除能力較弱，且紅芽芋多糖對不同自由基清除能力存在差異。