紫花苜蓿MsCCD4基因克隆及耐鹽功能鑒定

陳筱冉， 張銘笑， 嚴(yán)建萍， 劉燕蓉， 張萬軍

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 北京 100193)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是世界上種植面積最大的豆科牧草[1]，被廣泛用作飼草、蔬菜和綠肥作物[2]，因營養(yǎng)價值高、適口性好等優(yōu)點，被譽(yù)為“飼料皇后”[3]，是我國廣泛栽培的優(yōu)良牧草[4]。紫花苜蓿的栽培歷史悠久，全球栽培面積約達(dá)3 000萬公頃[5-7]。我國苜蓿主要分布在黃河流域及以北的廣大地區(qū)[8-9]。隨著氣候變化、生態(tài)及環(huán)境問題嚴(yán)重、澆灌水質(zhì)的下降，苜蓿產(chǎn)區(qū)(如內(nèi)蒙古半干旱、干旱地區(qū))土壤鹽漬化程度不斷加劇，已嚴(yán)重制約了苜蓿草產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[5,10]。鹽脅迫下，紫花苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì)顯著降低，并且其根瘤的形成及固氮能力受到嚴(yán)重影響，造成農(nóng)牧民經(jīng)濟(jì)損失[7,11-12]。因此，提高紫花苜蓿耐鹽性對我國草牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

紫花苜蓿是四倍體、異花授粉植物，具有復(fù)雜的遺傳背景，應(yīng)用傳統(tǒng)育種手段周期長、難度大。應(yīng)用基因工程手段對紫花苜蓿耐鹽性進(jìn)行遺傳改良是一條理想的途徑。近年來，隨著基因組數(shù)據(jù)的發(fā)表，研究者通過全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome wide association study，GWAS)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等方法大大加快了紫花苜蓿內(nèi)源耐鹽基因的篩選。但是，紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化效率低、周期長，對耐鹽基因的功能鑒定進(jìn)展仍然十分緩慢。發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)屬于根瘤菌科(Rhizobitaceae)農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)，為革蘭氏陰性土壤細(xì)菌，其攜帶的Ri質(zhì)粒能侵染絕大多數(shù)雙子葉植物，誘發(fā)植物受傷部位長出不定根，并將Ri質(zhì)粒中攜帶的基因轉(zhuǎn)移到被感染植株的基因組中。該不定根能迅速生長，并產(chǎn)生多個分枝，呈毛發(fā)狀，稱為毛狀根(Hairy-root)。毛狀根具有生長速度快，次生代謝產(chǎn)物量高且穩(wěn)定，不需要添加外源植物激素，易獲得再生植株等優(yōu)點，在遺傳改良、基因功能研究、次生代謝產(chǎn)品獲得等方面具有重要應(yīng)用[13]。趙恩華等人建立了苜?！甒L-525HQ’材料的毛狀根轉(zhuǎn)化體系，并對耐鋁基因MsLEA2進(jìn)行了研究，證明了毛狀根轉(zhuǎn)化體系可以應(yīng)用于苜蓿功能基因快速鑒定中[2]。目前，應(yīng)用紫花苜蓿毛狀根體系鑒定耐鹽基因功能的研究尚未見報道。

類胡蘿卜素作為植物抗氧化系統(tǒng)中非酶類抗氧化劑，在植物抗逆性中起著重要作用。類胡蘿卜素裂解雙加氧酶(Carotenoid cleavage dioxygenase,CCD)家族成員催化類胡蘿卜素裂解生成脫輔基類胡蘿卜素[14]，參與植物生長發(fā)育及脅迫應(yīng)答[15]。目前根據(jù)擬南芥基因家族分類方法[16]將CCD基因家族分為類胡蘿卜素裂解雙加氧酶(CCDs)和9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素裂解雙加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED)兩大亞族[17]。NCEDs的過表達(dá)導(dǎo)致內(nèi)源脫落酸(Abscisic acid，ABA)的積累[18-19]，CCD亞家族的成員參與了類胡蘿卜素風(fēng)味、香氣揮發(fā)物和獨腳金內(nèi)酯(Strigolactone，SL)的合成。研究發(fā)現(xiàn)，植物CCD4積極參與干旱、ABA等脅迫應(yīng)答[15,20]。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)CsCCD4b增強(qiáng)了擬南芥對鹽、脫水和氧化脅迫的耐受性，植物中CCD4酶解產(chǎn)物β-紫羅蘭酮顯著增加，增強(qiáng)了植株內(nèi)活性氧代謝酶活性和表達(dá)[20]。

實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)在紫花苜蓿鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中MS.gene073883基因表達(dá)量顯著增高，通過NCBI比對發(fā)現(xiàn)其為MsCCD4基因。為闡明該基因在調(diào)控苜蓿耐鹽性中的功能，本研究通過紫花苜蓿發(fā)根體系，將響應(yīng)鹽脅迫的MsCCD4導(dǎo)入紫花苜蓿葉片誘導(dǎo)獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根，驗證了過表達(dá)MsCCD4對紫花苜蓿耐鹽性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以紫花苜蓿‘中苜1號’植株成熟葉片為試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1基因克隆及生物信息學(xué)分析 本研究以‘中苜1號’紫花苜蓿cDNA為模板，依據(jù)MS.gene073883基因序列設(shè)計引物(MsCCD4_F：ATGATCCCAAA ACCCATCATAATAACAAG和MsCCD4_R：CT ACGACACCGACAACTTGGTGATGTCAC)，PCR擴(kuò)增MsCCD4基因CDS序列。利用ExPASy(SIB Swiss Institute of Bioinformatics，https://www.expasy.org/)網(wǎng)站中的ProParam(https://web.expasy.org/protparam/)工具對MsCCD4蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)以及一級結(jié)構(gòu)中親水性/疏水性的分析。利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)在線軟件進(jìn)行MsCCD4蛋白二級結(jié)構(gòu)的分析。分別采用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)在線軟件和NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在線軟件進(jìn)行同源建模和保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測。

1.2.2鹽脅迫響應(yīng)分析 選取生長4周的‘中苜1號’扦插苗，應(yīng)用1/4霍格蘭營養(yǎng)液添加0 mmol·L-1或200 mmol·L-1NaCl液體培養(yǎng)，在處理0，1，3，6，12 h時取從上往下第一莖節(jié)葉片為樣品，進(jìn)行RNA提取。取1 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA(RR047，Takara)。以cDNA為模板，應(yīng)用Starlighter SYBR Green qpcr Mix (北京啟衡星生物科技有限公司，F(xiàn)S-Q1002)試劑，qTOWER3G(analytik jena)儀器進(jìn)行表達(dá)量檢測。利用2-ΔΔCT方法[21]計算MsCCD4基因的表達(dá)量。每個處理3個生物學(xué)重復(fù)，應(yīng)用SAS 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.3載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 將MsCCD4基因CDS序列組裝至pcGW載體Xba1和BamH1酶切位點之間，受35S啟動子驅(qū)動，潮霉素基因作為篩選標(biāo)記基因。

侵染液制備：利用凍融法將pcGW-MsCCD4質(zhì)粒導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌LBA9402中。將含有目的基因的發(fā)根農(nóng)桿菌用YEB培養(yǎng)基(NaCl 10 g·L-1+酵母提取物5 g·L-1+胰蛋白胨10 g·L-1+瓊脂15 g·L-1)搖培至OD6000.8左右。菌液3 000 r·min-1離心10 min，用重懸液(MS 2.95 g·L-1+蔗糖30 g·L-1+乙酰丁香酮100 μmol·L-1，pH 5.4)重懸菌液至OD600至0.5，28℃放置30 min，備用。

外植體浸染及共培養(yǎng)：選取‘中苜1號’紫花苜蓿植株葉片作為外植體，50%次氯酸鈉溶液震蕩漂洗5 min左右，無菌水沖洗5～10次。將無菌葉片浸泡于重懸液中，負(fù)壓浸染10 min。然后80 r·min-1搖培浸染20 min，棄菌液，將侵染后的葉片置于無菌濾紙上，吸干表面菌液。將葉片置于含有一層濾紙的共培養(yǎng)基上(MS 2.95 g·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂8 g·L-1+乙酰丁香酮100 μmol·L-1，pH 5.8)，(25 ± 1)℃下暗培養(yǎng)3 d。

除菌培養(yǎng)：將共培養(yǎng)后的材料置于除菌培養(yǎng)基(MS 2.95 g·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂8 g·L-1+頭孢噻腭鈉(Cef)500 mg·L-1+潮霉素5 mg·L-1，pH 5.8)。黑暗條件下25℃恒溫培養(yǎng)。每隔2周換一次培養(yǎng)基。待根長到1.5 cm以上時，將毛狀根從葉片上分離，轉(zhuǎn)移入新的除菌培養(yǎng)基，每2周換一次培養(yǎng)基。

1.2.4轉(zhuǎn)基因毛狀根鑒定 挑選生長迅速的毛狀根進(jìn)行培養(yǎng)，采用CTAB法抽取總DNA進(jìn)行PCR鑒定。PCR引物為：35s_F—CGCACAATCCCACTATCCTTC，MsCCD4_R—CTACGACACCGACAACTTGGTGATGTCAC。應(yīng)用Trizol試劑提取毛狀根RNA，依據(jù)上述方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄與表達(dá)量檢測。qRT-PCR引物為:MsCCD-qRT-F—CCTCG TGACCACCCTGACCTAC，MsCCD-qRT-R—TT-G CCGTCGTCCTTGAAGAAGATG。

1.2.5毛狀根耐鹽性檢測 將相同長度的PCR陽性毛狀根及對照毛狀根根段分別轉(zhuǎn)接至含有0 mM、30 mM和50 mM NaCl的固體培養(yǎng)基上。培養(yǎng)2周后，觀察毛狀根的色澤及生長狀況。耐鹽性篩選培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基2.95 g· L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂8 g·L-1+ NaCl 0 mmol·L-1/30 mmol·L-1/50 mmol·L-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花苜蓿MsCCD4基因克隆及生物信息學(xué)分析

2.1.1紫花苜蓿MsCCD4基因全長序列及蛋白理化性質(zhì) 克隆獲得紫花苜蓿MsCCD4基因全長CDS序列(C-1，圖1)，全長1 745 bp，編碼一個分子式為C2880H4506N750O856S18、相對分子量為63 911.05 kDa、原子數(shù)為9 010、氨基酸殘基數(shù)為581、理論等電點為6.34的氨基酸序列(圖1)。根據(jù)其氨基酸組成(表1)可知，該氨基酸序列中含有堿性氨基酸(K，R)59個；酸性氨基酸(D，E，H)75個，其中Pro(51個，8.8%)，Ile(46個，7.9%)和Gly(45個，7.7%)相對含量比較多；正電荷殘基總數(shù)(Asp + Glu)為63，負(fù)電荷殘基總數(shù)(Arg + Lys)為59；親水性平均數(shù)為—0.270，蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定系數(shù)(Ⅱ)為35.31，表現(xiàn)為穩(wěn)定狀態(tài)，由此推斷MsCCD4可能為穩(wěn)定的酸性蛋白質(zhì)。

圖1 紫花苜蓿MsCCD4氨基酸序列Fig.1 Amino acid sequence of MsCCD4注：C-1，克隆獲得的MsCCD4氨基酸序列；CCD，MS.gene073883基因氨基酸序列；橫線標(biāo)注區(qū)域為RPE65保守結(jié)構(gòu)域Note:C-1,the amino acid sequence of MsCCD4 obtained by cloning;CCD,amino acid sequence encoded by MS.gene073883;The labeled region is RPE65 conserved domain

表1 紫花苜蓿MsCCD4氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of MsCCD4

2.1.2紫花苜蓿MsCCD4蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測 對紫花苜蓿MsCCD4蛋白一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其主要為親水蛋白(圖2A)，二級結(jié)構(gòu)中主要由α螺旋、β折疊以及無規(guī)則卷曲構(gòu)成(圖2B)，其中以無規(guī)則卷曲為主，占54.91%；其次是α螺旋占15.66%；β折疊含量最少，僅占5.16%(圖2C)。MsCCD4蛋白C-端含有RPE65保守結(jié)構(gòu)域(圖1，圖2D)。同源建模發(fā)現(xiàn)模板蛋白的可信度及其與目標(biāo)蛋白的匹配度均較高(圖2E)。

圖2 紫花苜蓿MsCCD4蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.2 Predicted structure for MsCCD4 protein注：A，紫花苜蓿MsCCD4蛋白親水性分析；B，紫花苜蓿MsCCD4蛋白的二級結(jié)構(gòu)；C，紫花苜蓿MsCCD4蛋白二級結(jié)構(gòu)的組成；D，紫花苜蓿MsCCD4蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測；E，紫花苜蓿MsCCD4蛋白三級結(jié)構(gòu)同源建模Note:A,hydrophilic analysis of alfalfa MsCCD4 protein;B,secondary structure of alfalfa MsCCD4 protein;C,composition of secondary structure of alfalfa MsCCD4 protein;D,prediction of conservative domain of alfalfa MsCCD4 protein;E,homology modeling of alfalfa MsCCD4 protein tertiary structure

2.2 鹽脅迫下紫花苜蓿MsCCD4表達(dá)模式分析

在新疆大葉基因組數(shù)據(jù)中獲取MS.gene073883基因上游2 000 bp序列，利用plantCARE對紫花苜蓿MsCCD4基因啟動子元件進(jìn)行分析(表2)。發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)含有11個順式反應(yīng)響應(yīng)元件，包含多個光響應(yīng)元件如ATC-motif，G-box，Box4等；多種激素響應(yīng)元件如茉莉酸響應(yīng)元件CGTCA-motif、脫落酸響應(yīng)元件ABRE、水楊酸響應(yīng)元件TCA-element；含有逆境脅迫響應(yīng)元件如MBS，LTR以及ABRE等。

表2 紫花苜蓿MsCCD4基因啟動子元件分析Table 2 Gene promoter element analysis of MsCCD4

正常培養(yǎng)條件下，紫花苜蓿MsCCD4基因在0 h～6 h表達(dá)量逐漸上升，6 h～12 h表達(dá)量顯著下降，表明其響應(yīng)光周期變化。200 mmol·L-1NaCl處理后，MsCCD4在1 h和3 h的表達(dá)量顯著高于對照，6 h和12 h的表達(dá)量顯著低于對照。以上數(shù)據(jù)表明，光周期變化及鹽脅迫顯著影響MsCCD4基因的表達(dá)(圖3)。

2.3 紫花苜蓿MsCCD4基因耐鹽脅迫性能分析

2.3.1過表達(dá)MsCCD4紫花苜蓿毛狀根的獲得 構(gòu)建過表達(dá)MsCCD4的植物表達(dá)載體pcGW-MsCCD4(圖4A)，將其導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌并侵染紫花苜蓿(圖4B)，侵染后的葉片置于除菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周后，葉片表面長出毛狀根(圖4C)。將生長到1.5 cm以上的毛狀根與葉片分離，置于新鮮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)(圖4D)。挑選生長迅速的毛狀根進(jìn)行培養(yǎng)(圖4E)，采用CTAB法抽取總DNA，進(jìn)行PCR鑒定。PCR檢測結(jié)果表明檢測的10個毛狀根中8個為轉(zhuǎn)基因毛狀根：CCD-1，CCD-2，CCD-4，CCD-5，CCD-6，CCD-7，CCD-9以及CCD-10(圖4F)。定量PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因陽性毛狀根中MsCCD4的表達(dá)量顯著高于對照材料(圖4G)。

圖3 紫花苜蓿MsCCD4基因鹽脅迫響應(yīng)分析Fig.3 Salt stress response analysis of MsCCD4注：CK，未進(jìn)行鹽處理的紫花苜蓿對照組；NaCl，經(jīng)過200 mmol·L-1 NaCl處理的實驗組；*代表不同處理間差異顯著，P<0.05Note:CK,Alfalfa control group without salt treatment;NaCl,The experimental group was treated with 200 mmol·L-1 NaCl;* represents significant difference between different treatment at the 0.05 level

圖4 過表達(dá)MsCCD4轉(zhuǎn)基因毛狀根獲得及鑒定Fig.4 Acquisition and identification of transgenic hairy roots overexpressing MsCCD4注：A，pcGW-MsCCD4載體T-DNA示意圖；B，侵染后葉片共培養(yǎng)；C，侵染后的葉片再生出毛狀根；D，毛狀根除菌培養(yǎng)；E，生長旺盛的毛狀根；F，轉(zhuǎn)基因毛狀根PCR鑒定；M，Marker；N，空白對照；P，PCR模板為質(zhì)粒；1～10為過表達(dá)MsCCD4轉(zhuǎn)基因毛狀根；E1，E2,E3，pcGW載體轉(zhuǎn)化毛狀根；G，轉(zhuǎn)基因毛狀根中MsCCD4表達(dá)量檢測；WT，野生型毛狀根；CCD-1，CCD-5，CCD-7，CCD-10為過表達(dá)MsCCD4毛狀根；*代表與WT相比差異顯著，P<0.05Note：A,schematic diagram of pcGW-MsCCD4 vector T-DNA;B,co-culture of infected leaves;C,the regeneration of leaf hairy root;D,culture of hairy rhizometry;E,vigorously growing hairy roots;F,PCR identification of transgenic hairy roots;M,Marker;N,blank control;P,the PCR template is a plasmid;1～10,overexpressed MsCCD4 transgenic hairy roots;E1,E2,E3,pcGW vector transgenic hairy roots;G,the relative expression level of MsCCD4 in WT and transgenic hairy roots;WT,wild-type hairy root;CCD-1,CCD-5,CCD-7,CCD-10,overexpression MsCCD4 transgenic hairy roots;* represents significant difference compared to WT at the 0.05 level

2.3.2轉(zhuǎn)基因毛狀根耐鹽性檢測 將相同長度的轉(zhuǎn)基因陽性毛狀根(CCD-1、CCD-5和CCD-7)及WT毛狀根片段分別轉(zhuǎn)接至含有0 mmol·L-1，30 mmol·L-1和50 mmol·L-1NaCl的固體培養(yǎng)基上(圖5)。培養(yǎng)2周后統(tǒng)計顯著生長的毛狀根數(shù)量。結(jié)果表明，在0 mmol·L-1和30 mmol·L-1NaCl培養(yǎng)條件下，MsCCD4轉(zhuǎn)基因毛狀根與野生型相比，毛狀根生根數(shù)量無顯著差異(圖5，6)；在50 mmol·L-1NaCl培養(yǎng)條件下，MsCCD4轉(zhuǎn)基因的毛狀根有明顯生長的根數(shù)顯著多于WT(圖6)。并且統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，WT毛狀根的生長顯著受鹽脅迫抑制；MsCCD4轉(zhuǎn)基因的毛狀根CCD-1和CCD-7的生長不受鹽影響，并且CCD-5在鹽脅迫下的生長顯著優(yōu)于對照組。以上研究表明，過表達(dá)紫花苜蓿MsCCD4毛狀根的耐鹽性顯著提高。

圖5 紫花苜蓿毛狀根耐鹽性檢驗Fig.5 Salt tolerance test of alfalfa hairy roots

圖6 鹽脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因顯著生長的毛狀根數(shù)量Fig.6 Number of hairy roots of wild-type and transgenic plants growing significantly under salt stress注：*代表與WT相比差異顯著(P<0.05)Note:* represents that the number of hair roots varies significantly compared to WT at the 0.05 level

3 討論

發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的毛狀根在作物基因功能研究、次生代謝物獲得等方面應(yīng)用廣泛。應(yīng)用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)紫花苜蓿外植體產(chǎn)生毛狀根，鑒定耐鹽基因功能的研究報道較少[22]。本試驗利用紫花苜?！熊?號’離體葉片為外植體，通過發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根，驗證了MsCCD4基因的耐鹽功能。本研究為苜蓿耐鹽遺傳改良提供了新的基因資源，也為苜蓿耐鹽基因的功能快速鑒定提供了一種有效方法。

根是植株感知鹽脅迫和吸收鈉離子的重要植物器官，鹽脅迫抑制根的伸長。因此，可通過觀察毛狀根在鹽脅迫下的生長反應(yīng)，驗證基因在紫花苜蓿中的鹽脅迫功能。紫花苜蓿毛狀根體系具有轉(zhuǎn)化效率高、周期短等優(yōu)點，是鑒定苜蓿耐鹽基因的理想體系。趙恩華等人研究發(fā)現(xiàn)以紫花苜?！甒L-525HQ’葉片為外植體，LBA9402菌液濃度為OD600=0.5、潮霉素濃度為5 mg·L-1時，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高[2]。本研究應(yīng)用同樣條件侵染‘中苜1號’材料，毛狀根轉(zhuǎn)化效率可達(dá)80%。表明，LBA9402對不同苜蓿品種都具有較高的侵染能力。

類胡蘿卜素可在所有光合植物和一些非光合微生物中合成[23]。類胡蘿卜素裂解雙加氧酶CCD是一種催化各種類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為較小的類胡蘿卜素的重要酶，對類胡蘿卜素風(fēng)味、香氣揮發(fā)物和植物激素ABA/SLs的合成以及對非生物脅迫的響應(yīng)至關(guān)重要。CCD4基因?qū)儆贑CD家族中類胡蘿卜素裂解雙加氧酶亞族，其參與C40-類胡蘿卜素和C27-類胡蘿卜素中9,10雙鍵的裂解，這在形成花和果實[24-25]的顏色、風(fēng)味和香氣特性方面具有重要作用。在多種植物如大豆、煙草等中，CCD4基因積極參與干旱、ABA等脅迫應(yīng)答，其裂解類胡蘿卜素產(chǎn)生的β-紫羅蘭酮和β-環(huán)檸檬醛等去異戊二烯，在許多植物中作為脅迫信號分子在高光脅迫下發(fā)揮作用[15,23]。我們前期在紫花苜蓿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫顯著誘導(dǎo)MsCCD4表達(dá)。本研究中經(jīng)過定量檢測進(jìn)一步證明其響應(yīng)鹽脅迫，這可能與其啟動子區(qū)含有多個脅迫響應(yīng)及激素響應(yīng)元件有關(guān)。然而，CCD4基因的在紫花苜蓿中是否參與抗鹽機(jī)制尚不清楚。有報道顯示，在擬南芥中過表達(dá)響應(yīng)鹽和脫水脅迫的番紅花CsCCD4b[26]基因，增強(qiáng)了擬南芥對鹽、脫水和氧化脅迫的耐受性[20]。轉(zhuǎn)基因植株中CCD4酶解產(chǎn)物β-紫羅蘭酮顯著增加，增強(qiáng)了植株內(nèi)活性氧代謝酶活性和表達(dá)[20]。然而，不同物種中CCD4的功能具有一定的特異性。擬南芥AtCCD4可以將8′-apo-β-胡蘿卜素-8′-al分解為β-紫羅蘭酮，而蘋果MdCCD4和菊花CmCCD4幾乎不降解該底物。CmCCD4a和MdCCD4能很好地切割β-胡蘿卜素，生成β-紫羅蘭酮，而OfCCD4、RdCCD4和AtCCD4對該底物幾乎無活性[27]。本研究中克隆了紫花苜蓿的MsCCD4基因，生物信息學(xué)分析表明紫花苜蓿MsCCD4蛋白為酸性的親水性蛋白質(zhì)，C-端含有RPE65保守結(jié)構(gòu)域。這與煙草中NtCCD4的蛋白結(jié)構(gòu)相似[28]。應(yīng)用發(fā)根農(nóng)桿菌LBA9402菌株誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化，我們獲得MsCCD4轉(zhuǎn)基因陽性的紫花苜蓿毛狀根。在50 mmol·L-1鹽脅迫的條件下，MsCCD4基因的紫花苜蓿毛狀根生長表現(xiàn)顯著優(yōu)于野生型紫花苜蓿毛狀根，表明MsCCD4基因提高了苜蓿毛狀根的耐鹽性，可作為紫花苜蓿耐鹽性遺傳改良的分子工具，但具體分子調(diào)控機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究克隆到紫花苜蓿響應(yīng)鹽脅迫的MsCCD4基因，通過發(fā)根農(nóng)桿菌菌株LBA9402侵染紫花苜蓿葉片外植體，獲得轉(zhuǎn)MsCCD4基因的毛狀根。鹽脅迫下，過表達(dá)MsCCD4毛狀根生長表現(xiàn)較好，說明MsCCD4具有耐鹽功能，可提高紫花苜蓿耐鹽性。本研究為紫花苜蓿耐鹽基因鑒定提供了新方法和耐鹽基因資源。