不同質(zhì)量濃度鎘處理對(duì)茶樹菇菌絲體生長(zhǎng)的影響*

朱澤玲，楊財(cái)容，祁偉亮，唐玲潔，劉松青

（成都師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 611130）

食用菌營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，味道鮮美，具有多種醫(yī)藥保健作用，受到越來越多消費(fèi)者的喜愛。但近年來關(guān)于食品重金屬污染（即重金屬含量超標(biāo)）的報(bào)道時(shí)有出現(xiàn)，食用菌受重金屬污染的問題引起人們的關(guān)注，食用菌的質(zhì)量安全也引發(fā)人們討論[1]。隨著對(duì)食用菌研究的深入，發(fā)現(xiàn)多種食用菌自身能夠吸收并積累重金屬；食用菌的培養(yǎng)料中一般含有木屑、秸稈及玉米芯，這些物質(zhì)均能吸收并轉(zhuǎn)化環(huán)境中的重金屬，進(jìn)而轉(zhuǎn)移至食用菌子實(shí)體中[2]。在“土壤→植物→食用菌→人”的物質(zhì)流中，食用菌處在較高等級(jí)，由于食物鏈的富集規(guī)律，食用菌的重金屬含量一般高于植物性食品，其積累的重金屬進(jìn)入人體后，會(huì)對(duì)人體造成危害[3]。

據(jù)報(bào)道，鎘超標(biāo)在重金屬污染中占比較高，鎘在食用菌中富集不僅會(huì)導(dǎo)致其減產(chǎn)，影響品質(zhì)，而且會(huì)通過食物鏈的傳遞危害人體健康[4]。根據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食用菌及其制品》（GB 70976-2014）[5]和國(guó)家安全標(biāo)準(zhǔn)《食品中污染物限量》（GB 2762-2017）[6]，新鮮食用菌中鎘的含量限值為≤0.2 mg·kg-1，其中香菇（Lentinula edodes）和姬松茸（Agaricus blazei）除外。早期關(guān)于重金屬對(duì)食用菌影響的研究，大多集中在對(duì)子實(shí)體中重金屬含量的測(cè)定及其安全性評(píng)價(jià)[7-8]。而后隨著重金屬污染問題越來越受到重視，學(xué)者們開始研究食用菌對(duì)重金屬的富集規(guī)律，目前已有靈芝（Ganoderma lucidum）、金福菇（Tricholoma giganteus）、姬松茸（Agaricus blazei）以及金針菇（Flammulina velutipes）的相關(guān)報(bào)道[9-10]。

此外，研究表明重金屬能夠使生物體中活性氧含量增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞活性降低；而超氧化物歧化酶SOD（superoxide dismutase）、過氧化物酶POD（peroxidase）、過氧化氫酶 CAT（activity and catalase）等抗氧化物酶可消除活性氧；因此SOD、POD、CAT的酶活性可作為判斷細(xì)胞活性氧含量的重要指標(biāo)，進(jìn)而判斷細(xì)胞的健康狀態(tài)[11]。當(dāng)食用菌處在脅迫環(huán)境中時(shí)，細(xì)胞膜會(huì)發(fā)生氧化作用或脫脂作用，最終產(chǎn)生丙二醛MDA（malondialdehyde）；因此MDA含量是生物膜系統(tǒng)受傷害的重要指標(biāo)之一，進(jìn)而判斷該生物受環(huán)境脅迫的程度[12]。

茶樹菇（Agrocybe aegerita）是一種食藥兼用真菌，富含抗癌多糖，具有豐富的藥用價(jià)值及經(jīng)濟(jì)價(jià)值[13]。通過在PDA固體及液體培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的鎘，進(jìn)行茶樹菇菌絲培養(yǎng)，以SOD、POD、CAT的酶活性及MDA含量為指標(biāo)，探究鎘脅迫對(duì)茶樹菇菌絲生長(zhǎng)的影響。為人工控制子實(shí)體吸收重金屬鎘提供理論參考，為茶樹菇的質(zhì)量安全檢測(cè)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

茶樹菇菌株為F2，購(gòu)自高郵市聯(lián)誼食用菌場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 茶樹菇菌絲培養(yǎng)

制備含鎘PDA培養(yǎng)基，鎘的質(zhì)量濃度分別為0（CK）、0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1、0.30 mg·mL-1。用 0.5 cm 打孔器在茶樹菇菌株F2活化平扳上打孔，取活化后的菌絲接種于含鎘PDA固體平板中，26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。每個(gè)處理重復(fù)3次。

茶樹菇菌絲液體培養(yǎng)采用不添加瓊脂的PDA培養(yǎng)基，添加鎘的處理與固體培養(yǎng)相同。每250毫升錐形瓶中分裝100 mL液體培養(yǎng)基，封口后高溫滅菌30 min；無菌條件下用0.5 cm打孔器在茶樹菇菌株F2活化平扳上打孔，取活化后的菌絲接種至錐形瓶中，26℃恒溫振蕩培養(yǎng)10 d。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.2 菌絲生長(zhǎng)速度的測(cè)定

茶樹菇菌絲培養(yǎng)期間，記錄平板中的菌落直徑、培養(yǎng)時(shí)間等數(shù)據(jù)，計(jì)算菌絲平均生長(zhǎng)速度及抑制率，根據(jù)抑制率得到線性回歸方程，計(jì)算其半抑制率 EC50。

茶樹菇菌絲平均生長(zhǎng)速度（v，mm·d-1）的計(jì)算公式為：

式中：l為菌落直徑（mm）；t為培養(yǎng)時(shí)間（d）。

抑制率（EC，%）的計(jì)算公式為：

式中：lc為對(duì)照組菌落直徑（mm）；li為試驗(yàn)組菌落直徑（mm）。

1.2.3 菌絲體鎘含量的測(cè)定

使用紗布過濾液體培養(yǎng)的菌絲，于60℃烘箱中烘干至質(zhì)量恒定。稱取0.1 g菌絲干品，研磨成粉，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中；加入HNO3溶液10 mL，加熱至棕色蒸汽消失并呈現(xiàn)粘稠狀；再加入15 mL體積比為1∶3的高氯酸和硝酸混合液，加熱直至無白色煙霧冒出且溶液無顏色；溶液自然冷卻后用去離子水定容至50 mL。取定容后的溶液1 mL，轉(zhuǎn)移至新的50 mL容量瓶，用去離子水定容至50 mL，使用火焰原子吸收進(jìn)行測(cè)定。菌絲體對(duì)隔的富集率參照參考文獻(xiàn)[11]的計(jì)算方法進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4 酶活性及MDA指標(biāo)測(cè)定

稱取1 g菌絲鮮品放入研缽，加入液氮研磨至粉狀；加入2 mL磷酸緩沖液（濃度為l50 mmol·L-1、pH 7.8），研磨勻漿；轉(zhuǎn)移至10 mL離心管，4℃、12 000 r·min-1離心20 min，上清液即為粗酶液；將粗酶液置于冰水混合物中保存?zhèn)溆谩３趸锩窼OD活性的測(cè)定使用氮藍(lán)四唑法[14]，過氧化物酶POD活性測(cè)定采用Velikova等[15]的方法，過氧化氫酶CAT活性及丙二醛MDA含量的測(cè)定均參照高俊鳳等[16]的方法。各氧化酶的活性均以U·g-1表示；其中U為酶活力國(guó)際單位，表示1 min轉(zhuǎn)化1 μmol底物所需的酶量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；用SPSS Statistics 17．0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)單因素試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鎘處理對(duì)茶樹菇菌絲生長(zhǎng)的影響

2．1．1 茶樹菇菌落特征

茶樹菇菌絲在添加不同質(zhì)量濃度的鎘培養(yǎng)基中脅迫培養(yǎng)10天后，菌落特征見圖1。

圖1 不同質(zhì)量濃度的鎘處理下茶樹菇的菌落特征Fig．1 Colony characteristics of Agrocybe aegerita treated with different mass concentrations of cadmium

如圖1所示，培養(yǎng)基中鎘的質(zhì)量濃度增加時(shí)，茶樹菇菌落直徑逐漸減小，菌絲生長(zhǎng)量也隨之減少。不添加鎘的培養(yǎng)基（CK）中茶樹菇菌絲濃密，顏色潔白，幾乎達(dá)到平板邊緣。隨著鎘的質(zhì)量濃度增加，茶樹菇菌絲逐漸變得纖細(xì)，顏色開始發(fā)黃；接種中心附近的菌絲較邊緣菌絲更濃密；出現(xiàn)棕褐色圈，平板中的菌絲呈現(xiàn)出分圈現(xiàn)象。當(dāng)鎘的質(zhì)量濃度為0．30 mg·mL-1時(shí)，茶樹菇菌絲長(zhǎng)勢(shì)十分微弱，幾乎不生長(zhǎng)，表明鎘對(duì)茶樹菇菌絲有毒害作用，嚴(yán)重抑制其生長(zhǎng)。

2．1．2 茶樹菇菌絲生長(zhǎng)速度及抑制率

鎘脅迫下茶樹菇菌絲生長(zhǎng)速度見圖2。

圖2 不同質(zhì)量濃度的鎘處理下茶樹菇的菌絲生長(zhǎng)速度Fig．2 The mycelial growth rate of Agrocybe aegerita treated with different mass concentrations of cadmium

由圖2可知，隨著鎘質(zhì)量濃度的上升，茶樹菇菌絲的生長(zhǎng)速度逐漸下降，由12．857 mm·d-1下降至1．429 mm·d-1。對(duì)照組（CK）與質(zhì)量濃度為 0．30 mg·mL-1鎘處理組的菌絲生長(zhǎng)速度存在顯著差異（P＜0．05）。

分析不同質(zhì)量濃度鎘對(duì)茶樹菇菌絲的抑制率，結(jié)果見圖3。

圖3 不同質(zhì)量濃度的鎘對(duì)茶樹菇菌絲生長(zhǎng)的抑制率Fig．3 Inhibition rate of different mass concentrations of cadmium on mycelial growth of Agrocybe aegerita

由圖3可知，當(dāng)鎘的質(zhì)量濃度為0．3 mg·mL-1時(shí)，茶樹菇菌絲菌落直徑為1．0 cm，嚴(yán)重抑制了菌絲生長(zhǎng)，抑制率達(dá)88．9%。與對(duì)照組（CK）相比，鎘質(zhì)量濃度為 0．10 mg·mL-1～0．30 mg·mL-1的各個(gè)處理下抑制率均顯示出顯著性差異（P＜0．05）。

對(duì)抑制率（Y）與鎘的質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行回歸分析，得出回歸方程為：

該回歸方程的R2為0．98。

根據(jù)回歸方程計(jì)算得到鎘對(duì)茶樹菇菌絲生長(zhǎng)的半抑制濃度 EC50為 0．167 mg·mL-1。

2.2 不同鎘處理下茶樹菇對(duì)鎘的富集情況

分析茶樹菇對(duì)鎘的富集情況，不同處理下菌絲中鎘含量的測(cè)定結(jié)果詳見圖4，鎘富集率詳見圖5。

圖4 不同質(zhì)量濃度的鎘處理下茶樹菇菌絲中鎘的含量Fig．4 Cadmium content in the mycelia of Agrocybe aegerita treated with different mass concentrations of cadmium

圖5 不同質(zhì)量濃度的鎘處理下茶樹菇菌絲的鎘富集率Fig．5 Cadmium enrichment rate of mycelia of Agrocybe aegerita treated with different mass concentrations of cadmium

由圖4和圖5可知，隨著培養(yǎng)基中鎘質(zhì)量濃度的增加，茶樹菇菌絲中鎘的含量不斷增加，從0．03 mg·kg-1（CK）上升至 0．279 mg·kg-1；各處理與對(duì)照組（CK）相比均存在顯著性差異（P＜0．05）。鎘的質(zhì)量濃度為0．05 mg·mL-1時(shí)，富集率達(dá)到第一個(gè)峰值，為 12．2%，菌絲中鎘含量為 0．092 mg·kg-1；當(dāng)培養(yǎng)基中鎘的質(zhì)量濃度為0．15 mg·mL-1時(shí)，富集率達(dá)到第二個(gè)峰值，為9．933%，菌絲中鎘的含量為0．224 mg·kg-1；隨后，菌絲中鎘的含量隨著培養(yǎng)基中鎘的質(zhì)量濃度上升而上升，但富集率卻隨之減小。原因主要是培養(yǎng)基中鎘較少時(shí)對(duì)茶樹菇菌絲的影響較小，此時(shí)菌絲長(zhǎng)勢(shì)較好，未受到較大迫害，富集率較高；隨著鎘質(zhì)量濃度的上升，茶樹菇的菌絲生長(zhǎng)速度逐漸降低，長(zhǎng)勢(shì)減弱，鎘的富集率也隨之降低。

2.3 不同鎘處理對(duì)茶樹菇抗氧化酶活性的影響

2．3．1 茶樹菇菌絲中SOD的活性

SOD可催化O2·-發(fā)生歧化反應(yīng)產(chǎn)生H2O2和氧氣，從而清除O2·-，減少對(duì)細(xì)胞傷害[17]。細(xì)胞的抗氧化能力可以通過SOD的活性體現(xiàn)，因此SOD可以作為抵御細(xì)胞中抗氧化損傷以及抵抗環(huán)境因子脅迫的重要指標(biāo)。不同質(zhì)量濃度的鎘處理下茶樹菇菌絲中SOD活性詳見圖6。

圖6 不同質(zhì)量濃度的鎘處理下茶樹菇菌絲中SOD的活性Fig．6 SOD activity in the mycelia of Agrocybe aegerita treated with different mass concentrations of cadmium

由圖6可知，隨著培養(yǎng)基中鎘的增加，茶樹菇菌絲中SOD的活性整體呈現(xiàn)出“低促高抑”的變化趨勢(shì)。初始SOD的活性隨著鎘的增加而逐漸增大；當(dāng)鎘的質(zhì)量濃度為1．0 mg·mL-1時(shí)，SOD活性達(dá)到最大值，為36．142 U·g-1；之后SOD活性隨鎘的增加而逐漸降低，當(dāng)鎘的質(zhì)量濃度為3．0 mg·mL-1時(shí)，SOD活性明顯下降且顯著低于對(duì)照組（CK）。

2．3．2 茶樹菇菌絲中POD的活性

POD可以將生物細(xì)胞中存在的多種還原劑作為電子受體，以H2O2為底物，通過催化作用促進(jìn)反應(yīng)并清除生物體中的過氧化物，從而減少生物體中氧化脅迫對(duì)其造成的損害[18]。不同質(zhì)量濃度的鎘處理對(duì)茶樹菇POD活性的影響結(jié)果見圖7。

圖7 不同質(zhì)量濃度的鎘處理下茶樹菇菌絲中POD的活性Fig．7 POD activity in the mycelia of Agrocybe aegerita treated with different mass concentrations of cadmium

由圖7可知，茶樹菇菌絲中POD的活性隨鎘含量的增加呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)。當(dāng)培養(yǎng)基中鎘的質(zhì)量濃度為0．05 mg·mL-1時(shí)，POD的活性達(dá)到最大值；隨后活性逐漸減弱且顯著低于對(duì)照組（CK）。說明當(dāng)鎘的質(zhì)量濃度較低時(shí)，鎘脅迫對(duì)茶樹菇菌絲中的POD有激活作用。

2．3．3 茶樹菇菌絲中CAT的活性

不同質(zhì)量濃度的鎘處理下茶樹菇菌絲中CAT的活性見圖8。

圖8 不同質(zhì)量濃度的鎘處理下茶樹菇菌絲中CAT的活性Fig．8 CAT activity in the mycelia of Agrocybe aegerita treated with different mass concentrations of cadmium

由圖8可知，隨培養(yǎng)基中鎘的增加，茶樹菇菌絲中CAT的活性也呈現(xiàn)出“低促高抑”的變化趨勢(shì)。當(dāng)鎘的質(zhì)量濃度為0．05 mg·mL-1時(shí)，CAT活性達(dá)到峰值，為9．47 U·g-1；之后CAT活性開始下降，當(dāng)鎘的質(zhì)量濃度增加到0．20 mg·mL-1時(shí)，CAT活性已經(jīng)顯著低于對(duì)照組（CK），為3．24 U·g-1。

2.4 不同質(zhì)量濃度的鎘處理對(duì)茶樹菇菌絲中MDA濃度的影響

在外界環(huán)境的脅迫下，細(xì)胞膜脂會(huì)發(fā)生氧化反應(yīng)并產(chǎn)生MDA，通過測(cè)定MDA的含量可判斷茶樹菇菌絲在添加鎘的培養(yǎng)基中細(xì)胞膜系統(tǒng)的受脅迫程度[12]。測(cè)定不同處理下茶樹菇菌絲中MDA的濃度，結(jié)果見圖9。

圖9 不同質(zhì)量濃度的鎘處理下茶樹菇菌絲中MDA的含量Fig．9 MDA content in the mycelia of Agrocybe aegerita treated with different mass concentrations of cadmium

由圖9可知，茶樹菇菌絲受鎘脅迫培養(yǎng)后，鎘的質(zhì)量濃度為 0．05 mg·mL-1、0．10 mg·mL-1、0．15 mg·mL-1時(shí)菌絲中MDA的濃度均顯著高于對(duì)照組（CK）。鎘的質(zhì)量濃度為 0．1 mg·mL-1時(shí)，MDA 的濃度達(dá)到最 大值，為 0．271 μmol·L-1；隨后菌絲 中MDA的濃度隨鎘的增加而降低。原因可能在于茶樹菇菌絲受鎘脅迫后，能夠通過調(diào)節(jié)自身的MDA含量應(yīng)對(duì)外來的傷害。

3 結(jié)果與討論

在已有報(bào)道的研究基礎(chǔ)上，首次測(cè)定了鎘對(duì)茶樹菇菌絲的半抑制濃度EC50=0．167 mg·mL-1。當(dāng)培養(yǎng)基中鎘的質(zhì)量濃度為0．15 mg·mL-1時(shí)，茶樹菇菌絲中鎘的含量為0．224 mg·kg-1，說明半抑制濃度下菌絲中鎘的含量已經(jīng)超過國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)對(duì)食用菌規(guī)定的鎘的限值（≤0．2 mg·kg-1），但此時(shí)茶樹菇菌絲長(zhǎng)勢(shì)較好，顏色潔白，產(chǎn)量良好。通過研究發(fā)現(xiàn)茶樹菇菌絲對(duì)鎘的富集量呈“S”形曲線增長(zhǎng)，這與李艷艷[18]的研究結(jié)果一致。細(xì)胞中的SOD、POD、CAT在受重金屬脅迫后，會(huì)相互作用并共同抵抗膜脂過氧化反應(yīng)的發(fā)生，從而達(dá)到保護(hù)其免受重金屬脅迫的作用[19]。在探究茶樹菇菌絲對(duì)鎘富集的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察了鎘脅迫下菌絲中抗氧化酶系SOD、POD、CAT的活性及MDA的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)其均隨鎘質(zhì)量濃度的增加而呈現(xiàn)出“低促高抑”的變化趨勢(shì)，該結(jié)果與張曉檸[20]和劉敏[21]探究在較低濃度鎘脅迫處理下，靈芝、雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）等食用菌抗氧化酶系的變化結(jié)果類似。整體分析表明，鎘的質(zhì)量濃度為0～0．1 mg·mL-1時(shí)可促進(jìn)茶樹菇菌絲中抗氧化酶系的活性，且菌絲中鎘的含量符合食品安全中規(guī)定的限值，同時(shí)菌絲的生長(zhǎng)速度較快，長(zhǎng)勢(shì)較好，顏色純白。試驗(yàn)中始終根據(jù)食品安全中規(guī)定的食用菌中鎘的限值來設(shè)定鎘的處理濃度，可為茶樹菇的質(zhì)量安全檢驗(yàn)提供理論依據(jù)，同時(shí)也為人工栽培茶樹菇時(shí)控制重金屬鎘的富集提供理論參考。

但此次試驗(yàn)僅停留在不同質(zhì)量濃度的鎘對(duì)茶樹菇菌絲的研究上，而對(duì)出菇后子實(shí)體的影響情況還需進(jìn)一步的研究。從此次試驗(yàn)結(jié)果和已有的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大型真菌對(duì)重金屬具有一定的耐受性和富集作用，當(dāng)茶樹菇面對(duì)外界環(huán)境因子鎘的脅迫時(shí)，菌絲中抗氧化酶系被激活，SOD、POD和CAT的活性增大，可相互作用共同抵御外界傷害，但其機(jī)理十分復(fù)雜，還需從細(xì)胞及分子水平進(jìn)行深入的研究。