菌劑對高寒地區(qū)土壤微生物群落結構及固氮菌群的影響

周 澤， 姚 拓， 史潭梅, 付衛(wèi)剛， 賀善睦， 楊曉蕾， 高麗珍， 李建宏*

(1.甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院， 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室， 甘肅 蘭州 730070； 2.臨潭縣科學技術局， 甘肅 甘南 747500)

青藏高原是我國重要的生態(tài)屏障，它的穩(wěn)定關乎整個國家的生態(tài)環(huán)境安全，而農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)是青藏高原生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分之一[1]，因其特殊的地理條件，加之人類薄弱的耕地保護意識,土壤連年耕作，過量施用化肥，出現(xiàn)了肥料增產效應降低、土壤貧瘠、退化、穩(wěn)定性差等現(xiàn)象[2]。有數(shù)據表明，氮肥利用率僅為29.1%～39.0%[3]。

植物根際促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)是一類具有固氮、溶磷、解鉀、分泌植物激素和拮抗植物病害等作用的有益微生物[4]。在植物中施用不同的優(yōu)良植物根際促生菌研制的復合微生物菌劑，不僅具備以上促生特性，還能減少因生產化肥造成的非再生能源的消耗[5]。因此，近些年有學者嘗試利用植物根際促生菌制劑替代部分化肥，并取得了良好的效果[6-7]。榮良燕等[8]在玉米(ZeamaysL.)中施用菌劑，減少了20%～30%的化肥施用量，同時實現(xiàn)玉米增產9.86%。李永斌等[9]發(fā)現(xiàn)施加菌劑后，在減少10%的尿素使用量下，還能使小麥(Triticumaestivum)增產10.4%。張萬通等[10]在高寒草地施用菌劑部分代替化肥，發(fā)現(xiàn)在減少化肥的施用量的同時，還緩解了因施氮肥引起的物種豐富度下降的情況。目前關于PGPR替代化肥方面研究，主要集中于替代量的選擇、根際土壤養(yǎng)分的變化、植物生長的改變等方面[11-12]。PGPR菌劑發(fā)揮作用，不僅可以通過代謝作用增加有效養(yǎng)分的含量，還能在一定程度上改善土壤微生態(tài)環(huán)境，從而發(fā)揮促生作用[13]。因此，要全面認識PGPR替代化肥的效果，就要了解施用PGPR菌劑對土壤微生物的影響。然而對高寒耕作區(qū)中菌劑部分替代化肥對土壤微生物影響的報道較少。

磷脂脂肪酸(Phospholipid fatty acid,PLFA)是活體微生物細胞膜恒定組分,它對環(huán)境因素比較敏感、能在生物體外迅速降解，特定菌群PLFA數(shù)量改變可反映原位土壤真菌、細菌的活體生物量以及微生物菌群結構的變化[14]。因此，本研究在青藏高原耕作區(qū)使用菌劑與化肥配施，通過分析土壤磷脂脂肪酸，測定土壤中自生固氮微生物數(shù)量、脲酶和硝態(tài)氮等指標。初步探究微生物菌劑部分替代化肥之后土壤微生物群落結構及固氮菌群的變化，以期為高寒草地微生物菌劑的推廣使用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗于2019年在甘南藏族自治州臨潭縣新城鎮(zhèn)進行。樣地位于甘肅省東南部、甘南藏族自治州東部(34°30′～35°05′ N，103°10′～103°52′ E)，屬高山丘陵地區(qū)，地勢西高東低，平均海拔高度2 825 m，年平均氣溫為3.2℃，最高溫度29.6℃，最低溫度-27.1℃，相對無霜期65 d，絕對無霜期10 d[15]，年降水量383.2～668.2 mm，年平均日照時數(shù)2 324 h，屬高寒陰濕區(qū)，是典型的高原農業(yè)區(qū)[16]。

1.2 試驗設計

試驗共設置5個處理，每個處理3次重復。試驗各小區(qū)面積為25 m2，各小區(qū)之間設1.5 m隔離帶，隔離帶中不施肥。試驗地種植植物為青稞(Hordeumvulgarevar.celesteLinnaeus)，品種為‘藏青’，種子來源于當?shù)剞r資市場。無機化肥與菌劑施加量分別為45 kg·hm-2，300 kg·hm-2。供試微生物菌劑由甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院提供(具體配方正在申請專利中)，主要菌株為蕈狀芽孢桿菌Bacillusmycoides Gnyt1(保藏號：CCTCCM 2017177)、枯草桿菌BacillussubtilisLHS11和假單胞菌Pseudomonassimiae240，菌劑有效活菌數(shù)≥1×109cfu·mL-1。無機化肥為磷酸二胺，總養(yǎng)分(N+P2O5)≥64.0%，購買自當?shù)剞r資市場。處理1為單施化肥(T1)、處理2為菌劑+75%化肥(T2)、處理3為菌劑+50%化肥(T3)、處理4為菌劑+25%化肥(T4)、處理5為單施菌劑(T5)，空白對照(CK)為不施肥。在土壤表層0～10 cm取樣，去除雜物，裝入無菌樣品采集袋中，帶回實驗室-80℃保存，用于土壤微生物磷脂脂肪酸等分析。

1.3 土壤微生物PLFA測試

土壤微生物PLFA測試方法為氣相色譜-質譜聯(lián)用技術(GC-MS)法，樣品主要處理流程為提取、分離、酯化[17]。主要試劑為37種脂肪酸混標(FAME)(Supelco,USA)和26種脂肪酸混標(BAME)(Supelco,USA)。GC-MS分析色譜柱采用Agilent Technologies公司的HP-5MS(60 m，250 mm)。具體步驟為140℃，3 min，以每分鐘4℃升溫至190℃。190℃，1 min，然后以每分鐘3℃升溫至230℃，230℃下1 min，之后再以2℃每分鐘升溫至250℃，1 min后，最后以10℃每分鐘升溫至280℃，280℃，1 min。離子源EI+，MS Scan模式全掃描(范圍50～500)[18]。磷脂脂肪酸采用Frostegard[19]方法命名，PLFA可以作為微生物生物量和群落結構變化的生物標記分子[20]，微生物生物量用各PLFA含量加和表示[21]。磷脂脂肪酸(PLFA)分類結果見表1。

表1 特征磷脂脂肪酸分類Table 1 Classification of phospholipid fatty acids (PLFA) Signature

1.4 土壤指標測定

土壤微生物量氮測定采用氯仿熏蒸K2SO4浸提法。浸提液中的土壤微生物量氮采用凱氏定氮法，每個土樣重復3次測定[24]。使用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定土壤脲酶活性[25]。銨態(tài)氮測定采用氯化鉀浸提-靛酚藍比色法(氯化鉀濃度為2 mol·L-1,土水比為1∶5)，土壤硝態(tài)氮測定采用雙波長紫外分光光度校正因數(shù)法，測定結果均以土壤干質量計算[26]。

1.5 土壤自生固氮菌的計數(shù)

好氣性自生固氮菌使用改良阿須貝(Ashby)無氮瓊脂培養(yǎng)基，以平板表面涂布法測定[27]，嫌氣性自生固氮菌使用玉米面培養(yǎng)基，以稀釋法測定[28]。

1.6 統(tǒng)計分析

采用Excel 2019進行數(shù)據統(tǒng)計計算并繪圖，使用R語言(3.5.1)對土壤微生物指標進行相關性分析，SPSS 26.0軟件對數(shù)據進行One-Way ANOVA統(tǒng)計分析和Duncan極差法進行差異顯著性檢驗,數(shù)據為平均值±標準誤。

2 結果與分析

2.1 不同施肥處理下土壤微生物群落結構

2.1.1土壤微生物組成 由表2可知，隨菌劑替代化肥的比例增加，土壤中細菌數(shù)量逐步增加，各處理間差異顯著(P<0.05)。真菌與放線菌數(shù)量變化趨勢同細菌相似，整體呈上升趨勢，都隨菌劑替代化肥的比例增加而增加。土壤總PLFA表示土壤中總微生物量，隨菌劑替代化肥的比例增加，土壤總PLFA也呈現(xiàn)上升趨勢，T1-T5之間差異顯著。(P<0.05)。

表2 不同施肥處理土壤微生物組成Table 2 Soil Microbial Composition in Different Fertilization Ratios

2.1.2土壤微生物群落結構 施用菌劑對土壤微生物群落結構也產生了影響。GP整體呈上升趨勢，T5處理下，GP數(shù)值最高，CK與T5(單施菌劑)處理之間差異不顯著。GN變化趨勢隨菌劑替代化肥比例增加而增大，CK與T5之間無顯著差異。GP數(shù)量始終大于GN數(shù)量，GN/GP呈上升趨勢，除CK外，其余處理之間差異顯著(P<0.05)。B/F呈下降趨勢，隨菌劑替代化肥的比例增加，B/F值變小，除CK外，各處理之間差異顯著(P<0.05)(表3)。

表3 不同施肥處理下土壤微生物群落結構Table 3 Soil microbial community structure under different fertilization ratios

2.1.3土壤微生物壓力指數(shù) 隨菌劑替代化肥比例的增加，微生物壓力指數(shù)減小。T1(單施化肥)、T2(菌劑+75%化肥)、T3(菌劑+50%化肥)與CK相比，差異顯著(P<0.05)。T4(菌劑+25%化肥)、T5與CK之間無顯著差異?；适┯帽壤黾?，微生物壓力指數(shù)增大，說明化肥增加了土壤微生物的脅迫程度，導致土壤微生物壓力指數(shù)增大。

2.2 土壤好氣與嫌氣自生固氮菌群數(shù)量

由圖2可知，菌劑替代化肥的比例增加之后，土壤中自生固氮菌數(shù)量也相應增加。T1與CK處理下，自生固氮菌數(shù)量較少，同施用菌劑相比，差異顯著(P<0.05)。隨菌劑的比例增大，好氣性自生固氮菌數(shù)量變多，嫌氣性自生固氮菌總體呈增加趨勢。土壤中好氣性自生固氮菌數(shù)量大于嫌氣性自生固氮菌。施用菌劑后，好氣性自生固氮菌數(shù)量增加更加明顯。T4處理下，好氣性自生固氮菌數(shù)較T1處理增長40.07%，嫌氣性自生固氮菌增長11.11%。T5與CK處理相比較，自生固氮菌數(shù)量差異顯著(P<0.05)。單施化肥處理下自生固氮菌數(shù)量小于不施肥處理。

圖1 不同施肥處理下微生物壓力指數(shù)Fig.1 Microbial Pressure Index under Different Fertilization Ratios注：誤差線為標準誤。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同Note:The error line is standard error. Different lowercase letters indicate distinct differences,the same as below

圖2 不同施肥處理下好氣性與嫌氣性自生固氮菌數(shù)量Fig.2 Number of Aerobic and Suspicious Azotobacter under Different Fertilization Treatments

2.3 土壤酶活性與氮含量

由表4可知，隨菌劑替代化肥比例增加，土壤脲酶活性隨之升高，CK脲酶活性最低，脲酶活性在T4處理下達到最大值，為0.42 mg·(g·d)-1。微生物量氮隨菌劑比例的增加，呈先上升后下降的趨勢，在T4處理時出現(xiàn)峰值(9.32 mg·kg-1)。CK處理下微生物量氮含量最低。硝態(tài)氮與銨態(tài)氮變化趨勢與微生物量氮相似，呈先上升后下降趨勢，在T4處理達到最大值，分別為9.66 mg·kg-1，6.84 mg·kg-1。

表4 不同施肥處理下土壤酶活性與氮含量Table 4 Soil enzyme activity and nitrogen content under different fertilization treatments

2.4 不同施肥處理下土壤微生物指標相關性分析

由圖3可知，土壤微生物總磷脂脂肪酸與細菌磷脂脂肪酸呈極顯著正相關(P<0.01)，與革蘭氏陰性菌、真菌和放線菌磷脂脂肪酸呈極顯著正相關(P<0.01)。細菌磷脂脂肪酸與革蘭氏陰性菌、真菌的磷脂脂肪酸呈極顯著正相關(P<0.01)。真菌磷脂脂肪酸與放線菌磷脂脂肪酸呈現(xiàn)極顯著正相關(P<0.01)。土壤微生物總磷脂脂肪酸與土壤中微生物的壓力指數(shù)呈極顯著負相關(P<0.01)。革蘭氏陰性菌和真菌磷脂脂肪酸與土壤微生物壓力指數(shù)呈極顯著負相關(P<0.01)。

圖3 土壤微生物各指標相關性分析Fig.3 Correlation analysis of soil microorganism indexes注:*表示在0.05水平上顯著相關；**表示在0.01水平上顯著相關；***表示在0.001水平上顯著相關。GP,革蘭氏陽性菌；Bacteria,細菌；Total PLFA,總磷脂脂肪酸；GN,革蘭氏陰性菌；Fungus,真菌；Actinomycete,放線菌；Urease,脲酶；Microbial nitrogen,微生物量氮；Microbial pressure index,微生物壓力指數(shù)；Nitrate-N,硝態(tài)氮；Ammonium-N，銨態(tài)氮Note:*means significant correlation at the 0.05 level;**means significant correlation at the 0.01 level,***means significant correlation at the 0.001 level。GP,Gram-positive bacteria；bacteria，bacteria；Total PLFA,total phospholipid fatty acid；GN,Gram-negative bacteria；Fungus,fungus；Actinomycete,actinomycete；Urease,urease；Microbial nitrogen,Microbial nitrogen;Microbial pressure index,Microbial pressure index;Nitrate-N,Nitrate-N,Ammonium-N

3 討論

3.1 菌劑替代化肥對土壤微生物群落結構的影響

土壤磷脂脂肪酸可用來表示土壤微生物的生物量以及微生物群落結構[29]，土壤微生物群落多樣性能夠檢測土壤受干擾后的微小變化，描述微生物群落結構的變化和自然或人為干擾對群落的影響[30]。試驗表明，對施用菌劑后的土壤進行PLFA測試分析發(fā)現(xiàn)，提高菌劑替代化肥的比例，土壤總磷脂脂肪酸增加。說明施用菌劑提高了土壤中細菌、真菌、放線菌的數(shù)量，且差異顯著。菌劑中微生物為篩選得到的具有促生能力的優(yōu)良菌株，施用于土壤中，能明顯增加土壤中有益微生物的數(shù)量，致使土壤中微生物量碳、氮和磷的含量增加，微生物量碳、氮和磷也是植物能夠吸收利用養(yǎng)分的主要來源之一[31]。在保證作物產量的同時，使用菌劑替代部分化肥，能減少過量施用化肥帶來的不良后果。CK中微生物數(shù)量與全施菌劑處理下微生物總數(shù)差異不顯著，但CK中好氣性自生固氮菌與嫌氣性自生固氮菌數(shù)量遠小于全施菌劑(T5)處理。土壤中有益微生物數(shù)量占土壤總微生物數(shù)量的主體地位時，土壤才會向良性方向發(fā)展[32]。在養(yǎng)護條件相同的情況下，作物的產量能直接體現(xiàn)土壤的肥力大小。土壤的營養(yǎng)狀況還可以通過革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌之間的比值來反映，比值越高表明營養(yǎng)脅迫程度越低[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，提高菌劑替代化肥的比例之后，革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌比值先升高后降低，在T4處理下達到峰值。說明施用一定量的菌劑能顯著改善土壤的營養(yǎng)狀況。菌劑替代化肥的比例降低之后，土壤微生物的數(shù)量也隨之減少，可能是化肥在一定程度上改變了土壤微生物的群落結構，致使微生物數(shù)量下降。增加菌劑替代化肥的比例，土壤微生物數(shù)量增加，這對于土壤肥力的保持，減少化肥的危害量具有重要的意義。細菌與真菌數(shù)量的比值表示土壤中兩個群落的相對豐度，能夠體現(xiàn)土壤生態(tài)系統(tǒng)對外界緩沖能力，該指標越低，表明生態(tài)緩沖能力越高[33]，施用菌劑之后土壤的緩沖能力顯著提高。說明施用菌劑能提高土壤的抗性，增強土壤應對脅迫的能力。土壤微生物壓力指數(shù)反映土壤中微生物所受的脅迫程度，本試驗中隨菌劑替代化肥的比例增加，微生物壓力指數(shù)減小。說明施用菌劑有利于土壤微生物的生長繁殖，會減少土壤微生物的生存壓力。這與楊淑娜[34]等人的研究結果相同，使用有機肥料或菌肥替代部分化肥，減少了微生物壓力指數(shù)，增加了土壤有機質，從而提升了土壤肥力。

3.2 菌劑替代化肥對固氮菌群、土壤酶活性與氮含量的影響

固氮菌能夠利用自身分泌的固氮酶，將空氣中的N2轉化為可利用的氮素[35]。土壤中自生固氮菌能夠增加土壤中的氮素，從而減少氮肥的施用量。提高菌劑替代化肥的比例，好氣性自生固氮菌數(shù)量與嫌氣性自生固氮菌數(shù)量較CK均出現(xiàn)顯著增加，且各處理間差異顯著(P<0.05)。說明施用菌劑能夠提高土壤中固氮微生物的數(shù)量，進而增加土壤中氮的含量。由此可見，施肥中增加菌劑或者有機類肥料的施用比例，減少無機化肥的施用，對土壤自身肥力的持續(xù)形成具有重要意義。土壤酶在土壤各種養(yǎng)分轉化之間發(fā)揮著重要作用，酶活性的大小能間接衡量土壤肥力[36]。脲酶是土壤酶中一類關鍵的水解酶，其活性能體現(xiàn)出土壤對植物的供氮能力大小。脲酶在土壤的氮素循環(huán)過程中有著不可替代的作用，是土壤中物質轉化與能量代謝的必需物質。土壤微生物數(shù)量及土壤有機質的含量能夠決定土壤中脲酶的活性[37]。在土壤中施用菌劑或有機肥能夠提升土壤中脲酶的活性[38]，本試驗中，提高了菌劑替代化肥的比例，脲酶的活性相應增加。菌劑中的微生物能夠增加土壤有機質，使土壤酶免遭變性或降解，間接增加了土壤脲酶的活性，這也與高佳等人[39]的研究結果相似。土壤微生物量氮能夠體現(xiàn)出土壤中的氮素含量大小[40]。硝態(tài)氮和銨態(tài)氮是土壤中的氮素形態(tài)之一，含量較低，但卻能夠被植物直接吸收利用，所以土壤中硝態(tài)氮與銨態(tài)氮含量能反映出土壤肥力的大小[41-42]。通過試驗發(fā)現(xiàn)，隨菌劑替代化肥比例的增加，土壤微生物量氮先增加后減小，在替代75%化肥處理下，土壤微生物量氮、硝態(tài)氮以及銨態(tài)氮含量最大。說明在保證土壤養(yǎng)分的同時，使用部分菌劑替代化肥，能有效減少化肥的危害。張萬通[10]等人在高寒草地施用菌劑發(fā)現(xiàn)，過高比例的菌劑施用，不會增加土壤中氮素的含量。因此，菌劑并不能完全替代無機化肥，在前人的研究結果中也能得到相應的佐證[43]。后續(xù)的研究中，應對菌劑的配方進行進一步的優(yōu)化，依據土壤的需要，增加菌劑中大量元素或者微量元素的含量，更加有效的提升土壤肥力，以便能減少化肥的施用比例。也應該對土壤的肥力進行進一步的評價，如通過監(jiān)測增加菌劑施用比例或不施肥情況下，作物產量的變化趨勢等。

4 結論

不同處理下菌劑對土壤微生物群落結構與固氮菌群有顯著影響，菌劑+25%化肥處理下，不僅增加了土壤總磷脂脂肪酸，還顯著提高了土壤中好氣性自生固氮菌與嫌氣性自生固氮菌數(shù)量；相較于單施菌劑處理，菌劑+25%化肥處理下土壤脲酶活性，以及硝態(tài)氮、銨態(tài)氮和微生物量氮含量最高，但總PLFA與固氮有益菌數(shù)量略低于單施菌劑處理。綜上，菌劑并不能完全替代化肥，但菌劑的施用在提升了土壤肥力的同時，還改善了土壤微生態(tài)環(huán)境，減少了農藥化肥的使用，間接降低化肥農藥帶來的危害，以及由化肥農藥的施用帶來的食品污染與不可再生能源的消耗。