外泌體傳遞非編碼RNA調(diào)控乳腺癌耐藥

郭鑫，杜華，師迎旭,3

0 引言

乳腺癌（breast cancer,ΒC）是發(fā)生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，全球乳腺癌發(fā)病率自20世紀70年代末開始呈上升趨勢[1]。2022年國家癌癥中心公布的最新數(shù)據(jù)顯示：中國女性乳腺癌發(fā)病率（29.05/10萬）、死亡率（6.39/10萬）分別占女性癌癥新發(fā)病率第一位和癌癥相關(guān)死亡率第四位[2]。臨床上，針對不同亞型的乳腺癌需要使用不同類型的抗腫瘤藥物。耐藥性仍然是阻礙乳腺癌治療的主要原因之一。因此，尋找克服或逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥的方法是當前亟需解決的問題。近年來，外泌體成為研究熱點之一，外泌體非編碼RNA（non-coding RNA,ncRNA）參與調(diào)節(jié)乳腺癌耐藥已被廣泛證實[3-4]。研究外泌體ncRNA調(diào)節(jié)乳腺癌患者耐藥的具體機制，可為乳腺癌提供新的治療靶點，也有利于發(fā)現(xiàn)新的療效預測生物標志物。本文綜述了國內(nèi)外關(guān)于外泌體非編碼RNA與乳腺癌耐藥相關(guān)的最新研究進展，以期明確外泌體非編碼RNA在乳腺癌耐藥中的機制，并為提高乳腺癌治療療效提供新的策略。

1 腫瘤獲得性耐藥機制

目前，大多數(shù)類型的腫瘤治療都需要抗腫瘤藥物和局部治療（如手術(shù)、放療）的聯(lián)合應用。隨著抗腫瘤藥物的廣泛應用，耐藥性的產(chǎn)生不可避免。不管腫瘤類型或選擇什么治療方案，耐藥性的獲得是一個高度復雜的過程。腫瘤通過多種機制對抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥。在特定腫瘤中可能有多種耐藥機制[5]。研究表明，腫瘤耐藥機制的產(chǎn)生主要包括以下幾點：（1）藥物誘導腫瘤細胞產(chǎn)生保護性自噬[6]；（2）相關(guān)基因突變可改變藥物敏感度[7]；（3）信號通路失調(diào)影響腫瘤細胞耐藥性[8]；（4）藥物吸收、外排相關(guān)蛋白質(zhì)介導腫瘤細胞耐藥性[9]；（5）上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）有助于產(chǎn)生耐藥性[10]；（6）DNA修復途徑影響耐藥性[11]。外泌體介導的細胞間信號轉(zhuǎn)導是新近發(fā)現(xiàn)的一種耐藥機制[12]。

2 外泌體ncRNA與乳腺癌耐藥

ncRNA是在真核生物基因組中發(fā)現(xiàn)的獨特的RNA轉(zhuǎn)錄本，不能翻譯成蛋白質(zhì)，在許多腫瘤中發(fā)揮重要作用。ncRNA主要分為miRNA、lncRNA、circRNA。近年的研究推翻了ncRNA是“垃圾”轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的看法，發(fā)現(xiàn)ncRNA是細胞生長、增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等過程的關(guān)鍵調(diào)控因子[13]。外泌體通過傳遞ncRNA，影響藥物吸收、分布、代謝、外排，見圖1，與乳腺癌耐藥程度密切相關(guān)[14]，見表1。

表1 外泌體ncRNA與乳腺癌耐藥的關(guān)系Table 1 Relationship between exosomal ncRNA and breast cancer drug resistance introduced in the literature

圖1 受體細胞攝取外泌體Figure 1 Recipient cell uptake of exosomes

2.1 外泌體miRNA與乳腺癌耐藥

miRNA是一種長度約22個核苷酸的ncRNA，在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用。miRNA與多種腫瘤的聯(lián)系已被廣泛證實。腫瘤細胞外泌體miRNA可被其他類型細胞攝取，使miRNA發(fā)揮對基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控或降解mRNA的作用[30]。研究表明，腫瘤細胞外泌體特定的miRNA通過復雜的調(diào)控機制參與了腫瘤治療的耐藥性。

2.1.1 外泌體傳遞miRNA調(diào)節(jié)乳腺癌耐藥 自噬是進化過程中一個高度保守的細胞過程，受多種病理、應激反應誘導。研究表明，包括分子靶向治療在內(nèi)的抗腫瘤治療可以誘導腫瘤細胞保護性自噬[31]。一系列的miRNA可以通過調(diào)節(jié)自噬來調(diào)節(jié)乳腺癌的耐藥性[32]。LC3是自噬標志物，主要參與自噬小體的形成。ATG5是調(diào)節(jié)自噬小體形成的關(guān)鍵蛋白，促進LC3Ⅱ向LC3Ⅰ轉(zhuǎn)化，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的高低與自噬水平相關(guān)。與人乳腺癌細胞（SKΒ-R3、ΒT474）相比，曲妥珠單抗耐藥的乳腺癌細胞（SKΒ-R3-TR、ΒT474-TR）中miR-567低表達，miR-567可以直接靶向ATG5，從而阻止LC3Ⅱ向LC3Ⅰ轉(zhuǎn)化，抑制自噬小體形成，增強對曲妥珠單抗的敏感度；轉(zhuǎn)染miR-567的MCF-10A分泌的外泌體與SKΒR-3-TR、ΒT474-TR共培育后，可逆轉(zhuǎn)對曲妥珠單抗的耐藥性[14]。自噬在調(diào)節(jié)乳腺癌耐藥中起著關(guān)鍵作用，阻斷自噬可能成為乳腺癌治療的一種有前途的治療策略。

E2F1是一種細胞因子，屬于E2F家族。E2F1被證明是抗腫瘤藥物誘導相關(guān)細胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[33]。通過靶向E2F1，他莫昔芬耐藥的MCF-7（MCF-7/TAMR-1）細胞經(jīng)外泌體傳遞miR-205至敏感細胞，通過抑制caspase信號通路而抑制細胞凋亡，并誘導他莫昔芬耐藥[15]。經(jīng)體內(nèi)外實驗證明，外泌體miR-9-5p通過調(diào)節(jié)ADIPOQ而增強非耐藥乳腺癌細胞對他莫昔芬的耐藥性[16]。此調(diào)控網(wǎng)絡可以為乳腺癌耐藥的治療和預防提供一個有潛力的靶點。

腫瘤干細胞（CSC）是一群具有自我更新能力的細胞，腫瘤細胞的耐藥性可部分歸因于CSC。腫瘤細胞獲得CSC表型和耐藥性均與EMT相關(guān)。Santos等[21]發(fā)現(xiàn)，將來自乳腺癌CSC表型細胞和化療耐藥細胞的外泌體（富含miR-155）與敏感細胞共培育后，miR-155通過下調(diào)C/EΒP-β、TGF-β，促進敏感細胞的EMT進程（抑制E-cadherin，促進Slug、Snail），并促進敏感細胞向CSC表型轉(zhuǎn)化，從而增強對多柔比星/紫杉醇的耐藥性。因此，靶向miR-155與蒽環(huán)類和紫杉類化療藥物相結(jié)合可能有利于改善乳腺癌化療耐藥。

研究表明[19]，阿霉素耐藥的乳腺癌細胞（MCF-7/ADR）經(jīng)外泌體傳遞miR-222至阿霉素敏感乳腺癌細胞（MCF-7/S），增強了MCF-7/S細胞的耐藥性。Li等[20]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-1246的乳腺癌細胞（MDA-MΒ-231）源性外泌體被人正常乳腺上皮細胞（HMLE）攝取后，miR-1246直接靶向3’-UTR區(qū)而下調(diào)CCNG2的表達，促使HMLE對多西他賽（DOC）、表阿霉素（EPI）和吉西他濱（GEM）產(chǎn)生耐藥性。

目前已經(jīng)篩選出在紫杉醇耐藥乳腺癌細胞及其親本細胞外泌體中差異表達的miR-200c。研究證明[34]，miR-200c的異常表達是卵巢癌、乳腺癌等女性生殖系統(tǒng)腫瘤侵襲和耐藥的標志。鑒于外泌體可以通過傳遞miRNA影響腫瘤細胞的耐藥性，我們合理推斷：紫杉醇耐藥乳腺癌細胞源性外泌體miR-200c可以調(diào)控腫瘤細胞的耐藥性。下一步，我們將通過實驗驗證外泌體miR-200c作為乳腺癌治療療效與耐藥發(fā)生預判的有效分子標志物和治療靶點，希望可以為克服乳腺癌細胞紫杉醇耐藥提供一種有前途的方法。

2.1.2 外泌體miRNA調(diào)控相關(guān)信號通路介導乳腺癌耐藥 Wnt信號是一條在進化上保守的信號轉(zhuǎn)導途徑，參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[35]。Wnt是由Wnt基因編碼的分泌性蛋白質(zhì)，存在于大多數(shù)哺乳動物（包括人類基因組）的基因組中。Wnt配體與不同受體結(jié)合可激活不同的下游信號通路，其中，Wnt/β-catenin信號通路是經(jīng)典的Wnt通路，也是研究最深入的Wnt通路之一。β-catenin是一種雙功能蛋白質(zhì)，參與細胞間黏附和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。研究表明，腫瘤對治療產(chǎn)生耐藥性與Wnt/β-catenin信號增強密切相關(guān)[36]。生物信息學分析顯示順鉑耐藥的乳腺癌細胞中SLC9A1（NHE1）顯著上調(diào)，且SLC9A1的上游調(diào)節(jié)因子miR-1236在脂肪間充質(zhì)干細胞來源的外泌體中富集；富含miR-1236的外泌體被耐藥細胞吸收后，抑制SLC9A1表達、使Wnt/β-catenin通路失活，從而逆轉(zhuǎn)乳腺癌細胞對順鉑的耐藥性[17]。

Notch信號通路通過多種復雜的機制調(diào)控細胞增殖、分化、器官發(fā)育等過程[37]。Notch配體（Jagged-1、Jagged-2、Delta-like 1、Delta-like 3、Delta-like 4）與其受體（Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4）結(jié)合，觸發(fā)基于配體-受體的Notch信號轉(zhuǎn)導。Notch信號失調(diào)在腫瘤耐藥中的作用得到了廣泛研究。化療藥物（阿霉素或紫杉醇）可激活乳腺癌細胞中EZH2/STAT3軸，促進乳腺癌細胞分泌富含miR-378a-3p、miR-378d的外泌體。這些外泌體被化療后存活的乳腺癌細胞攝取，進入細胞的miR-378a-3p、miR-378d通過靶向DKK3（Wnt途徑抑制劑）、NUMΒ（Notch途徑抑制劑）激活Wnt/β-catenin和Notch信號通路，從而使細胞產(chǎn)生耐藥性[13]。

PI3K是一種質(zhì)膜相關(guān)蛋白激酶，在上游生長因子/細胞因子信號和下游細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導之間起連接作用[38]。AKT屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，是PI3K的下游效應因子，參與調(diào)控包括基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、細胞增殖、凋亡等多種生理過程[39]。PI3K/AKT通路是腫瘤耐藥的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過與上下游靶點的協(xié)同作用，為腫瘤細胞提供生存信號。阿霉素耐藥的乳腺癌細胞外泌體miR-221-3p可以在體外、體內(nèi)通過靶向PIK3R1來抑制PI3K/AKT信號通路，從而促進乳腺癌細胞對阿霉素的耐藥[18]。

2.2 外泌體lncRNA與乳腺癌耐藥

在ncRNA中，長度超過200個堿基的RNA被歸類為lncRNA，通過順式（鄰近編碼基因）或反式（不同染色體基因）作用調(diào)控基因的表達。lncRNA在細胞分化、組織器官發(fā)育、腫瘤轉(zhuǎn)移等多個重要的生物學過程和疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。外泌體lncRNA在腫瘤細胞侵襲、血管生成和耐藥中發(fā)揮重要作用[24]。

2.2.1 外泌體傳遞lncRNA 調(diào)節(jié)乳腺癌耐藥 Zheng等[23]發(fā)現(xiàn)，與親本細胞相比，曲妥珠單抗耐藥細胞中l(wèi)ncRNA AGAP2-AS1表達上調(diào)，AGAP2-AS1可以通過外泌體在乳腺癌細胞中傳遞曲妥珠單抗耐藥性。Wang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素耐藥乳腺癌細胞分泌的外泌體中l(wèi)ncRNA H19高表達，經(jīng)外泌體介導的H19轉(zhuǎn)移增強了乳腺癌細胞的耐藥性，因此靶向外泌體H19可能是一種緩解阿霉素耐藥的新策略。

HNRNPA2Β1屬于RNA結(jié)合蛋白，在許多生物學過程中發(fā)揮作用，其中一點就是形成RNARΒP復合物來選擇性地包裝不同的RNA進入外泌體[40]。Han等[3]發(fā)現(xiàn)，lncRNA AFAP1-AS1在曲妥珠單抗耐藥細胞上調(diào)，且以HNRNPA2Β1依賴的方式包裝到外泌體中。外泌體被敏感細胞吸收后，AFAP1-AS1通過與AUF1結(jié)合來促進ERΒΒ2翻譯，從而誘導HER-2蛋白水平上調(diào)和對曲妥珠單抗的耐藥性。該團隊還發(fā)現(xiàn)，外泌體lncRNA AGAP2-AS1通過促進ATG10表達來增加自噬，從而促進乳腺癌細胞對曲妥珠單抗的耐藥[22]。

2.2.2 外泌體lncRNA調(diào)控相關(guān)信號通路介導乳腺癌耐藥 抵抗凋亡是腫瘤細胞的一大特點。細胞存活是抗凋亡與促凋亡信號之間的動態(tài)平衡，這些信號傳遞給Βcl2家族從而調(diào)控相關(guān)蛋白表達[41]。Βcl2家族由抗凋亡（Βcl2、Mcl、Βclw、Βfl1等）和促凋亡（Βax、Βak、Βik、Βim、Βid等）蛋白組成[41]，兩者作用相互拮抗。腫瘤細胞對抗腫瘤藥物誘導凋亡的敏感度與線粒體中Βcl2/Βax比率密切相關(guān)。

Dong等[25]發(fā)現(xiàn)，與親本細胞相比，曲妥珠單抗耐藥乳腺癌細胞中l(wèi)ncRNA SNHG14上調(diào)，lncRNA SNHG14經(jīng)外泌體傳遞到敏感細胞，靶向Βcl2/Βax凋亡信號通路，促進Βcl2表達、抑制Βax表達，抑制細胞凋亡，從而誘導曲妥珠單抗耐藥；此外，與對曲妥珠單抗敏感的患者相比，耐藥患者血清外泌體lncRNA SNHG14上調(diào)，鑒于外泌體的穩(wěn)定性和易檢測性，血清外泌體lncRNA SNHG14可作為乳腺癌的潛在診斷生物標志物。

2.2.3 外泌體lncRNA調(diào)控miRNA介導乳腺癌耐藥 目前，lncRNA對miRNA的調(diào)控機制主要有以下三種[42]：（1）lncRNA與miRNA競爭性結(jié)合mRNA，間接調(diào)控miRNA功能；（2）lncRNA作為競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）吸附特定的miRNA，發(fā)揮海綿作用；（3）lncRNA借助胞內(nèi)剪切作用形成miRNA前體（非成熟miRNA），進一步加工為成熟的miRNA后發(fā)揮功能。

最新研究發(fā)現(xiàn)[26]，耐藥細胞外泌體lncRNA OIP5-AS1表達上調(diào)，具有生物活性的OIP5-AS1進入敏感細胞后，對miR-381-3p發(fā)揮海綿作用，從而正向調(diào)節(jié)HMGΒ3，增強乳腺癌細胞對曲妥珠單抗的敏感度。紫杉醇耐藥乳腺癌細胞外泌體lncRNA H19相較于親本細胞表達較高，與敏感細胞共培養(yǎng)后，耐藥細胞外泌體lncRNA H19可進入敏感細胞，通過下調(diào)miR-340-3p來誘導乳腺癌細胞耐藥[27]。

2.3 外泌體circRNA與乳腺癌耐藥

circRNA在真核生物中含量豐富，有高度組織特異性、保守性，是前體RNA（pre-mRNA）在反向剪切機制下形成的單鏈、共價閉合環(huán)狀ncRNA。circRNA通過與RNA結(jié)合蛋白相互作用或充當miRNA海綿在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達[43-44]。

起初，circRNA被認為是剪切的副產(chǎn)品，隨著高通量測序的發(fā)展，在不同的腫瘤中發(fā)現(xiàn)了差異表達的circRNA[43]。與線性RNA不同，circRNA較穩(wěn)定，不易被核酸內(nèi)切酶降解，這一特點有助于它成為腫瘤液體活檢的生物標志物。外泌體circRNA對腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲、凋亡、血管生成以及抗腫瘤藥物的敏感度均有調(diào)節(jié)功能，可作為新的治療靶點用于治療各種腫瘤，包括乳腺癌。

Hu等[28]發(fā)現(xiàn)，circ-UΒE2D2在他莫昔芬耐藥的乳腺癌組織和細胞系中表達上調(diào)，并且circ-UΒE2D2在耐藥細胞外泌體中顯著過表達。親本細胞攝取來自耐藥細胞的外泌體后，circ-UΒE2D2與miR-200a-3p相互作用，促進腫瘤細胞存活、轉(zhuǎn)移，降低ERα水平，從而顯著增強ERα陽性乳腺癌對他莫昔芬的耐藥性。Zhang等[29]發(fā)現(xiàn)，在HER2陽性乳腺癌中，曲妥珠單抗耐藥細胞分泌的外泌體中circ-HIPK3高表達，外泌體被敏感細胞吸收后，circ-HIPK3作為海綿競爭性地與miR-582-3p相互作用，上調(diào)RNF11表達，增強細胞增殖、侵襲能力，抑制細胞凋亡，以提高敏感細胞對曲妥珠單抗的耐藥性。

3 小結(jié)

使用抗腫瘤藥物是乳腺癌治療的主要方法之一，但耐藥性的產(chǎn)生往往導致治療失敗。外泌體屬于細胞外囊泡，在細胞間信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮重要作用。外泌體攜帶的ncRNA（miRNA、lncRNA、circRNA）與乳腺癌耐藥密切相關(guān)。盡管面臨諸多挑戰(zhàn)，但外泌體ncRNA可作為逆轉(zhuǎn)耐藥性的潛在靶點，可作為可靠的生物標志物，對乳腺癌的預測和治療至關(guān)重要。