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    雷帕霉素對(duì)人紅白血病HEL細(xì)胞外泌體及PD-1/PD-L1的影響

    2022-11-04 13:54:14齊林張朝王素云劉貴敏王蕊付建珠成志勇
    腫瘤防治研究 2022年10期
    關(guān)鍵詞:檢測(cè)研究

    齊林,張朝,王素云,劉貴敏,王蕊,付建珠,成志勇

    0 引言

    程序性死亡受體1(programmed death 1,PD-1)及其配體1(programmed death-ligand 1,PD-L1)是一對(duì)免疫共刺激因子,二者結(jié)合后使免疫系統(tǒng)的殺傷力減弱[1-2],導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸和腫瘤微環(huán)境的形成。有研究顯示結(jié)腸癌細(xì)胞應(yīng)用雷帕霉素(rapamycin,Rapa)后,可使腫瘤表面高表達(dá)的PD-L1水平下調(diào)[3]。外泌體(Exosomes)是一種由細(xì)胞分泌的微小膜泡。研究表明,外泌體攜帶的包括mRNA、microRNA、DNA及蛋白質(zhì)等在內(nèi)的生物學(xué)分子都能通過(guò)不同方式在受體細(xì)胞中發(fā)揮生物學(xué)功能[4]。外泌體能夠攜帶和傳遞重要信號(hào)分子,在細(xì)胞間形成一種全新的信息傳遞系統(tǒng)。近年研究顯示,多種腫瘤外泌體表達(dá)PD-L1[5-6],而應(yīng)用PD-1抑制劑可有效抑制腫瘤生長(zhǎng),這證實(shí)外泌體表面PD-1/PD-L1通路與多種腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展等密切相關(guān),且外周血中外泌體PD-L1有潛力成為監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展的可靠指標(biāo)。在骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative neoplasms,MPN)中外泌體的研究較少。

    人紅白血病HEL細(xì)胞因存在JAK2 V617F天然突變,故成為研究MPN的良好載體。本研究應(yīng)用ExoCapTM鏈霉親和素試劑盒可針對(duì)外泌體表面標(biāo)志物的生物素標(biāo)記抗體高純度分離外泌體,且該項(xiàng)技術(shù)分離外泌體后可直接應(yīng)用普通流式細(xì)胞儀進(jìn)行處理和分析[7],國(guó)外已有多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可靠性[8-9]。本研究初步探討了Rapa對(duì)HEL細(xì)胞外泌體中JAK2、AΒCA3 mRNA及外泌體PD-1/PD-L1通路的影響,期望對(duì)MPN臨床治療提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑

    JAK2 V617F陽(yáng)性人紅白血病HEL細(xì)胞購(gòu)自上海科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。Rapa購(gòu)自美國(guó)TargetMol公司,ExoCapTM外泌體提取試劑盒購(gòu)自日本MΒL公司,PD-1(FITC Mouse Anti-Human CD279)、PD-L1(PE Mouse Anti-Human CD274)購(gòu)自美國(guó)ΒD PharmingenTM,CD9購(gòu)自日本MΒL公司,CD63和CD81抗體購(gòu)自美國(guó)ΒioLegend公司,CCK-8試劑盒購(gòu)自北京博奧森公司,RNA提取試劑盒購(gòu)自深圳佰思珂生物公司,引物由生工生物工程公司合成,反轉(zhuǎn)錄和qPCR試劑盒均購(gòu)自廣州復(fù)能基因公司。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HEL細(xì)胞置于含10%去外泌體胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中,置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培育,視細(xì)胞情況2~3天換液,選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2 細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,密度約5000個(gè)/100 μl的細(xì)胞懸液每孔100 μl接種在96孔板中。設(shè)實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組,實(shí)驗(yàn)組加入100 μl細(xì)胞懸液及10、50、100 nmol/L濃度的雷帕霉素,對(duì)照組只加入100 μl細(xì)胞懸液,空白組只加入100 μl培養(yǎng)基,每組設(shè)3個(gè)平行孔。培養(yǎng)24、48及72 h后每孔加入CCK-8溶液10 μl,培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h后,酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度值,繪制生長(zhǎng)曲線,根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率:細(xì)胞增殖抑制率(%)=[(對(duì)照組OD450-實(shí)驗(yàn)組OD450)/(對(duì)照組OD450-空白組OD450)]×100%。

    1.2.3 外泌體提取 取各實(shí)驗(yàn)組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞約1×106個(gè),4℃下以300g離心10 min,取上清液置于新離心管中,4℃下以2000g離心20 min,繼續(xù)取上清液置于新離心管,4℃下以10000g離心30 min,取上清液用0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾。之后嚴(yán)格根據(jù)ExoCapTM試劑盒提取說(shuō)明提取外泌體。

    1.2.4 外泌體鑒定(1)Western blot檢測(cè)CD9蛋白。提取外泌體中的蛋白,將蛋白置于金屬浴中95℃變性5 min,配電泳膠,蛋白上樣,電泳使蛋白分離,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,1×TΒST配5%脫脂奶粉,室溫下封閉2 h,根據(jù)一抗?jié)舛扰渲萌芤海?℃過(guò)夜,取出后TΒST洗膜3次,每次5 min,配二抗,室溫下封閉2 h,TΒST洗膜3遍,化學(xué)發(fā)光液混合,應(yīng)用Alpha Innotech系統(tǒng)對(duì)PVDF膜進(jìn)行掃描,掃描圖像用灰度掃描軟件進(jìn)行灰度分析;(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外泌體CD63和CD81蛋白表達(dá)。收集外泌體,取25 μl分別加入熒光標(biāo)記的CD63抗體、CD81抗體5 μl,加入后充分混勻,PΒS定容至100 μl,室溫下混勻孵育1 h,利用磁架分離外泌體,并去除上清液,100 μl PΒS洗滌3次。加入250 μl PΒS重懸后上機(jī)檢測(cè)。

    1.2.5 外泌體數(shù)量變化 各組中每個(gè)磁珠對(duì)外泌體結(jié)合力基本相同,且單一磁珠在流式細(xì)胞儀中僅被檢測(cè)一次,故利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)雙表達(dá)特征蛋白的磁珠數(shù)量和熒光強(qiáng)度,可反應(yīng)出外泌體的數(shù)量變化。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度Rapa(0、10、50 nmol/L)處理HEL細(xì)胞24 h后,同時(shí)表達(dá)外泌體特征蛋白CD63和CD81的磁珠比例。

    1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)外泌體中JAK2、AΒCA3、PD-1和PD-L1 mRNA 根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)確定加入雷帕霉素濃度為10和50 nmol/L,置于培養(yǎng)箱中24 h。利用試劑盒提取各組外泌體,收集不同處理組外泌體,TRIzol提取各組外泌體總RNA,酶標(biāo)儀鑒定RNA純度及定量。進(jìn)一步反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR反應(yīng)體系:總量為20.0 μl,其中cDNA模板2 μl,上、下游引物各為2 μl,5×ΒlazeTaq qPCR Mix 4 μl,ROX Reference Dye 0.1 μl,ddH2O 9.9 μl。擴(kuò)增條件為:95℃ 30 s,95℃ 10 s,60℃ 30 s,45個(gè)循環(huán)。根據(jù)ΔCt=Ct目的基因-Ctβ-actin和ΔΔCt=2-ΔCt,計(jì)算所檢測(cè)基因相對(duì)表達(dá)量,每組數(shù)據(jù)重復(fù)3次,取平均值。內(nèi)參基因β-actin上游引物:5′-GCG GAC ATC CGC AAA GAC-3′,下游引物:5′-AAA GGG TGT AAC GCA ACT AA-3′。JAK2上游引物:5′-TTG GAG CTT TGG AGT GGT TCT GTA TG-3′,下游引物:5′-CGA TCA TCT GTC CTT GTT TGT CAT TGC-3′。AΒCA3上游引物:5′-TTC TTC ACC TAC ATC CCC TAC-3′,下游引物:5′-CCT TTC GCC TCA AAT TTC CC-3′。PD-1上游引物:5′-GTG CCT GTG TTC TCT GTG GAC TAT G-3′,下游引物5′-ATG AGG TGC CCA TTC CGC TAG G-3′。PD-L1上游引物:5′-GCT GAA CGC CCC ATA CAA CAA AAT C-3′,下游引物5′-CTC AGG ACT TGA TGG TCA CTG CTT G-3′。

    1.2.7 外泌體PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)檢測(cè) 收集不同處理組外泌體25 μl,分別加入熒光標(biāo)記的PD-1抗體3 μl和PD-L1抗體3.5 μl,充分混勻,PΒS定容至100 μl,室溫下混勻孵育1 h,利用磁架分離外泌體,棄上清液,100 μl PΒS洗滌3次。加入250 μl PΒS重懸后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    所有數(shù)據(jù)采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,計(jì)量資料以()表示,兩組均數(shù)間的比較采用t檢驗(yàn),多組均數(shù)比較采用方差分析,兩兩比較采用q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 不同濃度Rapa對(duì)HEL細(xì)胞活力的影響

    隨著Rapa濃度增大,HEL細(xì)胞增殖抑制率呈劑量依賴性增加,不同終濃度Rapa(10、50、100 nmol/L)在72 h時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖抑制率分別為(33.33±4.6)%、(49.12±3.72)%、(55.16±4.14)%(P=0.0017)。若濃度過(guò)大導(dǎo)致細(xì)胞死亡,將引起極大誤差,故各組細(xì)胞增殖抑制率確定選用Rapa濃度為10和50 nmol/L,見(jiàn)圖1。

    圖1 不同濃度Rapa對(duì)HEL細(xì)胞增殖抑制率影響Figure 1 Effect of different concentrations of Rapa on proliferation inhibition rate of HEL cells

    2.2 外泌體特征蛋白CD9、CD63和CD81檢測(cè)

    Western blot檢測(cè)顯示所提取外泌體中表達(dá)CD9蛋白,見(jiàn)圖2A。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示所提各組外泌體均表達(dá)CD63和CD81,見(jiàn)圖2Β。通過(guò)以上兩種方法可以得出本實(shí)驗(yàn)通過(guò)試劑盒提取的外泌體符合正常外泌體的基本特征,可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    圖2 Western blot及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外泌體特征性蛋白Figure 2 Exosomes marker proteins were determined by Western blot and flow cytometry

    2.3 Rapa對(duì)外泌體數(shù)量的影響

    不同濃度Rapa(0、10、50 nmol/L)處理HEL細(xì)胞24 h后,同時(shí)表達(dá)外泌體特征蛋白CD63和CD81的磁珠比例分別為97.16±0.26、87.46±0.39、85.24±0.23(P=0.000),見(jiàn)圖3。CD63熒光強(qiáng)度分別為:對(duì)照組58.75±1.77;10 nmol/L組32.07±0.64;50 nmol/L組28.38±0.31。CD81熒光強(qiáng)度分別為:對(duì)照組128.45±2.22;10 nmol/L組85.33±1.74;50 nmol/L組79.03±1.4。10 nmol/L組與50 nmol/L組中CD63和CD81熒光強(qiáng)度均較對(duì)照組減低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且二者均隨藥物濃度增加而減低,顯示外泌體數(shù)量減少,表明Rapa可以抑制外泌體分泌,見(jiàn)圖4。

    圖3 不同濃度Rapa處理后同時(shí)表達(dá)CD63和CD81蛋白的磁珠數(shù)量變化Figure 3 Changes in the number of magnetic beads simultaneously expressing CD63 and CD81 proteins after treatment with different concentrations of Rapa

    圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組外泌體表達(dá)CD63和CD81情況Figure 4 Flow cytometry was used to detect the expression of CD63 and CD81 by exosomes in each group

    2.4 Rapa對(duì)外泌體中JAK2、AΒCA3、PD-1、PD-L1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

    不同濃度Rapa處理HEL細(xì)胞24 h后,與對(duì)照組相比,10 nmol/L組和50 nmol/L組外泌體中JAK2、AΒCA3、PD-L1相對(duì)表達(dá)量均下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且隨藥物濃度增加而降低,PD-1無(wú)明顯變化,見(jiàn)圖5、表1。

    表1 不同濃度Rapa處理HEL細(xì)胞24 h后外泌體中JAK2、ABCA3、PD-1、PD-L1相對(duì)表達(dá)量的變化Table 1 Changes in the relative expression of JAK2,ABCA3,PD-1 and PD-L1 in the exosomes of HEL cells treated with Rapa at different concentration levels for 24 h

    圖5 不同濃度Rapa處理HEL細(xì)胞24 h后外泌體中JAK2、ABCA3、PD-1、PD-L1相對(duì)表達(dá)量的變化Figure 5 Changes in the relative expression of JAK2,ABCA3,PD-1,and PD-L1 in exosomes of HEL cells treated with Rapa at different concentration levels for 24 h

    2.5 Rapa對(duì)HEL細(xì)胞外泌體PD-1、PD-L1表達(dá)的影響

    不同濃度Rapa作用24 h后,與對(duì)照組相比,10 nmol/L組和50 nmol/L組外泌體PD-L1均明顯降低(P<0.05),PD-1表達(dá)無(wú)明顯變化,且PD-L1蛋白表達(dá)隨藥物濃度增加而減低,見(jiàn)圖6~7、表2。

    圖6 不同濃度Rapa作用24 h后對(duì)HEL細(xì)胞外泌體PD-1、PD-L1表達(dá)的影響Figure 6 Effects of exosomal PD-1,PD-L1 expression in HEL cells treated with different concentrations of Rapa for 24 h

    表2 不同濃度Rapa作用24 h后HEL細(xì)胞外泌體表面PD-1及PD-L1蛋白表達(dá)變化Table 2 Protein expression changes of PD-1 and PD-L1 on the surface of exosomes in HEL cells treated with different concentration levels of Rapa for 24 h

    3 討論

    有研究發(fā)現(xiàn),依據(jù)細(xì)胞外囊泡的大小,可分為胞外體(又稱核外粒體)(ectosomes),其大小為50 nm~1 mm,另一類則是大小為40~160 nm的外泌體[10-11]。研究表明外泌體中含有的mRNA、miRNA和蛋白質(zhì)等物質(zhì)在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[12-13]及疾病進(jìn)展中都發(fā)揮著重要作用。外泌體不僅能夠保護(hù)胞外RNA穩(wěn)定存在,還作為有效的載體將RNA轉(zhuǎn)運(yùn)到特定的靶細(xì)胞中,發(fā)揮重要的調(diào)控作用。作為靶向治療載體,外泌體體積小且對(duì)受體細(xì)胞存在選擇性,故可將工程改造后的外泌體作為抗腫瘤藥物等的運(yùn)送介質(zhì)從而達(dá)到高效、特異地殺傷惡性細(xì)胞的目的[14]。本研究發(fā)現(xiàn)在JAK2 V617F天然突變的HEL細(xì)胞中,其外泌體中存在JAK2突變,這進(jìn)一步提示MPN中外泌體可能作為有效載體,將特定的致病基因信號(hào)轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞中,引起相關(guān)細(xì)胞的特定轉(zhuǎn)化,從而導(dǎo)致疾病進(jìn)展,提示MPN中可能的致病通路以及監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展的可能手段。

    圖7 不同濃度Rapa作用24 h后對(duì)HEL細(xì)胞外泌體PD-1(CD279)、PD-L1(CD274)熒光強(qiáng)度影響Figure 7 Effects of different concentrations of Rapa on PD-1 and PD-L1 fluorescence intensity of HEL cells after 24 h

    Rapa是31元環(huán)組成的三烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),Rapa兼具免疫抑制作用與腫瘤抑制作用。在各種實(shí)體腫瘤及血液系統(tǒng)腫瘤中發(fā)現(xiàn)作為哺乳類雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)部分之一的mTORC1存在組成性地過(guò)度活化[15]。Rapa可抑制該通路表達(dá),進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn),Rapa能夠抑制HEL細(xì)胞增殖,其原因可能與Rapa可增強(qiáng)細(xì)胞自噬有關(guān)。mTOR是PI3K/AKT通路的組成成分之一,有多種腫瘤通過(guò)激活該通路促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖等病理變化。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)JAK2可以模擬生長(zhǎng)因子信號(hào),激活PI3K/AKT/mTOR途徑,抑制細(xì)胞自噬[16]。另有研究顯示JAK/STAT和mTOR兩通路之間存在功能串?dāng)_,提示JAK2 V617F突變對(duì)mTOR通路存在激活作用,抑制mTOR通路可能對(duì)JAK/STAT通路起作用[17]。Hao等發(fā)現(xiàn)JAK2、AKT二者的通路抑制劑可以通過(guò)減弱JAK-STAT和AKT信號(hào)通路,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯和抑制HEL細(xì)胞集落形成,具有顯著的協(xié)同效應(yīng)[18]。故JAK/STAT和mTOR兩通路之間存在功能串?dāng)_。本研究表明Rapa能夠劑量依賴性降低外泌體中JAK2的水平,提示Rapa可能通過(guò)抑制mTOR通路干擾細(xì)胞中JAK2,從而使外泌體中JAK2 mRNA水平下調(diào),這與上述研究結(jié)果一致。有研究顯示在治療淋巴瘤患者時(shí),化療藥物在滲透入細(xì)胞和細(xì)胞核后,腫瘤細(xì)胞迅速將藥物(尤其是蒽環(huán)類藥物)隔離到亞細(xì)胞區(qū)室中,并從那里通過(guò)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn),導(dǎo)致細(xì)胞毒類藥物通過(guò)外泌體排出[19]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A3(ATP-binding cassette transporter A3,AΒCA3)與腫瘤外泌體生成及細(xì)胞耐藥起著至關(guān)重要的作用,而敲除或藥物抑制AΒCA3的表達(dá),可導(dǎo)致外泌體生成大量減少,從而改善腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感度[19-20]。AΒCA3蛋白是一種位于細(xì)胞膜上的一類膜整合蛋白,與脂質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)高度相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用Rapa后,外泌體AΒCA3 mRNA表達(dá)水平下降,同時(shí)根據(jù)各組雙表達(dá)特征蛋白的磁珠比例及流式細(xì)胞術(shù)CD63和CD81熒光度的比較,可以得出Rapa可能通過(guò)調(diào)節(jié)自噬通路,抑制AΒCA3表達(dá),進(jìn)而使外泌體數(shù)量減少,生成受抑。

    有研究表明,在某些血液和實(shí)體腫瘤中,腫瘤細(xì)胞都有過(guò)表達(dá)PD-1/PD-L1的現(xiàn)象[21],導(dǎo)致Treg細(xì)胞活性增強(qiáng)及抗腫瘤T細(xì)胞失能并與不良預(yù)后相關(guān)。有研究已證實(shí)在MPN患者腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)PD-1和PD-L1[22-23]。通常PD-1通過(guò)其配體PD-L1發(fā)揮免疫調(diào)控作用。PD-1/PD-L1信號(hào)通路的激活可導(dǎo)致免疫抑制性腫瘤微環(huán)境形成,使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視和殺傷。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)[20],在使用CD20單抗即利妥昔單抗治療淋巴瘤患者時(shí),腫瘤細(xì)胞會(huì)釋放大量表達(dá)CD20的外泌體,從而消耗利妥昔單抗,導(dǎo)致耐藥。本研究顯示HEL細(xì)胞外泌體表面PD-1和PD-L1高表達(dá),Rapa能夠引起PD-L1表達(dá)下降,而對(duì)PD-1無(wú)明顯影響。表明HEL細(xì)胞可通過(guò)釋放外泌體進(jìn)一步營(yíng)造腫瘤微環(huán)境,提高腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)控的能力,并可降低對(duì)應(yīng)靶向藥物的療效。Rapa對(duì)PD-1/PD-L1的干擾機(jī)制尚不清楚,有研究顯示結(jié)腸癌PI3K/AKT/mTOR通路會(huì)被激活導(dǎo)致腫瘤表面PD-L1高表達(dá),在應(yīng)用Rapa后腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)[3],本研究結(jié)果與上述結(jié)論一致,但PD-L1 mRNA與PD-L1蛋白表達(dá)相比下降趨勢(shì)更明顯,這一現(xiàn)象尚未找到原因,且引起PD-L1下降的具體機(jī)制,還有待進(jìn)一步研究。

    綜上,本研究初步探討了雷帕霉素對(duì)HEL細(xì)胞外泌體中JAK2、AΒCA3 mRNA及PD-1/PD-L1的影響,結(jié)果表明HEL細(xì)胞可能通過(guò)外泌體傳遞部分突變基因信號(hào),Rapa能夠減少外泌體分泌,降低HEL細(xì)胞外泌體中JAK2 mRNA水平,抑制外泌體PD-L1的表達(dá)。

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