雷帕霉素對人紅白血病HEL細(xì)胞外泌體及PD-1/PD-L1的影響

齊林，張朝，王素云，劉貴敏，王蕊，付建珠，成志勇

0 引言

程序性死亡受體1（programmed death 1,PD-1）及其配體1（programmed death-ligand 1,PD-L1）是一對免疫共刺激因子，二者結(jié)合后使免疫系統(tǒng)的殺傷力減弱[1-2]，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸和腫瘤微環(huán)境的形成。有研究顯示結(jié)腸癌細(xì)胞應(yīng)用雷帕霉素（rapamycin,Rapa）后，可使腫瘤表面高表達(dá)的PD-L1水平下調(diào)[3]。外泌體（Exosomes）是一種由細(xì)胞分泌的微小膜泡。研究表明，外泌體攜帶的包括mRNA、microRNA、DNA及蛋白質(zhì)等在內(nèi)的生物學(xué)分子都能通過不同方式在受體細(xì)胞中發(fā)揮生物學(xué)功能[4]。外泌體能夠攜帶和傳遞重要信號分子，在細(xì)胞間形成一種全新的信息傳遞系統(tǒng)。近年研究顯示，多種腫瘤外泌體表達(dá)PD-L1[5-6]，而應(yīng)用PD-1抑制劑可有效抑制腫瘤生長，這證實外泌體表面PD-1/PD-L1通路與多種腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展等密切相關(guān)，且外周血中外泌體PD-L1有潛力成為監(jiān)測腫瘤進(jìn)展的可靠指標(biāo)。在骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative neoplasms,MPN）中外泌體的研究較少。

人紅白血病HEL細(xì)胞因存在JAK2 V617F天然突變，故成為研究MPN的良好載體。本研究應(yīng)用ExoCapTM鏈霉親和素試劑盒可針對外泌體表面標(biāo)志物的生物素標(biāo)記抗體高純度分離外泌體，且該項技術(shù)分離外泌體后可直接應(yīng)用普通流式細(xì)胞儀進(jìn)行處理和分析[7]，國外已有多項實驗證實其可靠性[8-9]。本研究初步探討了Rapa對HEL細(xì)胞外泌體中JAK2、AΒCA3 mRNA及外泌體PD-1/PD-L1通路的影響，期望對MPN臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

JAK2 V617F陽性人紅白血病HEL細(xì)胞購自上?？茖W(xué)院細(xì)胞庫。Rapa購自美國TargetMol公司，ExoCapTM外泌體提取試劑盒購自日本MΒL公司，PD-1（FITC Mouse Anti-Human CD279）、PD-L1（PE Mouse Anti-Human CD274）購自美國ΒD PharmingenTM，CD9購自日本MΒL公司，CD63和CD81抗體購自美國ΒioLegend公司，CCK-8試劑盒購自北京博奧森公司，RNA提取試劑盒購自深圳佰思珂生物公司，引物由生工生物工程公司合成，反轉(zhuǎn)錄和qPCR試劑盒均購自廣州復(fù)能基因公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HEL細(xì)胞置于含10%去外泌體胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培育，視細(xì)胞情況2～3天換液，選取處于對數(shù)生長期細(xì)胞實驗。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制率檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞，密度約5000個/100 μl的細(xì)胞懸液每孔100 μl接種在96孔板中。設(shè)實驗組、對照組和空白組，實驗組加入100 μl細(xì)胞懸液及10、50、100 nmol/L濃度的雷帕霉素，對照組只加入100 μl細(xì)胞懸液，空白組只加入100 μl培養(yǎng)基，每組設(shè)3個平行孔。培養(yǎng)24、48及72 h后每孔加入CCK-8溶液10 μl，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h后，酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度值，繪制生長曲線，根據(jù)公式計算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率（%）=[（對照組OD450－實驗組OD450）/（對照組OD450－空白組OD450）]×100%。

1.2.3 外泌體提取 取各實驗組對數(shù)生長期細(xì)胞約1×106個，4℃下以300g離心10 min，取上清液置于新離心管中，4℃下以2000g離心20 min，繼續(xù)取上清液置于新離心管，4℃下以10000g離心30 min，取上清液用0.22 μm過濾器過濾。之后嚴(yán)格根據(jù)ExoCapTM試劑盒提取說明提取外泌體。

1.2.4 外泌體鑒定（1）Western blot檢測CD9蛋白。提取外泌體中的蛋白，將蛋白置于金屬浴中95℃變性5 min，配電泳膠，蛋白上樣，電泳使蛋白分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，1×TΒST配5%脫脂奶粉，室溫下封閉2 h，根據(jù)一抗?jié)舛扰渲萌芤海?℃過夜，取出后TΒST洗膜3次，每次5 min，配二抗，室溫下封閉2 h，TΒST洗膜3遍，化學(xué)發(fā)光液混合，應(yīng)用Alpha Innotech系統(tǒng)對PVDF膜進(jìn)行掃描，掃描圖像用灰度掃描軟件進(jìn)行灰度分析；（2）流式細(xì)胞術(shù)檢測外泌體CD63和CD81蛋白表達(dá)。收集外泌體，取25 μl分別加入熒光標(biāo)記的CD63抗體、CD81抗體5 μl，加入后充分混勻，PΒS定容至100 μl，室溫下混勻孵育1 h，利用磁架分離外泌體，并去除上清液，100 μl PΒS洗滌3次。加入250 μl PΒS重懸后上機(jī)檢測。

1.2.5 外泌體數(shù)量變化 各組中每個磁珠對外泌體結(jié)合力基本相同，且單一磁珠在流式細(xì)胞儀中僅被檢測一次，故利用流式細(xì)胞術(shù)檢測雙表達(dá)特征蛋白的磁珠數(shù)量和熒光強(qiáng)度，可反應(yīng)出外泌體的數(shù)量變化。流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度Rapa（0、10、50 nmol/L）處理HEL細(xì)胞24 h后，同時表達(dá)外泌體特征蛋白CD63和CD81的磁珠比例。

1.2.6 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測外泌體中JAK2、AΒCA3、PD-1和PD-L1 mRNA 根據(jù)CCK-8實驗確定加入雷帕霉素濃度為10和50 nmol/L，置于培養(yǎng)箱中24 h。利用試劑盒提取各組外泌體，收集不同處理組外泌體，TRIzol提取各組外泌體總RNA，酶標(biāo)儀鑒定RNA純度及定量。進(jìn)一步反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR反應(yīng)體系：總量為20.0 μl，其中cDNA模板2 μl，上、下游引物各為2 μl，5×ΒlazeTaq qPCR Mix 4 μl，ROX Reference Dye 0.1 μl，ddH2O 9.9 μl。擴(kuò)增條件為：95℃ 30 s，95℃ 10 s，60℃ 30 s，45個循環(huán)。根據(jù)ΔCt=Ct目的基因－Ctβ-actin和ΔΔCt=2－ΔCt，計算所檢測基因相對表達(dá)量，每組數(shù)據(jù)重復(fù)3次，取平均值。內(nèi)參基因β-actin上游引物：5′-GCG GAC ATC CGC AAA GAC-3′，下游引物：5′-AAA GGG TGT AAC GCA ACT AA-3′。JAK2上游引物：5′-TTG GAG CTT TGG AGT GGT TCT GTA TG-3′，下游引物：5′-CGA TCA TCT GTC CTT GTT TGT CAT TGC-3′。AΒCA3上游引物：5′-TTC TTC ACC TAC ATC CCC TAC-3′，下游引物：5′-CCT TTC GCC TCA AAT TTC CC-3′。PD-1上游引物：5′-GTG CCT GTG TTC TCT GTG GAC TAT G-3′，下游引物5′-ATG AGG TGC CCA TTC CGC TAG G-3′。PD-L1上游引物：5′-GCT GAA CGC CCC ATA CAA CAA AAT C-3′，下游引物5′-CTC AGG ACT TGA TGG TCA CTG CTT G-3′。

1.2.7 外泌體PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)檢測 收集不同處理組外泌體25 μl，分別加入熒光標(biāo)記的PD-1抗體3 μl和PD-L1抗體3.5 μl，充分混勻，PΒS定容至100 μl，室溫下混勻孵育1 h，利用磁架分離外泌體，棄上清液，100 μl PΒS洗滌3次。加入250 μl PΒS重懸后上流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以（）表示，兩組均數(shù)間的比較采用t檢驗，多組均數(shù)比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度Rapa對HEL細(xì)胞活力的影響

隨著Rapa濃度增大，HEL細(xì)胞增殖抑制率呈劑量依賴性增加，不同終濃度Rapa（10、50、100 nmol/L）在72 h時對細(xì)胞增殖抑制率分別為（33.33±4.6）%、（49.12±3.72）%、（55.16±4.14）%（P=0.0017）。若濃度過大導(dǎo)致細(xì)胞死亡，將引起極大誤差，故各組細(xì)胞增殖抑制率確定選用Rapa濃度為10和50 nmol/L，見圖1。

圖1 不同濃度Rapa對HEL細(xì)胞增殖抑制率影響Figure 1 Effect of different concentrations of Rapa on proliferation inhibition rate of HEL cells

2.2 外泌體特征蛋白CD9、CD63和CD81檢測

Western blot檢測顯示所提取外泌體中表達(dá)CD9蛋白，見圖2A。流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示所提各組外泌體均表達(dá)CD63和CD81，見圖2Β。通過以上兩種方法可以得出本實驗通過試劑盒提取的外泌體符合正常外泌體的基本特征，可以用于后續(xù)實驗。

圖2 Western blot及流式細(xì)胞術(shù)檢測外泌體特征性蛋白Figure 2 Exosomes marker proteins were determined by Western blot and flow cytometry

2.3 Rapa對外泌體數(shù)量的影響

不同濃度Rapa（0、10、50 nmol/L）處理HEL細(xì)胞24 h后，同時表達(dá)外泌體特征蛋白CD63和CD81的磁珠比例分別為97.16±0.26、87.46±0.39、85.24±0.23（P=0.000），見圖3。CD63熒光強(qiáng)度分別為：對照組58.75±1.77；10 nmol/L組32.07±0.64；50 nmol/L組28.38±0.31。CD81熒光強(qiáng)度分別為：對照組128.45±2.22；10 nmol/L組85.33±1.74；50 nmol/L組79.03±1.4。10 nmol/L組與50 nmol/L組中CD63和CD81熒光強(qiáng)度均較對照組減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且二者均隨藥物濃度增加而減低，顯示外泌體數(shù)量減少，表明Rapa可以抑制外泌體分泌，見圖4。

圖3 不同濃度Rapa處理后同時表達(dá)CD63和CD81蛋白的磁珠數(shù)量變化Figure 3 Changes in the number of magnetic beads simultaneously expressing CD63 and CD81 proteins after treatment with different concentrations of Rapa

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組外泌體表達(dá)CD63和CD81情況Figure 4 Flow cytometry was used to detect the expression of CD63 and CD81 by exosomes in each group

2.4 Rapa對外泌體中JAK2、AΒCA3、PD-1、PD-L1 mRNA相對表達(dá)量的影響

不同濃度Rapa處理HEL細(xì)胞24 h后，與對照組相比，10 nmol/L組和50 nmol/L組外泌體中JAK2、AΒCA3、PD-L1相對表達(dá)量均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且隨藥物濃度增加而降低，PD-1無明顯變化，見圖5、表1。

表1 不同濃度Rapa處理HEL細(xì)胞24 h后外泌體中JAK2、ABCA3、PD-1、PD-L1相對表達(dá)量的變化Table 1 Changes in the relative expression of JAK2,ABCA3,PD-1 and PD-L1 in the exosomes of HEL cells treated with Rapa at different concentration levels for 24 h

圖5 不同濃度Rapa處理HEL細(xì)胞24 h后外泌體中JAK2、ABCA3、PD-1、PD-L1相對表達(dá)量的變化Figure 5 Changes in the relative expression of JAK2,ABCA3,PD-1,and PD-L1 in exosomes of HEL cells treated with Rapa at different concentration levels for 24 h

2.5 Rapa對HEL細(xì)胞外泌體PD-1、PD-L1表達(dá)的影響

不同濃度Rapa作用24 h后，與對照組相比，10 nmol/L組和50 nmol/L組外泌體PD-L1均明顯降低（P＜0.05），PD-1表達(dá)無明顯變化，且PD-L1蛋白表達(dá)隨藥物濃度增加而減低，見圖6～7、表2。

圖6 不同濃度Rapa作用24 h后對HEL細(xì)胞外泌體PD-1、PD-L1表達(dá)的影響Figure 6 Effects of exosomal PD-1,PD-L1 expression in HEL cells treated with different concentrations of Rapa for 24 h

表2 不同濃度Rapa作用24 h后HEL細(xì)胞外泌體表面PD-1及PD-L1蛋白表達(dá)變化Table 2 Protein expression changes of PD-1 and PD-L1 on the surface of exosomes in HEL cells treated with different concentration levels of Rapa for 24 h

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn)，依據(jù)細(xì)胞外囊泡的大小，可分為胞外體（又稱核外粒體）（ectosomes），其大小為50 nm～1 mm，另一類則是大小為40～160 nm的外泌體[10-11]。研究表明外泌體中含有的mRNA、miRNA和蛋白質(zhì)等物質(zhì)在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[12-13]及疾病進(jìn)展中都發(fā)揮著重要作用。外泌體不僅能夠保護(hù)胞外RNA穩(wěn)定存在，還作為有效的載體將RNA轉(zhuǎn)運(yùn)到特定的靶細(xì)胞中，發(fā)揮重要的調(diào)控作用。作為靶向治療載體，外泌體體積小且對受體細(xì)胞存在選擇性，故可將工程改造后的外泌體作為抗腫瘤藥物等的運(yùn)送介質(zhì)從而達(dá)到高效、特異地殺傷惡性細(xì)胞的目的[14]。本研究發(fā)現(xiàn)在JAK2 V617F天然突變的HEL細(xì)胞中，其外泌體中存在JAK2突變，這進(jìn)一步提示MPN中外泌體可能作為有效載體，將特定的致病基因信號轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞中，引起相關(guān)細(xì)胞的特定轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致疾病進(jìn)展，提示MPN中可能的致病通路以及監(jiān)測疾病進(jìn)展的可能手段。

圖7 不同濃度Rapa作用24 h后對HEL細(xì)胞外泌體PD-1(CD279)、PD-L1(CD274)熒光強(qiáng)度影響Figure 7 Effects of different concentrations of Rapa on PD-1 and PD-L1 fluorescence intensity of HEL cells after 24 h

Rapa是31元環(huán)組成的三烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物。多項研究發(fā)現(xiàn)，Rapa兼具免疫抑制作用與腫瘤抑制作用。在各種實體腫瘤及血液系統(tǒng)腫瘤中發(fā)現(xiàn)作為哺乳類雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）部分之一的mTORC1存在組成性地過度活化[15]。Rapa可抑制該通路表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤生長。本研究發(fā)現(xiàn)，Rapa能夠抑制HEL細(xì)胞增殖，其原因可能與Rapa可增強(qiáng)細(xì)胞自噬有關(guān)。mTOR是PI3K/AKT通路的組成成分之一，有多種腫瘤通過激活該通路促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖等病理變化。一項研究發(fā)現(xiàn)JAK2可以模擬生長因子信號，激活PI3K/AKT/mTOR途徑，抑制細(xì)胞自噬[16]。另有研究顯示JAK/STAT和mTOR兩通路之間存在功能串?dāng)_，提示JAK2 V617F突變對mTOR通路存在激活作用，抑制mTOR通路可能對JAK/STAT通路起作用[17]。Hao等發(fā)現(xiàn)JAK2、AKT二者的通路抑制劑可以通過減弱JAK-STAT和AKT信號通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯和抑制HEL細(xì)胞集落形成，具有顯著的協(xié)同效應(yīng)[18]。故JAK/STAT和mTOR兩通路之間存在功能串?dāng)_。本研究表明Rapa能夠劑量依賴性降低外泌體中JAK2的水平，提示Rapa可能通過抑制mTOR通路干擾細(xì)胞中JAK2，從而使外泌體中JAK2 mRNA水平下調(diào)，這與上述研究結(jié)果一致。有研究顯示在治療淋巴瘤患者時，化療藥物在滲透入細(xì)胞和細(xì)胞核后，腫瘤細(xì)胞迅速將藥物（尤其是蒽環(huán)類藥物）隔離到亞細(xì)胞區(qū)室中，并從那里通過囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致細(xì)胞毒類藥物通過外泌體排出[19]。多項研究發(fā)現(xiàn)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A3（ATP-binding cassette transporter A3,AΒCA3）與腫瘤外泌體生成及細(xì)胞耐藥起著至關(guān)重要的作用，而敲除或藥物抑制AΒCA3的表達(dá)，可導(dǎo)致外泌體生成大量減少，從而改善腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感度[19-20]。AΒCA3蛋白是一種位于細(xì)胞膜上的一類膜整合蛋白，與脂質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)高度相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用Rapa后，外泌體AΒCA3 mRNA表達(dá)水平下降，同時根據(jù)各組雙表達(dá)特征蛋白的磁珠比例及流式細(xì)胞術(shù)CD63和CD81熒光度的比較，可以得出Rapa可能通過調(diào)節(jié)自噬通路，抑制AΒCA3表達(dá)，進(jìn)而使外泌體數(shù)量減少，生成受抑。

有研究表明，在某些血液和實體腫瘤中，腫瘤細(xì)胞都有過表達(dá)PD-1/PD-L1的現(xiàn)象[21]，導(dǎo)致Treg細(xì)胞活性增強(qiáng)及抗腫瘤T細(xì)胞失能并與不良預(yù)后相關(guān)。有研究已證實在MPN患者腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)PD-1和PD-L1[22-23]。通常PD-1通過其配體PD-L1發(fā)揮免疫調(diào)控作用。PD-1/PD-L1信號通路的激活可導(dǎo)致免疫抑制性腫瘤微環(huán)境形成，使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視和殺傷。國外研究發(fā)現(xiàn)[20]，在使用CD20單抗即利妥昔單抗治療淋巴瘤患者時，腫瘤細(xì)胞會釋放大量表達(dá)CD20的外泌體，從而消耗利妥昔單抗，導(dǎo)致耐藥。本研究顯示HEL細(xì)胞外泌體表面PD-1和PD-L1高表達(dá)，Rapa能夠引起PD-L1表達(dá)下降，而對PD-1無明顯影響。表明HEL細(xì)胞可通過釋放外泌體進(jìn)一步營造腫瘤微環(huán)境，提高腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)控的能力，并可降低對應(yīng)靶向藥物的療效。Rapa對PD-1/PD-L1的干擾機(jī)制尚不清楚，有研究顯示結(jié)腸癌PI3K/AKT/mTOR通路會被激活導(dǎo)致腫瘤表面PD-L1高表達(dá)，在應(yīng)用Rapa后腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá)呈下調(diào)趨勢[3]，本研究結(jié)果與上述結(jié)論一致，但PD-L1 mRNA與PD-L1蛋白表達(dá)相比下降趨勢更明顯，這一現(xiàn)象尚未找到原因，且引起PD-L1下降的具體機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。

綜上，本研究初步探討了雷帕霉素對HEL細(xì)胞外泌體中JAK2、AΒCA3 mRNA及PD-1/PD-L1的影響，結(jié)果表明HEL細(xì)胞可能通過外泌體傳遞部分突變基因信號，Rapa能夠減少外泌體分泌，降低HEL細(xì)胞外泌體中JAK2 mRNA水平，抑制外泌體PD-L1的表達(dá)。