外周血外泌體與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎輔助性T細(xì)胞-17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞應(yīng)答失衡的相關(guān)性研究

陳秋華，黃小梅，梁 量，路 杰，謝 彤

（廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，廣東湛江 524000）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是臨床常見(jiàn)的慢性、對(duì)稱性、進(jìn)行性多關(guān)節(jié)破壞的自身免疫性疾病。流行病學(xué)研究顯示，RA在我國(guó)的發(fā)病率在0.3%左右，5年內(nèi)致殘率在30%以上[1]。RA早期臨床表現(xiàn)以關(guān)節(jié)腫脹、疼痛及晨僵為主，若未及時(shí)治療，晚期將會(huì)出現(xiàn)骨侵蝕或關(guān)節(jié)軟骨破壞等病理特征[2]。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全明確，可能與自身免疫紊亂有關(guān)，其中輔助性T細(xì)胞17（Th17）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）應(yīng)答失衡是較為明確的發(fā)病機(jī)制[3]。Th17/Treg在正常狀態(tài)下處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，一旦Th17活化或Treg數(shù)量減少，均會(huì)引發(fā)RA，而相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞應(yīng)答失衡，且外泌體攜帶的miRNAs還能反映疾病的病理狀態(tài)?；诖?，本研究就外泌體在RA與Th17/Treg細(xì)胞應(yīng)答失衡的相關(guān)性進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2020年1月至2022年1月廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治的90例RA患者的臨床資料，根據(jù)疾病活動(dòng)度（DAS28）積分[4]將其分為輕度組（2.6分＜DAS28積分≤3.2分）、中度組（3.2分＜DAS28積分≤5.1分）和重度組（DAS28積分＞5.1分），每組30例；另回顧性分析同期廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)30例健康體檢者的臨床資料，將其作為對(duì)照組。輕度組患者中男性18例，女性12例；年齡35～75歲，平均年齡（49.52±5.31）歲；體質(zhì)量指數(shù)（BMI）23.57～25.15 kg/cm2，平均BMI（24.35±2.54）kg/cm2。中度組患者中男性19例，女性11例；年齡37～78歲，平均年齡（51.02±5.37）歲；BMI 23.41～25.02 kg/cm2，平均BMI（24.41±2.47）kg/cm2。重度組患者中男性17例，女性13例；年齡38～71歲，平均年齡（50.89±5.41）歲；BMI 23.37～25.67 kg/cm2，平均BMI（24.61±2.31）kg/cm2。對(duì)照組研究對(duì)象中男性12例，女性18例；年齡30～80歲，平均年齡（50.43±5.21）歲；BMI 23.54～25.34 kg/cm2，平均BMI（24.27±2.35）kg/cm2。4組研究對(duì)象一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），組間具有可比性。本研究經(jīng)廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《2018中國(guó)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診療指南》[5]中RA的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②關(guān)節(jié)功能分級(jí)為Ⅰ～Ⅳ級(jí)；③入組前未接受相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①精神或認(rèn)知障礙者；②合并骨折的患者；③合并循環(huán)系統(tǒng)疾病者。

1.2 檢測(cè)方法 于患者入院后第2天清晨或研究對(duì)象體檢當(dāng)天清晨，采集其空腹肘靜脈血6 mL，分為3等份；其中2 mL利用外泌體試劑盒（德國(guó)QIAGEN公司）提取，采集血清外泌體；另外2等份分別用于檢測(cè)Th17細(xì)胞、Treg亞群水平。外泌體檢測(cè)：利用外泌體RNA提取試劑盒（美國(guó)Life公司生產(chǎn)）提取血清外泌體總RNA，試劑盒富集miRNAs，將細(xì)胞內(nèi)有核小RNA（U6）作為內(nèi)參，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)對(duì)外泌體miR-223、miR-155表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。Th17細(xì)胞檢測(cè)：取靜脈血2 mL，以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min、棄血清，將10 μL CD4-FITC單抗加入沉淀細(xì)胞中，常溫、避光條件下孵育15 min，采用5 mL PBS緩沖液洗滌，并加入100 μL固定液，再次孵育15 min，二次加入PBS洗滌；離心、棄血清，將100 μL破膜劑加入沉淀細(xì)胞中，混合，避光孵育5 min，加入10 μL Alexa Fluor647IL-17 抗體，混合，避光孵育15 min，3次加入PBS洗滌；離心、棄血清，采用ZE5流式細(xì)胞儀測(cè)定Th17細(xì)胞含量。Treg亞群檢測(cè)：在2 mL靜脈血中加入50 μL乙二胺四乙酸抗凝處理，隨后分別加入10 μL單克隆抗體（CD25-PE、CD4-FITC、CD127-PE-CY5）混勻，室溫下孵育20 min，隨后加入500 μL紅細(xì)胞裂解液，、混勻后再加入5 mL 磷酸緩沖鹽溶液（PBS）；離心棄血清，并于沉淀細(xì)胞中加入300 μL PBS緩沖液重懸細(xì)胞，同時(shí)采用流式細(xì)胞儀（上海艾研生物科技有限公司，型號(hào)：ZE5）測(cè)定Treg亞群含量。計(jì)算Th17/Treg。

1.3 觀察指標(biāo) ①比較各組研究對(duì)象Th17、Th17/Treg和Treg亞群水平。②比較各組研究對(duì)象miR-223、miR-155表達(dá)水平。③分析外泌體與Th17/Treg水平對(duì)RA的診斷效能。敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/（真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%；特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù)）×100%。④分析外泌體miR-223、miR-155水平與RA Th17/Treg水平相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（x）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以[例(%)]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；診斷效能采用受試者操作特征（ROC）曲線分析；相關(guān)性采用Pearson檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組研究對(duì)象Th17、Treg亞群和Th17/Treg水平比較 重度組、中度組及輕度組患者Th17、Th17/Treg水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），重度組、中度組及輕度組患者Treg亞群水平均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 4組研究對(duì)象Th17、Treg亞群和Th17/Treg水平比較（%，x）

2.2 4組研究對(duì)象外泌體miR-223、miR-155表達(dá)水平比較 重度組、中度組及輕度組患者miR-223、miR-155表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 4組研究對(duì)象外泌體miR-223、miR-155表達(dá)水平比較（x）

2.3 外泌體與Th17/Treg水平對(duì)RA的診斷效能分析 Th17細(xì)胞、Treg亞群、Th17/Treg、miR-223、miR-155對(duì)RA的 敏 感 度 分 別 為87.04%、88.89%、94.59%、87.04%、88.89%，特異度分別為75.00%、75.00%、81.25%、68.75%、81.25%，見(jiàn)表3、圖1。

圖1 外泌體與Th17 /Treg水平對(duì)RA的診斷效能分析

表3 外泌體與Th17/Treg水平對(duì)RA的診斷效能分析

2.4 外泌體miR-223、miR-155水平與RA Th17/Treg水平相關(guān)性分析 外泌體miR-223、miR-155水平與Th17細(xì)胞、Th17/Treg均呈正相關(guān)性，與Treg亞群呈負(fù)相關(guān)性（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 外泌體miR-223、miR-155水平與RA Th17/Treg水平相關(guān)性分析

3 討論

RA目前僅能通過(guò)服用非甾類抗炎藥或糖皮質(zhì)激素等藥物穩(wěn)定病情、改善臨床癥狀，因此只有明確患者的疾病嚴(yán)重程度，才能給予其合適的藥物治療。相關(guān)研究表明，炎癥反應(yīng)、免疫細(xì)胞活性失衡等均在RA的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[6]，因此，通過(guò)檢測(cè)RA相關(guān)生物指標(biāo)的方式，在RA早期診斷和治療中可發(fā)揮重要作用。

Treg細(xì)胞屬于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，而Th細(xì)胞則屬于輔助性T細(xì)胞，Treg細(xì)胞不僅能夠激活Th17細(xì)胞，而且還能對(duì)Th細(xì)胞的部分功能進(jìn)行限制，使Th細(xì)胞在機(jī)體中保持平衡，從而保證機(jī)體內(nèi)免疫功能的正常運(yùn)轉(zhuǎn)[7]。Th17細(xì)胞可對(duì)局部炎癥反應(yīng)進(jìn)行誘導(dǎo)，同時(shí)還能上調(diào)滑膜成纖維細(xì)胞上的破骨細(xì)胞分化因子(RANKL)，從而對(duì)關(guān)節(jié)炎骨組織造成破壞。RA的發(fā)生與免疫系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)功能失衡有關(guān)，因此，RA發(fā)病時(shí)，體內(nèi)的Th17數(shù)量和功能也會(huì)隨之出現(xiàn)異常。

本研究結(jié)果顯示，重度組、中度組及輕度組患者Th17、Th17/Treg水平均高于對(duì)照組，Treg亞群水平均低于對(duì)照組，與李智偉等[8]研究結(jié)果相似，說(shuō)明研究結(jié)果可信度較高。這提示Th17/Treg細(xì)胞應(yīng)答失衡會(huì)引發(fā)RA，且Th17/Treg細(xì)胞應(yīng)答失衡越嚴(yán)重，RA病情也會(huì)隨之加重。外泌體主要由多種細(xì)胞產(chǎn)生，含有脂類、蛋白質(zhì)及核酸等物質(zhì)，外泌體中的miRNA與自身免疫性疾病、呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展均存在一定關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示，重度組、中度組及輕度組患者miR-223、miR-155表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，與孫廣等[9]研究結(jié)果基本一致。這說(shuō)明根據(jù)外泌體miR-223、miR-155表達(dá)水平上調(diào)情況可有效評(píng)估RA的疾病嚴(yán)重程度。另外，本研究對(duì)Th17/Treg細(xì)胞應(yīng)答失衡與外泌體miR-223、miR-155水平進(jìn)行相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)，外泌體miR-223、miR-155水平與Th17細(xì)胞、Th17/Treg均呈正相關(guān)，與Treg亞群呈負(fù)相關(guān)性。這提示外泌體異常表達(dá)可反映RA Th17/Treg細(xì)胞應(yīng)答失衡狀態(tài)，進(jìn)而有效評(píng)估RA患者的疾病嚴(yán)重程度。

綜上所述，RA的發(fā)生、發(fā)展與外泌體miR-223、miR-155和Th17/Treg均存在一定關(guān)聯(lián)，可根據(jù)外泌體miR-223、miR-155表達(dá)情況明確RA患者體內(nèi)的Th17上升和Treg亞群下降情況，在判斷RA病情嚴(yán)重程度方面具有重要意義。