三黃胰癉膏對重癥急性胰腺炎模型大鼠腸黏膜屏障功能及血清內(nèi)毒素、二胺氧化酶、D-乳酸的影響

向 未，陳 輝，姜朝麗，蔣亞玲，王天剛，王星月，劉菊容

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000）

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是一種病情危重、進(jìn)展極其兇險的常見消化內(nèi)科急癥，病死率高達(dá)30%～50%［1］。腸道是危重疾病應(yīng)激反應(yīng)的中心器官之一，現(xiàn)已證實(shí)SAP早期即可發(fā)生腸屏障功能障礙（IBFD），而IBFD則是SAP誘發(fā)和加重并發(fā)癥，且是死亡率高的原因所在［2-4］。前期臨床研究表明［5］，我科治療胰腺炎的外用協(xié)定處方三黃胰癉散（藥物組成同三黃胰癉膏）治療急性胰腺炎有顯著效果，能縮短急性胰腺炎患者的腹痛消失時間、血清炎性指標(biāo)恢復(fù)正常時間及住院時間。本課題采用?；悄懰嵴T導(dǎo)大鼠SAP模型，觀察三黃胰癉膏對SAP大鼠腸黏膜屏障以及血清內(nèi)毒素、二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸（D-LA）的影響，觀察三黃胰癉膏治療SAP的可能作用機(jī)制，從而為其治療SAP提供實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)動物：清潔級健康SD大鼠60只，全為雄性，體質(zhì)量300±50g，鼠齡9～10周，購于南醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心［實(shí)驗(yàn)動物許可證號SYXK（川）2019-202］，于西南醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心動物房飼養(yǎng)，溫度17℃～23℃，相對濕度50%～70%，室內(nèi)通風(fēng)良好，每日光照9～12h，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。動物實(shí)驗(yàn)方法符合西南醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)程。

實(shí)驗(yàn)藥物：三黃胰癉膏由生大黃、梔子、白芷、白及、烏梅、薄荷、生黃芪、連翹、甘遂、皂角刺組成（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供），外敷腹部（大鼠劍突到恥骨聯(lián)合，兩腋前線之間），厚度約5mm（劑量0.65g/kg）。

主要試劑與儀器：①10%水合氯醛，美國Sigma公司；3.5%?；悄懰崛芤?，美國Sigma 公司；葡聚糖試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；MTL ELISA，美國DAB公司；脂多糖檢測試劑盒，北京普博斯生物有限公司。②全自動珊頓切片機(jī)，Thermo Electron Corporation；50i雙目顯微鏡，尼康；全自動珊頓脫水機(jī)，Thermo Electron Corporation；珊頓組織石蠟包埋機(jī)，Thermo Electron Corporation，全自動珊頓組織切片染色機(jī) Thermo Electron Corporation。

造模與給藥：選取體質(zhì)量相當(dāng)?shù)男坌許D大鼠60只，隨機(jī)分為模型組、治療組和假手術(shù)組各20只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，給予以下處理：模型組、治療組制備SAP模型，造模方法參考改良AhoHJ法［6］。造模成功后，治療組給予三黃胰癉膏外敷腹部，日1次；假手術(shù)組，開腹后僅翻動腸管，不制備SAP模型，只注射生理鹽水。

3組動物均禁食、不禁飲。

標(biāo)本采集與檢測：①血清淀粉酶測定：各時間點(diǎn)處死大鼠前行心臟取血，送西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測；②血清內(nèi)毒素測定：各時間點(diǎn)處死大鼠前行心臟取血，按革蘭氏陰性菌檢測試劑盒說明操作檢測；③血清DAO及D-LA濃度測定：各時間點(diǎn)處死大鼠前行心臟取血，采用ELISA雙抗夾心法檢測。

統(tǒng)計學(xué)處理：使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間用t檢驗(yàn)，作差異顯著性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

三黃胰癉膏對SAP大鼠血清淀粉酶的影響見表1。

表1 三黃胰癉膏對SAP大鼠血清淀粉酶的影響 （±s）

表1 三黃胰癉膏對SAP大鼠血清淀粉酶的影響 （±s）

注：與假手術(shù)組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

組別 6h 12h 24h 48h假手術(shù)組 1678.10±124.14 1682.21±103.45 1102.34±67.46 972.16± 59.45模型組 8656.43±1267.53# 14643.20±1346.47# 19769.50±1493.64# 9543.34±914.32#治療組 8942.24±900.37* 2454.65±287.54* 1357.39±102.42* 998.43± 69.39*

三黃胰癉膏對SAP大鼠血清內(nèi)毒素的影響見表2。

表2 三黃胰癉膏對SAP大鼠血清內(nèi)毒素的影響 （±s）

表2 三黃胰癉膏對SAP大鼠血清內(nèi)毒素的影響 （±s）

注：與假手術(shù)組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

組別 6h 12h 24h 48h假手術(shù)組 0.22±0.09 0.22±0.08 0.22±0.10 0.22±0.07模型組 1.12±0.11#2.67±0.15#3.98±0.28#4.74±0.23#治療組 0.88±0.10*2.02±0.12*2.95±0.13*3.06±0.15*

三黃胰癉膏對SAP大鼠血清DA0濃度的影響見表3。

表3 三黃胰癉膏對SAP大鼠血清DAO濃度的影響 （mg/L，±s）

表3 三黃胰癉膏對SAP大鼠血清DAO濃度的影響 （mg/L，±s）

注：與假手術(shù)組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

組別 6h 12h 24h 48h假手術(shù)組 0.34±0.08 0.33±0.07 0.35±0.08 0.32±0.06模型組 1.11±0.10#1.68±0.18#2.99±0.28#3.76±0.23#治療組 0.98±0.10*1.02±0.16*1.43±0.13*1.06±0.15*

三黃胰癉膏對SAP大鼠血清D-乳酸（D-LA）濃度的影響見表4。

表4 三黃胰癉膏對SAP大鼠血清D-LA濃度的影響 （U/L，±s）

表4 三黃胰癉膏對SAP大鼠血清D-LA濃度的影響 （U/L，±s）

注：與假手術(shù)組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

組別 6h 12h 24h 48h假手術(shù)組 1.12±0.04 1.13±0.03 1.15±0.04 1.10±0.05模型組 1.50±0.12#1.48±0.18#1.49±0.18#1.56±0.13#治療組 1.28±0.10*1.22±0.16*1.23±0.13*1.26±0.15*

三黃胰癉膏對SAP大鼠小腸黏膜的影響。光鏡下觀察顯示：假手術(shù)組的小腸黏膜絨毛結(jié)構(gòu)完整，黏膜絨毛上皮呈高柱狀，無水腫、炎性細(xì)胞浸潤。模型組小腸黏膜受損明顯，且隨著時間延長加重，可見小腸絨毛充血水腫明顯伴出血，大量中性粒細(xì)胞浸潤、杯狀細(xì)胞減少，頂端上皮壞死、脫落，潰瘍形成。第6、12h、24h、48h治療組與模型組比較損害有所減輕。而治療組與同時間點(diǎn)的模型組比較，隨時間延長腸絨毛充血水腫、壞死、炎細(xì)胞浸潤均有改善。表明了三黃胰癉膏可降低SAP大鼠小腸黏膜損傷。

3 討 論

SAP是一種內(nèi)科疾病，根據(jù)本病病因、臨床表現(xiàn)、病理變化特點(diǎn)，目前一些學(xué)者［7-8］提出，SAP可以看作“內(nèi)癰”，中醫(yī)可以按“內(nèi)癰”論治。根據(jù)“內(nèi)癰”理論及SAP的中醫(yī)病機(jī)，中醫(yī)外治治療SAP以通里攻下、清熱解毒、散瘀止痛、拔毒外出為治療大法。

三黃胰癉膏方中以大黃為君藥。大黃苦寒，具有瀉下攻積、清熱解毒、活血化瘀的功效。黃梔子、連翹、甘遂為臣藥。黃梔子苦寒，具有清熱解毒、消腫止痛的功效，擅長清三焦之熱；連翹苦、微辛，寒，具有清熱解毒、消癰散結(jié)的功效，善治熱毒瘡癰、瘰疬，《珍珠囊》稱之為“瘡家圣藥”。二藥合用，增強(qiáng)大黃的清熱解毒之功；甘遂苦寒，有小毒，具有瀉水逐飲，消腫散結(jié)的功效，善行經(jīng)隧之水濕，使體內(nèi)潴留之水飲從二便排出，與大黃合用，增強(qiáng)了大黃的瀉下攻積作用。皂角刺、黃芪為佐藥。皂角刺辛溫，能消腫排膿。黃芪甘，微溫，具有補(bǔ)氣升陽，利水消腫，托毒排膿，斂瘡生肌之功。黃芪被被譽(yù)為“瘡癰圣藥”，反佐黃芪，增強(qiáng)機(jī)體的抗病能力，以“安先未受邪之地”。白芷辛，溫，消腫排膿。烏梅酸澀，外敷消瘡毒。白及苦澀，消腫生肌而截毒束毒。薄荷辛涼，芳香辛散，《新修本草》：“……主心腹脹滿”。諸藥合用，共奏通里攻下、清熱解毒、散瘀止痛、拔毒外出之功。本方清溫并用，旨在疏通血脈，調(diào)和氣血，避免形成“氣脈得寒則不行，瘀血得寒則不散，瘀肉得寒則不潰，新肉得寒則不生”的不良結(jié)局。

D-LA和內(nèi)毒素均由腸道細(xì)菌產(chǎn)生，當(dāng)腸黏膜屏障功能受到破壞損傷時，大量D-LA與內(nèi)毒素才釋放入血，因此D-LA和內(nèi)毒素常作為腸黏膜屏障損傷的早期監(jiān)測指標(biāo)。DAO廣泛存在于哺乳動物小腸黏膜絨毛上皮層，是小腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)高活性的酶，當(dāng)在腸黏膜屏障功能受損時則會導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)DAO慢性升高［9］。文獻(xiàn)研究顯示［10］，血清DAO與D-LA用于評估腸道功能有很好的價值。因此，本課題將DAO、D-LA、內(nèi)毒素作為SAP大鼠腸黏膜屏障的損傷指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，外敷三黃胰癉膏能夠改善重癥急性胰腺炎模型大鼠小腸黏膜損傷，降低血清淀粉酶，降低大鼠血清DAO、D-LA、內(nèi)毒素含量。

綜上所述，外敷三黃胰癉膏治療SAP大鼠模型，能夠改善重癥急性胰腺炎模型大鼠小腸黏膜損傷，降低血清淀粉酶，降低大鼠血清DAO、D-LA、內(nèi)毒素含量，其可能的作用機(jī)制為降低大鼠血清DAO、D-LA、內(nèi)毒素含量。