結(jié)核病相關(guān)生物標志物IFN–γ檢測技術(shù)研究進展

李繼榮 王志堅

中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)海軍第二醫(yī)院感染科，海南三亞 572000

人類感染結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）已有數(shù)千年歷史。結(jié)核病每年造成至少120 萬人死亡。世界衛(wèi)生組織提出到2030 年消除結(jié)核病大流行的目標。盡管付出巨大努力，結(jié)核病仍是世界范圍內(nèi)重大公共衛(wèi)生問題。

長期以來，結(jié)核菌素皮膚試驗在結(jié)核病輔助診斷中發(fā)揮著重要作用，其性價比高，操作簡便，但其結(jié)果易受卡介苗接種和非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）感染的影響；GeneXpert MTB/RIF 可同時檢測MTB 基因和利福平耐藥，2h內(nèi)完成檢測，但價格昂貴，需專門檢測平臺。γ 干擾素（interferon–γ，IFN–γ）檢測可提供活動性結(jié)核、潛伏性肺結(jié)核感染病理過程和宿主免疫反應(yīng)的相關(guān)信息，是結(jié)核病診斷中常規(guī)使用的生物標志物之一，對早期診斷結(jié)核至關(guān)重要。

1 傳統(tǒng)的IFN-γ 檢測技術(shù)

γ 干擾素釋放試驗（interferon–γ release assay，IGRA）是通過檢測單核細胞中MTB 特異性抗原（早期分泌抗原6 和培養(yǎng)濾液蛋白10）刺激下產(chǎn)生的IFN–γ 來判斷被檢測者是否存在MTB 感染。

目前有幾種較常用的方法：①采用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme–linked immunosorbent assay，ELISA）檢測全血中致敏T 細胞再次受到MTB 特異性抗原刺激后釋放的IFN–γ 水平（QuantiFERON–TB Gold In Tube，QFT–GIT）。②QuantiFERON–TB Plus（QFT–Plus）是QFT–GIT 的升級版，與含有優(yōu)化的CD4T 細胞刺激抗原的QFT–GIT 相比，QFT–Plus含有優(yōu)化的CD4和CD8T 細胞刺激的新抗原。與QFT–GIT 相比，在成人結(jié)核潛伏感染患者中QFT–Plus 檢測顯示與MTB 暴露增加有更強的相關(guān)性，具有指示近期感染和疾病活動的潛力。③T–SPOT.TB是一種更簡單的酶聯(lián)免疫斑點試驗方法，其檢測靈敏度高，超過傳統(tǒng)的ELISA，用于檢測被結(jié)核特異抗原刺激活化的效應(yīng)T 細胞。

IGRA 特異性更高，其陽性結(jié)果基本可排除卡介苗接種和NTM 感染，但IGRA 不能提供實時檢測，只能在實驗室進行，且操作專業(yè)要求高。因此，開發(fā)便攜式、實時、高敏感度、成本低廉、便于操作的IFN–γ 檢測技術(shù)至關(guān)重要。

2 傳感器檢測技術(shù)

由于傳統(tǒng)的IFN–γ 檢測技術(shù)對人員、儀器和實驗平臺要求高，因此，迫切需要設(shè)計一種高敏感度、快檢快報提供實時分析的便攜式系統(tǒng)。多年來，科學(xué)家們在生物傳感器領(lǐng)域取得了巨大的進步，并將其廣泛應(yīng)用到疾病診斷相關(guān)領(lǐng)域。生物傳感器由生物受體和傳感器組成。生物受體是一種生物化合物（如抗體、酶、細胞、核酸等），附著于特定的分析物上。換能器是一種將生物反應(yīng)轉(zhuǎn)換為可測量信號的組件。與傳統(tǒng)的檢測技術(shù)相比，生物傳感器具有高靈敏度和高特異性，能檢測各種復(fù)雜樣品，且操作簡便，方便攜帶，可提供實時檢測，是極富潛力的診斷方法。

2.1 熒光適配體傳感器

熒光適配體傳感器是熒光標記和適配體傳感器的巧妙結(jié)合。以適配體作為生物識別元件的生物傳感器稱為適配體傳感器。適配體是人工合成的單鏈DNA 或RNA 分子，當與目標結(jié)合時改變其構(gòu)象。近年來，由于其具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，易于修飾，對目標具有較高的特異性和親和性，重復(fù)性好，它們已成為抗體的替代品。在熒光傳感器中，對生物識別元件或目標分子進行熒光標記，熒光強度即代表目標分子與生物識別分子之間的相互作用強度。Zhang等開發(fā)了一種具有高靈敏度和高特異性的孔雀石綠–四重適配體熒光生物傳感器用于檢測IFN–γ。在實際樣品中，其檢出限為7.65fmol/L，線性范圍為0～20pmol/L，回收率為95.29%～118.08%。Wen等也開發(fā)了一種熒光傳感器，IFN–γ 檢出限為 0.175fmol/L，線性范圍為0.01pmol/L～10nmol/L。

2.2 電化學(xué)適體傳感器

電化學(xué)傳感器的原理是將生物識別元件耦合到電極換能器，然后由換能器將生物識別事件轉(zhuǎn)換成電信號。Xu等設(shè)計了一種以鏈霉素–無機雜化納米花與石墨烯復(fù)合材料作為傳感器的發(fā)夾式電化學(xué)適配體傳感器，檢測限為19fg/ml，線性范圍為0.1pg/ml～500ng/ml。Abnous等開發(fā)了一種由三螺旋分子開關(guān)系統(tǒng)、適配體和亞甲基藍氧化還原探針組成的電化學(xué)適體傳感器，用于快速測定IFN–γ，檢測限為3pg/ml，線性范圍為10～1 500pg/ml，回收率為91.3%～102.8%。Li等開發(fā)了一種靶誘導(dǎo)外切酶抑制適體傳感器，IFN–γ 檢測限為0.7pmol/L，線性范圍為1pmol/L～50nmol/L，回收率為91.83%～101.9%。該傳感器成本低、敏感度高、選擇性好、操作簡單、重復(fù)性好。Ding等制作了一種三面單層電化學(xué)適體傳感器，IFN–γ 檢出限為11.56pmol/L，線性范圍為22.22pmol/L～0.11nmol/L。Jin等制作了一種無標記電化學(xué)適配傳感器，以亞甲基藍作為氧化還原探針，其信號隨著IFN–γ 的增加而穩(wěn)定提升。IFN–γ 檢出限為2fg/ml，線性范圍0.01～1000pg/ml，回收率為95.2%～105%。Cao等開發(fā)了一種可重復(fù)使用的氧化石墨烯適體傳感器裝置，IFN–γ 檢出限為1.3pg/ml，線性范圍為1.3～210pg/ml。

2.3 電化學(xué)免疫傳感器

當生物傳感器中的生物識別元件是抗體時，它被稱為免疫傳感器。免疫傳感器利用抗體與抗原的高度親和力，使用恰當?shù)男盘杺鞲衅鱽泶_定特定的分析物。Sánchez–Tirado等設(shè)計了一種電化學(xué)免疫傳感器，用于檢測唾液中的IFN–γ。該生物傳感器的核心是三明治結(jié)構(gòu)，通過重氮鹽和對氨基苯甲酸將IFN–γ 抗體固定在電極表面。檢測抗體以生物素標記，并與鏈霉素–辣根過氧化物酶耦聯(lián)。檢出限為1.6pg/ml，線性范圍為2.5～2000pg/ml。Ruecha等制作了一種無標記紙基阻抗免疫傳感器，用聚苯胺–石墨烯修飾紙基電極，并將人IFN–γ 抗體固定其上。該方法特異性、敏感度高，操作簡便，成本低。檢出限為3.4pg/ml，線性范圍為5～1000pg/ml，回收率為101%～104%。Zhang等也開發(fā)了一種由聚二烯丙基二甲基氯化銨和金納米顆粒復(fù)合材料組成的三明治式電化學(xué)免疫傳感器，檢測限為0.048pg/ml，線性范圍為0.1～104pg/ml。Parate等設(shè)計了一種可以測定細胞因子、IFN–γ 和白細胞介素–10 的免疫傳感器。該裝置檢測IFN–γ 的線性范圍為0.1～5ng/ml，檢出限為25pg/ml。

3 微流體檢測技術(shù)

近年來，在資源貧乏的國家，微流體裝置已成為一種可能的診斷工具。微流體設(shè)備是基于芯片的傳感技術(shù)，小樣本量即可提供實時的傳染病診斷。應(yīng)用微流體技術(shù)可分析大量的臨床樣本，如尿液、血液或唾液。具有成本低、體積小、可批量生產(chǎn)的優(yōu)勢。Yang等制作了一種高敏感度的微芯片電泳化學(xué)發(fā)光檢測平臺。以辣根過氧化物酶標記DNA為化學(xué)發(fā)光檢測信號探針，結(jié)合核酸外切酶信號擴增策略，實現(xiàn)對人血漿中IFN–γ 的快速檢測。檢測限為1.6fmol/L，線性范圍為8×10～1×10mol/L。Liu等制作了一種微流體裝置，可連續(xù)檢測血清和細胞培養(yǎng)中的IFN–γ。該裝置采用聚二甲基硅氧烷制作而成，利用磁場將磁性納米顆粒附著于微處理器芯片上，構(gòu)建傳感檢測平臺。檢出限為6pg/ml，線性范圍為10～500pg/ml，回收率為98%～102%。Evans等設(shè)計了一個電路板傳感器檢測平臺，其檢出限為40pg/ml，線性范圍為15～2000pg/ml，回收率為93%～97%，該系統(tǒng)整個診斷分析過程僅需8min。

4 展望

近幾十年來，由于貧困、合并感染后的免疫抑制、抗生素濫用及結(jié)核菌耐藥等原因，結(jié)核病大有“死灰復(fù)燃”趨勢。為阻止結(jié)核病的進一步蔓延，及早發(fā)現(xiàn)和診斷結(jié)核成為重中之重。多年來，已有多種方法用于檢測結(jié)核病，如古老的結(jié)核菌素皮膚試驗和近些年開展起來的GeneXpert 技術(shù)，這些檢測方法都有著各自的局限性。IFN–γ 作為當前結(jié)核病早期診斷的主要生物標志物已得到廣泛應(yīng)用，不僅可用于潛伏期結(jié)核感染的篩查，也可與其他方法聯(lián)合應(yīng)用于活動性結(jié)核病的臨床診治。

對于IFN–γ 檢測技術(shù)的研究也一直在不斷創(chuàng)新和改進中。傳統(tǒng)的IGRA 雖然可排除卡介苗接種和NTM 干擾，特異性也較高，但費時費力，不能區(qū)分潛伏肺結(jié)核和活動性肺結(jié)核，敏感度不高（尤其在免疫功能低下群體）。隨著生物傳感檢測平臺的引進，IFN–γ 檢測的敏感度、特異性和便攜度均得到明顯提升。與傳統(tǒng)技術(shù)相比，生物傳感檢測平臺在檢測精度、成本和時限方面都具有顯著優(yōu)勢。盡管生物傳感器有很多優(yōu)點，但要將其廣泛應(yīng)用于臨床實踐還有很長的路要走。在傳感系統(tǒng)中引入微流體技術(shù)及芯片陣列，最大限度地降低了對大型實驗設(shè)備的使用需求。然而，目前微流體技術(shù)在商業(yè)市場的應(yīng)用才剛剛起步，實際應(yīng)用存在諸多挑戰(zhàn)，如大樣本原始數(shù)據(jù)分析和大規(guī)模生產(chǎn)微流體裝置的成本等，都需要進一步的研究來評估其可行性。相信隨著人們對IFN–γ 檢測技術(shù)研究的不斷深入，更敏感、更高效、更便攜、更高性價比的高科技裝置會不斷涌現(xiàn)在人類結(jié)核病的診療實踐中。