聚合R基因Pigm和非R基因bsr-d1改良水稻稻瘟病抗性

王 亞，王越濤，申關(guān)望，王付華，王生軒，白 濤，尹海慶

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所，河南 鄭州 450002；2.信陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所，河南 信陽(yáng) 464000)

稻瘟病是我國(guó)水稻主產(chǎn)區(qū)的第一大毀滅性病害，由子囊菌(Magnaporthegrisea(Hebert)Barr)引起[1]。稻瘟病在發(fā)病嚴(yán)重的年份可導(dǎo)致水稻顆粒無(wú)收，嚴(yán)重制約了我國(guó)水稻生產(chǎn)的發(fā)展[2-3]。相比使用化學(xué)農(nóng)藥，種植抗稻瘟病水稻品種更能經(jīng)濟(jì)有效地控制稻瘟病。由于稻瘟病生理小種繁多且容易變異，抗病品種經(jīng)常喪失抗性而淪為感病品種，從而造成嚴(yán)重?fù)p失，生產(chǎn)上急需廣譜持久抗稻瘟病水稻新品種。稻瘟病抗性分為完全抗性(主效R基因控制)和部分抗性(非R基因控制)2種[4]。其中，完全抗性的主效基因易于操作，在水稻育種和生產(chǎn)中已得到廣泛應(yīng)用。部分抗性的抗性水平雖然較完全抗性低，但抗性相對(duì)穩(wěn)定和持久。完全抗性與部分抗性的結(jié)合利用將是未來(lái)水稻抗稻瘟病育種的方向和趨勢(shì)[5]。源自持久抗性品種谷梅4號(hào)的顯性主效R基因Pigm是一個(gè)包含多個(gè)NBS-LRR類抗病基因的基因簇，其中只有2個(gè)具有功能的蛋白質(zhì)PigmR和PigmS。PigmR可以發(fā)揮廣譜抗病功能，但會(huì)導(dǎo)致水稻千粒質(zhì)量降低，產(chǎn)量下降；PigmS則可以提高水稻的結(jié)實(shí)率，抵消PigmR對(duì)產(chǎn)量的影響，PigmS可以通過(guò)與PigmR競(jìng)爭(zhēng)形成異源二聚體抑制PigmR介導(dǎo)的廣譜抗病性。但由于PigmS低水平的表達(dá)使得病原菌的進(jìn)化選擇壓力變小，減緩了病原菌對(duì)PigmR的致病性進(jìn)化，因此，Pigm介導(dǎo)的稻瘟病抗性更持久并且不影響最終產(chǎn)量[6]。bsr-d1是從廣譜持久抗病材料地谷中克隆的非R類廣譜抗稻瘟病基因。研究表明，由于Bsr-d1基因的啟動(dòng)子區(qū)域一個(gè)關(guān)鍵堿基的變異，導(dǎo)致上游MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)Bsr-d1啟動(dòng)子結(jié)合增強(qiáng)而使得Bsr-d1基因表達(dá)受到抑制，進(jìn)而導(dǎo)致Bsr-d1直接調(diào)控的H2O2降解酶基因表達(dá)下調(diào)，使H2O2降解減弱，細(xì)胞內(nèi)H2O2富集，提高了水稻的免疫反應(yīng)并因此獲得稻瘟病抗性；敲除Bsr-d1在增強(qiáng)水稻稻瘟病抗病性的同時(shí)，對(duì)產(chǎn)量性狀和稻米品質(zhì)沒(méi)有明顯影響，因而具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值[7]。

稻米優(yōu)質(zhì)化是水稻生產(chǎn)“供給側(cè)改革”的重要內(nèi)容，也是水稻產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效的重要抓手。水晶3號(hào)是河南省優(yōu)良食味水稻的標(biāo)志性品種，但由于稻瘟病抗性差，極大限制了該品種的推廣應(yīng)用，生產(chǎn)上急需具有廣譜持久稻瘟病抗性的優(yōu)質(zhì)稻品種。通過(guò)分子育種手段直接改良現(xiàn)有優(yōu)質(zhì)水稻資源的稻瘟病抗性，是培育抗稻瘟病優(yōu)質(zhì)水稻新品種的快速有效手段。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是近幾年迅速發(fā)展起來(lái)的能夠便捷、高效、精準(zhǔn)敲除靶基因的基因編輯技術(shù)，且成本低廉[8-10]。該技術(shù)主要原理是利用 gRNA與基因組上目標(biāo)序列的特異性識(shí)別，引導(dǎo)Cas9核酸酶在靶標(biāo)位置切割DNA使之雙鏈斷裂，進(jìn)而導(dǎo)致基因組DNA在修復(fù)過(guò)程中發(fā)生堿基的缺失、插入或替換等特異性突變[11]。獲得的基因編輯材料通過(guò)后代自交分離能夠剔除外源基因，不會(huì)留下轉(zhuǎn)基因痕跡[12-13]。此外，隨著DNA 測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，測(cè)序成本大大降低，分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)逐漸實(shí)現(xiàn)了高通量、低成本和自動(dòng)化，為育種應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。選擇綜合性狀優(yōu)良的品種，針對(duì)其突出缺點(diǎn)，精準(zhǔn)導(dǎo)入目標(biāo)性狀基因，利用基于基因芯片的分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行單個(gè)分子標(biāo)記的前景選擇和高通量的背景選擇能夠靈活、高效地實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記輔助回交育種的目標(biāo)[14]，從而實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病的統(tǒng)一。

本研究首先利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)優(yōu)良食味水稻品種水晶3號(hào)中的Bsr-d1進(jìn)行定點(diǎn)編輯，在T0獲得純合的Bsr-d1敲除材料，經(jīng)自交分離獲得去除轉(zhuǎn)基因成分的T1純合敲除材料，然后以這些材料為母本與攜帶Pigm基因的金玉1號(hào)(粳稻)雜交并連續(xù)回交3代，采用武漢雙綠源公司的水稻綠色基因芯片(GSR40K)進(jìn)行Pigm基因分子標(biāo)記選擇和高通量的背景選擇，獲得同時(shí)攜帶主效R基因Pigm和非R基因bsr-d1且遺傳背景基本回復(fù)的水晶3號(hào)抗稻瘟病材料，從而為水稻抗稻瘟病育種提供有重要價(jià)值的材料。

1 材料和方法

1.1 水稻材料、載體與菌株

水晶3號(hào)來(lái)自河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，金玉1號(hào)(轉(zhuǎn)育并攜帶Pigm基因)由江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。

CRISPR/Cas9雙元表達(dá)載體pBGK032來(lái)自百格基因科技(江蘇)有限公司。大腸桿菌DH-5α和農(nóng)桿菌EHA105由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所水稻研究室保存。

1.2 CRISPR-Cas9-Bsr-d1表達(dá)載體構(gòu)建

利用targetDesign(http：//skl.scau.edu.cn/targetdesign/)進(jìn)行g(shù)RNA靶位點(diǎn)的設(shè)計(jì)。根據(jù)水稻生物學(xué)網(wǎng)站(http：//rice.plantbiology.msu.edu/)提供的Bsr-d1(LOC_Os03g32230)基因序列，選擇PAM(Protospacer adjacent motif)序列(NGG)上游約20 bp片段為靶位點(diǎn)序列(GGCGAAGGCCTTCCCGCAGA)，利用 NCBI 對(duì)水稻基因組進(jìn)行 Blast 以分析確認(rèn)靶位點(diǎn)的特異性。靶位點(diǎn)序列正義鏈和反義鏈設(shè)計(jì)，是在靶序列的5′端添加GTGT，靶序列互補(bǔ)鏈的5′端添加AAAC，使其與質(zhì)粒經(jīng)BsaⅠ酶切后形成黏性互補(bǔ)末端：正義鏈GTGTGGCGAAGGCCTTCCCGCAGA，反義鏈AAACTCTGCGGGAAGGCCTTCGCC。2條引物65 ℃退火5 min形成互補(bǔ)雙鏈 DNA，直接用于后續(xù)的載體構(gòu)建。

對(duì)pBGK032雙元載體進(jìn)行酶切：pBGK032質(zhì)粒2 μg，10×NEB緩沖液5 μL，BsaⅠ 10 U，加ddH2O至50 μL。酶切后用DNA純化試劑盒進(jìn)行純化，然后用T4連接酶將線性化的pBGK032(10 ng)與靶序列雙鏈 DNA(0.05 mmol/L)進(jìn)行過(guò)夜連接，采用熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α。根據(jù)載體序列信息設(shè)計(jì)上下游引物Cas9-F/Cas9-R(Cas9-F：CCATGAAGCCTTTCAGGACATGTA，Cas9-R：ACGCTGCAAACATGAGACGGAGAA)進(jìn)行PCR鑒定，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤的重組表達(dá)載體命名為CRISPR-Cas9-Bsr-d1，并轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌 EHA105中。

1.3 水稻遺傳轉(zhuǎn)化及無(wú) T-DNA元件的bsr-d1純合突變體篩選

將攜帶CRISPR-Cas9-Bsr-d1重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌EHA105 轉(zhuǎn)化受體水稻品種水晶3號(hào)的愈傷組織，在含有潮霉素的培養(yǎng)基上篩選有抗性的再生組培苗即T0植株。將組培苗經(jīng)過(guò)煉苗后轉(zhuǎn)移到溫室種植，采用CTAB法于四葉期提取葉片DNA，用潮霉素抗性基因特異性引物Hyg-F/Hyg-R(Hyg-F：CGAGAGCCTGACCTATTGCAT，Hyg-R：CTGCTCCATACAAGCCAACCAC)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能擴(kuò)增出481 bp目標(biāo)條帶的即為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。

設(shè)計(jì)能夠擴(kuò)增含有CRISPR/Cas9靶序列的特異性引物(GP-F：GAGGTCGAAGTTCCTGACGG，GP-R：GGCGATCAACAAGGAGGAGT)，以上述陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株DNA為模板擴(kuò)增目的條帶(長(zhǎng)度約為490 bp)，將PCR產(chǎn)物送上海生工生物公司測(cè)序，以野生型水晶3號(hào)Bsr-d1基因序列為參考，采用在線分析軟件DSDecodeM(http：//skl.scau.edu.cn/dsdecode/)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，以明確突變位點(diǎn)的具體情況。根據(jù)測(cè)序獲得的水晶3號(hào)不同類型突變體中的編碼序列，利用BioEdit軟件翻譯成蛋白質(zhì)序列并進(jìn)行多重序列比對(duì)，然后將比對(duì)結(jié)果保存為Fasta格式，利用ClustalX軟件轉(zhuǎn)換為MSF格式，然后用GeneDoc軟件分析各突變單株氨基酸序列的變化情況。

篩選得到的T0純合突變株經(jīng)自交結(jié)實(shí)后得到T1種子，將T1種子播種成苗移栽后提取葉片基因組DNA，用載體特異引物Hyg-F/Hyg-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，無(wú)法擴(kuò)增出目的條帶的植株即為無(wú)T-DNA成分的T1單株。

1.4 無(wú)T-DNA元件的bsr-d1純合突變體中抗稻瘟病基因 Pigm的導(dǎo)入

2019年夏季在原陽(yáng)試驗(yàn)基地以無(wú)T-DNA成分的T1單株為母本，以攜帶Pigm基因的金玉1號(hào)為父本，雜交獲得F1。2019年冬單株種植于溫室，利用武漢雙綠源創(chuàng)芯科技研究院有限公司研制的GSR40K高密度水稻基因芯片(基于Illumina芯片制造技術(shù)開(kāi)發(fā)的SNP 芯片，包含了豐富的多態(tài)性標(biāo)記、重要農(nóng)藝性狀的功能基因標(biāo)記和單倍型標(biāo)記以及用于定位 QTL標(biāo)記)，篩選出攜帶Pigm基因的單株，以野生型水晶3號(hào)為輪回親本，連續(xù)回交3代，采用GSR40K基因芯片同時(shí)進(jìn)行目標(biāo)基因和背景選擇，獲得BC3F1。2020年冬選擇含Pigm基因且背景回復(fù)好的重組單株自交一次，獲得BC3F2。對(duì)BC3F2進(jìn)行前景及背景選擇，最終獲得抗病基因(同時(shí)攜帶bsr-d1和Pigm基因)純合，且背景基本回復(fù)的水晶3號(hào)改良系。

1.5 水晶3號(hào)改良株系幼苗期的葉瘟抗性鑒定

將同時(shí)攜帶bsr-d1和Pigm基因的水晶3號(hào)改良株系及其野生型對(duì)照培養(yǎng)至五葉期，剪取5～6 cm長(zhǎng)的水稻頂端完全伸展的葉片，用接種針在主脈間隔一定距離劃3個(gè)傷口且不穿透葉片，然后置于平皿內(nèi)保濕的濾紙上。參考徐鵬等[15]的方法，將稻瘟病菌(GUY11由福建農(nóng)林科技大學(xué)劉建平老師提供)制成分生孢子懸浮液(2×105個(gè)/mL)。用移液槍在葉片傷口處點(diǎn)滴15 μL的孢子液，隨即在25 ℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)30 h。然后將光照時(shí)間調(diào)整為14 h，溫度保持在25 ℃，濕度飽和。接種后5 d觀察病斑大小。

1.6 水晶3號(hào)改良株系接種稻瘟病菌前后的生理指標(biāo)測(cè)定

將獲得的攜帶bsr-d1和Pigm基因的水晶3號(hào)改良株系及野生型對(duì)照材料培養(yǎng)至四葉一心期，用分生孢子懸浮液活體噴霧處理，分別在接種0，2，5 d時(shí)取葉片測(cè)定各材料生理指標(biāo)。利用商業(yè)化試劑盒(蘇州科銘)結(jié)合酶標(biāo)儀對(duì)過(guò)氧化物酶(POD)活性[16]和過(guò)氧化氫(H2O2)含量[17]進(jìn)行測(cè)定(具體方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū))，以上均以未接種的材料為對(duì)照，3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bsr-d1靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)和CRISPR-Cas9-Bsr-d1表達(dá)載體構(gòu)建

首先對(duì)日本晴、水晶3號(hào)和地谷中Bsr-d1基因的功能位點(diǎn)區(qū)段進(jìn)行PCR產(chǎn)物測(cè)序，發(fā)現(xiàn)地谷Bsr-d1基因啟動(dòng)子功能位點(diǎn)的堿基為G，而水晶3號(hào)和日本晴在同一位點(diǎn)的堿基為A(圖1-A)，說(shuō)明水晶3號(hào)不具有bsr-d1介導(dǎo)的稻瘟病抗性。然后根據(jù)日本晴中Bsr-d1基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物Bsr-d1-F/Bsr-d1-R(GCTCATCATCCATCCATCTC/GGCGACAATCAATCTTGG)，以水晶3號(hào)基因組DNA為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)水晶3號(hào)中Bsr-d1基因與數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的日本晴Bsr-d1完全一致，整個(gè)CDS區(qū)只有1個(gè)外顯子，長(zhǎng)度為663 bp，編碼220個(gè)氨基酸。根據(jù)CRISPR-Cas9靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)原則，在Bsr-d1基因編碼區(qū)靠近ATG一端設(shè)計(jì)20 bp的gRNA靶序列GGCGAAGGCCTTCCCGCAGA，靶序列3′端為PAM序列CGG(圖1-B)。退火形成的雙鏈互補(bǔ)靶序列經(jīng)BsaⅠ酶切后與雙元載體pBGK032連接形成重組載體CRISPR-Cas9-Bsr-d1(圖1-B)。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，目標(biāo)片段長(zhǎng)度約為361 bp，符合預(yù)期結(jié)果，表明CRISPR-Cas9-Bsr-d1表達(dá)載體構(gòu)建成功。選取驗(yàn)證片段大小正確的菌株抽提質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤后，將陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 EHA105。

圖1 不同水稻品種中Bsr-d1基因啟動(dòng)子的功能位點(diǎn)分析(A)及CRISPR-Cas9-Bsr-d1重組載體信息(B)Fig.1 Functional locus of Bsr-d1 gene promoter in different rice varieties(A)and schematic information of the CRISPR-Cas9-Bsr-d1 recombinant vector(B)

2.2 T0轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株的獲得及靶位點(diǎn)的突變分析

通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將構(gòu)建好的CRISPR-Cas9-Bsr-d1重組表達(dá)載體導(dǎo)入水晶3號(hào)愈傷組織，經(jīng)潮霉素篩選，共獲得34個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化體。將獲得的轉(zhuǎn)基因植株煉苗后轉(zhuǎn)移至溫室培養(yǎng)，四葉期時(shí)提取葉片DNA用潮霉素抗性基因引物Hyg-F/Hyg-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)34個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化體均攜帶有潮霉素抗性基因，陽(yáng)性率達(dá)到100%(圖2)。為了解水晶3號(hào)中Bsr-d1基因的突變情況，以上述葉片DNA為模板用能夠擴(kuò)增含有CRISPR/Cas9靶序列的特異性引物GP-F/GP-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖2)，并對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，利用在線分析軟件DSDecodeM進(jìn)行序列解碼。結(jié)果表明，有21株陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因苗在靶位點(diǎn)處發(fā)生了突變，突變率為61.8%；突變基因型包括純合突變和雜合突變，其中有8株為純合突變，占38.1%，13株為雜合突變，占61.9%；純合突變類型包括堿基插入和缺失(圖3-A)，其中T插入占25.0%，GA缺失占37.5%，G插入及CGCA和CGCAGA堿基缺失各占12.5%。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明，與野生型Bsr-d1基因的氨基酸序列相比，編輯后的Bsr-d1基因由于出現(xiàn)堿基的插入或缺失造成了移碼突變(SJ3+T、SJ3+G、SJ3-2和SJ3-4)，導(dǎo)致氨基酸序列組成出現(xiàn)較大變化或翻譯提前終止；CGCAGA堿基缺失則導(dǎo)致了整碼突變，在77，78位置缺失了纈氨酸和半胱氨酸2個(gè)氨基酸，其他氨基酸則無(wú)變化(圖3-B)。以上突變體氨基酸的變化有可能造成蛋白質(zhì)功能的喪失。

Marker.2000 bp DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量；+.Hyg基因的陽(yáng)性對(duì)照；-.雙蒸水；1—34.34個(gè)T0 獨(dú)立轉(zhuǎn)化體。Marker.2000 bp DNA Marker；+.Positive control of Hyg；-.ddH2O；1—34.34 independent transformants in T0 generation.

2.3 無(wú)T-DNA元件的bsr-d1純合突變體篩選及抗稻瘟病基因 Pigm的導(dǎo)入

為快速獲得不包含T-DNA元件的bsr-d1純合突變株用于后續(xù)研究，將T0的5種類型的純合突變株系自交，結(jié)實(shí)后得到T1種子，將T1種子播種，成苗后提取葉片基因組DNA，用載體特異引物Hyg-F/Hyg-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，無(wú)法擴(kuò)增出481 bp目的條帶的植株即為無(wú)轉(zhuǎn)基因成分的bsr-d1純合突變體(圖4)。以無(wú)轉(zhuǎn)基因成分的bsr-d1純合突變體基因組DNA為模板，利用靶點(diǎn)檢測(cè)特異性引物GP-F/GP-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物測(cè)序表明無(wú)轉(zhuǎn)基因成分的bsr-d1純合突變體靶位點(diǎn)突變情況與T0是一致的，說(shuō)明這5種Bsr-d1單基因突變類型在剔除Cas9載體骨架后能夠穩(wěn)定遺傳。

A．T0轉(zhuǎn)基因水晶3號(hào)的5 種純合突變體類型；B．Bsr-d1基因野生型及5種純合突變類型的氨基酸序列分析:SJ3.野生型,SJ3+T.T堿基插入,SJ3+G.G堿基插入,SJ3-2.GA堿基缺失,SJ3-4.CGCA堿基缺失,SJ3-6.CGCAGA堿基缺失。A.Five types of homozygous mutants of Shuijing 3 in T0 generation；B.Bsr-d1 gene amino acid sequences in the wild type and five homozygous mutant lines:SJ3.Wild type,SJ3+T.T base insertion,SJ3+G.G base insertion,SJ3-2.GA bases deletion,SJ3-4.CGCA bases deletion,SJ3-6.CGCAGA bases deletion.

Marker.2000 bp DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量；1—24.24個(gè)T1 單株。Marker.2000 bp DNA Marker；1—24.24 independent plants in T1 generation.

以無(wú)T-DNA成分的T1bsr-d1純合突變體為母本，以攜帶Pigm基因的金玉1號(hào)為父本，雜交獲得F1，利用GSR40K基因芯片篩選出攜帶Pigm基因的F1單株，以水晶3號(hào)為輪回親本，連續(xù)回交3代獲得BC3F1，根據(jù)芯片檢測(cè)結(jié)果選擇含Pigm基因且背景回復(fù)好的重組單株自交一次，獲得BC3F2，并篩選獲得抗病基因(同時(shí)攜帶bsr-d1和Pigm基因)純合，且背景基本回復(fù)的水晶3號(hào)改良植株(圖5，以T堿基插入突變體為例)。攜帶Pigm基因的水晶3號(hào)bsr-d1純合突變體SJ3+T、SJ3+G、SJ3-2、SJ3-4、SJ3-6的背景回復(fù)率分別為97.86%，96.71%，97.39%，97.52%，96.79%，將以上水晶3號(hào)改良系依次命名為SJ3-G1、SJ3-G2、SJ3-G3、SJ3-G4、SJ3-G5。

藍(lán)色.雜合基因位點(diǎn)；紅色.純合Pigm基因位點(diǎn)。Blue.Heterozygous gene locus；Red.Homozygous Pigm locus.

2.4 水晶3號(hào)改良株系幼苗期的葉瘟抗性鑒定

采用離體水稻葉片劃傷接種稻瘟病菌方法鑒定不同類型水晶3號(hào)改良株系幼苗期對(duì)稻瘟病菌的抗性，接種5 d后對(duì)病斑葉片進(jìn)行拍照 (圖6)。從圖6可以看出，野生型水晶3號(hào)葉片感病比較嚴(yán)重，病斑面積明顯大于水晶3號(hào)各改良株系。以上結(jié)果表明，同時(shí)攜帶bsr-d1和Pigm基因的水晶3號(hào)各改良株系在幼苗期對(duì)稻瘟病菌生理小種GUY11引起的葉瘟抗性均明顯提高。但是否對(duì)其他稻瘟病菌生理小種產(chǎn)生抗性及穗頸瘟抗性如何，仍需進(jìn)一步接種鑒定。

圖6 水晶3號(hào)改良株系及其野生型對(duì)照的稻瘟病菌接種鑒定結(jié)果Fig.6 Identification of improved strains of Shuijing 3 and the wild-type control after inoculation with M.coryza

2.5 水晶3號(hào)改良株系接種稻瘟病菌前后的生理指標(biāo)測(cè)定

水稻幼苗未接種稻瘟病菌時(shí)，SJ3-G1、SJ3-G3株系葉片中POD活性與對(duì)照相比顯著降低，SJ3-G2、SJ3-G4、SJ3-G5株系葉片中POD活性則與對(duì)照無(wú)顯著差異；接種稻瘟病菌2，5 d后，水晶3號(hào)改良系葉片中POD活性均顯著低于對(duì)照(圖7-A)。未接種稻瘟病菌時(shí)，各改良株系葉片中H2O2含量與對(duì)照無(wú)顯著差異；接種稻瘟病菌2，5 d后，水晶3號(hào)改良系葉片中H2O2含量均顯著高于對(duì)照(圖7-B)。不論對(duì)照還是改良系，葉片中H2O2含量均隨著接種時(shí)間的增加而呈增加趨勢(shì)，POD活性變化不明顯。

柱上不同小寫(xiě)字母表示野生型和各改良株系在接種后同一時(shí)期0.05水平上差異顯著(t測(cè)試)。Different lowercase letters above the bars indicate significant difference between the wild type and the improved lines at the 0.05 levels by t-test at the same stage.

3 結(jié)論與討論

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)由于具有精準(zhǔn)、便捷、高效、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在水稻稻瘟病抗性遺傳改良中得到了廣泛應(yīng)用。Wang等[18]利用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)定向編輯水稻稻瘟病負(fù)調(diào)控基因OsERF922，從50株陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體中鑒定到21株T0突變株，經(jīng)過(guò)自交分離，最終獲得6個(gè)稻瘟病抗性明顯增強(qiáng)且無(wú)外源基因成分的T2純合突變株系，CRISPR/Cas9技術(shù)可以在不影響其他農(nóng)藝性狀的前提下實(shí)現(xiàn)對(duì)水稻抗病性的改良。楊海河等[19]利用CRISPR-Cas9技術(shù)對(duì)水稻稻瘟病感病品種日本晴pi21基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，最終獲得了21株不含T-DNA轉(zhuǎn)基因序列的pi21純合突變體，對(duì)其中1個(gè)pi21突變株系進(jìn)行稻瘟病菌孢子噴霧接種，發(fā)現(xiàn)突變株系的抗病性顯著高于野生型日本晴。徐鵬等[15]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)長(zhǎng)粒粳稻恢復(fù)系L1014中Pita、Pi21和ERF922進(jìn)行定點(diǎn)編輯，獲得了Pi21單突變株系和Pita、Pi21、ERF922三突變株系，接種鑒定結(jié)果表明，突變株系的稻瘟病抗性比野生型顯著提高。

編碼 C2H2 類轉(zhuǎn)錄因子的Bsr-d1基因是從廣譜抗稻瘟病品種地谷中鑒定出來(lái)的，由于該基因通過(guò)RNAi或CRISPR/Cas9技術(shù)被敲除后，水稻品種TP309的稻瘟病抗性明顯提高，因此，bsr-d1被認(rèn)為是一個(gè)調(diào)控水稻稻瘟病廣譜抗性的新的遺傳位點(diǎn)[7，20]。bsr-d1為轉(zhuǎn)錄因子，其介導(dǎo)的稻瘟病抗性屬于非R類部分抗性，抗性相對(duì)穩(wěn)定和持久。bsr-d1主要分布在秈型水稻資源中，在粳型資源中幾乎不存在[21]。因此，為了快速獲得具有廣譜持久稻瘟病抗性的水晶3號(hào)，本研究首先利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定向編輯Bsr-d1基因，并通過(guò)自交分離獲得了不含T-DNA轉(zhuǎn)基因成分的水晶3號(hào)bsr-d1純合突變株系，包括T插入、G插入、GA缺失、CGCA缺失和CGCAGA缺失5種類型，突變類型較為豐富。34個(gè)T0轉(zhuǎn)基因植株中Bsr-d1基因的突變率為61.8%，其中有8株為純合突變體。純合變變類型中GA缺失型最多，占全部純合突變體的37.5%，其次為T(mén)插入占25.0%，G插入及CGCA和CGCAGA堿基缺失則各占12.5%。氨基酸序列分析結(jié)果表明，以上5種突變類型均導(dǎo)致了Bsr-d1氨基酸序列組成的變化或翻譯提前終止，很有可能造成蛋白質(zhì)功能的喪失，從而使得水晶3號(hào)獲得稻瘟病抗性。

研究認(rèn)為，完全抗性與部分抗性結(jié)合利用在抗稻瘟病育種中有重要的應(yīng)用價(jià)值[5]。作為公認(rèn)的持久廣譜抗稻瘟病基因，Pigm目前在河南沿黃粳稻育種中還沒(méi)有得到充分利用[22]，因此，本研究在獲得Bsr-d1純合突變株系的基礎(chǔ)上，經(jīng)雜交、回交、自交并采用武漢雙綠源創(chuàng)芯科技研究院有限公司的GSR40K高密度水稻基因芯片進(jìn)行前景和背景選擇，大大縮短了育種周期，只經(jīng)過(guò)4代就將粳稻金玉1號(hào)中的Pigm基因?qū)胍陨贤蛔冎晗抵校⒆罱K獲得抗病基因(同時(shí)攜帶bsr-d1和Pigm基因)純合，且背景基本回復(fù)(背景回復(fù)率均在96%以上)的水晶3號(hào)改良植株即SJ3-G1、SJ3-G2、SJ3-G3、SJ3-G4、SJ3-G5。稻瘟病菌接種鑒定結(jié)果表明，與野生型水晶3號(hào)相比，改良株系葉片上的病斑面積明顯變小，稻瘟病抗性明顯提高。

研究表明，適度提高H2O2含量能夠增強(qiáng)水稻稻瘟病抗性[23]。bsr-d1通過(guò)調(diào)控過(guò)氧化氫酶基因的表達(dá)調(diào)節(jié)H2O2的積累，從而影響水稻的稻瘟病抗性。敲除Bsr-d1基因能夠顯著降低過(guò)氧化物酶基因的表達(dá)量，進(jìn)而減弱其對(duì)H2O2的降解引起細(xì)胞內(nèi)H2O2的富集，從而提高水稻植株抗病性[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，接種稻瘟病菌后，水晶3號(hào)改良株系葉片中POD活性顯著低于其野生型對(duì)照，H2O2含量則正好相反，改良株系葉片中H2O2含量顯著高于其野生型對(duì)照。這與以前的研究結(jié)果是一致的，證明稻瘟病抗性與H2O2含量存在一定正相關(guān)關(guān)系，而與POD活性則存在一定負(fù)相關(guān)關(guān)系，很有可能是因?yàn)锽sr-d1基因被敲除后，引起活性氧清除相關(guān)酶類基因的表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞內(nèi)H2O2在一定程度上得以富集從而使水稻植株獲得了稻瘟病抗性，至于Pigm在這種調(diào)節(jié)機(jī)制中的具體作用還需要深入研究。

本研究通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇獲得了同時(shí)攜帶bsr-d1和Pigm基因且無(wú)外源轉(zhuǎn)基因成分的水晶3號(hào)改良株系，并證實(shí)這些改良株系在苗期由于POD活性的降低和H2O2含量的增加一定程度上提高了對(duì)稻瘟病生理小種GUY11的抗性，但對(duì)其他稻瘟病生理小種是否具有抗性、穗頸瘟抗性如何、主效R基因和非R基因結(jié)合產(chǎn)生的抗性能否持久穩(wěn)定、bsr-d1和Pigm基因之間存在何種關(guān)系，這些都還需要進(jìn)一步研究。本研究為培育具有廣譜持久稻瘟病抗性的優(yōu)質(zhì)水稻新品種提供了重要的資源。在此基礎(chǔ)上，利用多種稻瘟病菌生理小種研究水晶3號(hào)改良系的抗性譜，開(kāi)展多年多生態(tài)點(diǎn)抗性鑒定尤其是穗頸瘟抗性鑒定以明確抗性是否持久，同時(shí)開(kāi)展產(chǎn)量、品質(zhì)等其他農(nóng)藝性狀鑒定，并利用這些材料改良其他骨干水稻親本的稻瘟病抗性，將是未來(lái)研究的重點(diǎn)方向。