合浦珠母貝PfCLEC17A 基因的克隆及表達(dá)分析

鄭玉斯，王 培，郭 穎，白麗蓉，喻達(dá)輝，趙 森

(北部灣大學(xué) 廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 欽州 535011)

海水珍珠養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)是北部灣海域的特色經(jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè)之一，合浦珠母貝(Pinctadafucata)作為培育海水珍珠的主要貝種，近年來由于養(yǎng)殖環(huán)境惡化和病害增多等因素，使得合浦珠母貝在人工養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)大量死亡現(xiàn)象，造成珍珠的產(chǎn)量和質(zhì)量下降，這一情況嚴(yán)重制約了合浦珠母貝養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]。養(yǎng)殖環(huán)境的惡化會(huì)造成貝類免疫力降低，同時(shí)解決病害問題也需要激活合浦珠母貝自身的免疫功能來發(fā)揮作用，所以對(duì)合浦珠母貝機(jī)體的免疫機(jī)制研究就顯得特別重要。貝類屬于無脊椎動(dòng)物中的軟體動(dòng)物門，與脊椎動(dòng)物不同，由于其缺乏適應(yīng)性免疫，主要依靠先天免疫來防御各種病原體[2]。其中，識(shí)別抗原分子是機(jī)體先天免疫發(fā)生起始的關(guān)鍵，之后才能將識(shí)別后的信號(hào)傳遞到下游通路從而激活免疫應(yīng)答[3]。這種識(shí)別是由一種或多種病原譜模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors，PRRs)來完成，它們可以識(shí)別并結(jié)合那些微生物表面保守而在宿主中不存在的特定的病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular patterns，PAMPs)[4]，例如細(xì)菌脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)、脂蛋白、鞭毛蛋白和核酸結(jié)構(gòu)等，即PRRs與PAMPs結(jié)合后能夠檢測(cè)非自身分子并觸發(fā)機(jī)體免疫防御[5]。到目前為止，已經(jīng)有不少學(xué)者對(duì)PRRs家族進(jìn)行了鑒別和研究。其中，C型凝集素是PRRs家族中的研究熱點(diǎn)，它在軟體動(dòng)物先天免疫反應(yīng)中參與非自身分子識(shí)別過程[6-9]。

C型凝集素是一種鈣離子依賴的糖結(jié)合蛋白，參與多種免疫相關(guān)和其他生理功能。它通過與靶細(xì)胞中的糖基化分子表面的多糖進(jìn)行糖特異性結(jié)合，在病原體識(shí)別和細(xì)胞間的相互作用中發(fā)揮重要作用[10]。C型凝集素有一個(gè)典型的結(jié)構(gòu)域，命名為C型凝集素結(jié)構(gòu)域(CTLD)或碳水化合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域(Carbonhydrate-recognition domain，CRD)，它與微生物中存在的碳水化合物有很強(qiáng)的親和力[11]。通過這種特異性結(jié)合，C型凝集素能夠介導(dǎo)多種重要的細(xì)胞過程，包括白細(xì)胞黏附和快速刺激防御機(jī)制對(duì)抗有害微生物等[12]。到目前為止，已經(jīng)在軟體動(dòng)物中鑒定了多種C型凝集素基因[13-15]。這些基因參與各種生物免疫過程，包括非自我識(shí)別、微生物凝集、吞噬作用和包裹作用的誘導(dǎo)以及抗菌特性[13]。例如長(zhǎng)牡蠣(Crassostreagigas)的CgCLec-2在免疫識(shí)別中作為模式識(shí)別受體發(fā)揮作用，在病原消除后作為調(diào)節(jié)因子，并在補(bǔ)體系統(tǒng)的激活中發(fā)揮潛在作用[15]。此外，在櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)中鑒別了5個(gè)C型凝集素基因(CfLec-1～CfLec-5)，在海灣扇貝(Argopectenirradians)上發(fā)現(xiàn)了7個(gè)C型凝集素基因(AiCTL-1～AiCTL-7)，其中大部分凝集素只對(duì)某些特定的革蘭氏陽性或革蘭氏陰性菌起作用[16]。最近，在菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)中也鑒定出2種C型凝集素(Vpclec-3和Vpclec-4)，它們作為模式識(shí)別受體具有明顯的識(shí)別譜，并可能參與菲律賓蛤仔對(duì)弧菌的天然免疫應(yīng)答[17]。以上研究結(jié)果顯示，雙殼類動(dòng)物體內(nèi)的C型凝集素與病原體表面的碳水化合物有較強(qiáng)的親和力，在各種微生物感染的早期階段發(fā)揮著重要作用[18-19]。目前，在合浦珠母貝中已報(bào)道了PoLEC1[20]、PoLEC2[21]和PmLec-8[22]等C型凝集素的相關(guān)研究。雖然對(duì)C型凝集素基因家族中的部分成員進(jìn)行了相關(guān)研究，由于海洋環(huán)境的復(fù)雜性，海洋生物在面對(duì)不同的病原微生物時(shí)的識(shí)別機(jī)制可能有所不同。因此，有必要進(jìn)一步鑒定C型凝集素基因家族中其他成員并研究它們?cè)诘挚共≡⑸锴趾Ψ矫嫠l(fā)揮的功能，旨在為更深入理解無脊椎動(dòng)物的免疫機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為我國(guó)水產(chǎn)貝類的綠色養(yǎng)殖提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用合浦珠母貝購自廣西北海市某珍珠養(yǎng)殖場(chǎng)，其殼長(zhǎng)(47±5)mm、殼寬(15±3)mm、殼高(52±4)mm、體質(zhì)量(20±4)g。選取健康有活力的合浦珠母貝個(gè)體，分別采集鰓、外套膜、閉殼肌、足和肝胰腺等組織于液氮中冷凍后放至-80 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

使用的試劑TRIzol、TransScript?Ⅱ All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR、TransStart?Green qPCR SuperMix、pEASY?-T1 Cloning Kit、Trans5α Chemically Competent Cell購自北京全式金公司，SMARTer RACE 5′/3′Kit購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取和第一鏈cDNA合成 采用 TRIzol 法提取各組織RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，使用Little Lunatic高通量微流控全光譜分光光度計(jì)(美國(guó)Unchained Labs)檢測(cè)RNA濃度。 按照 TransScript?Ⅱ All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明合成 cDNA，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 全長(zhǎng)cDNA克隆 從合浦珠母貝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出C型凝集素基因的同源序列，利用Oligo軟件設(shè)計(jì)引物PfCLEC17A-F和PfCLEC17A-R(表1)，以合浦珠母貝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中表達(dá)量最高的肝胰腺cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s 72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min；反應(yīng)結(jié)束后所得PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，并進(jìn)行回收純化PCR產(chǎn)物。將回收后的目的DNA片段與pMD18-T質(zhì)粒連接后導(dǎo)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)菌落PCR確認(rèn)的陽性克隆菌落送至廣州生工測(cè)序部進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果使用軟件DNAMAN 8.0(Lynnon Biosoft，美國(guó))進(jìn)行拼接和序列比對(duì)。針對(duì)拼接正確的序列設(shè)計(jì)特異性引物，用SMARTer RACE 5′/3′Kit(TaKaRa)進(jìn)行RACE 擴(kuò)增。首先，按照SMARTer RACE 5′/3′ Kit試劑盒說明書合成3′RACE-cDNA和5′RACE-cDNA，以此cDNA為模板進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；反應(yīng)結(jié)束后PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)后，進(jìn)行第2輪PCR，對(duì)目的條帶進(jìn)行膠回收純化、連接轉(zhuǎn)化、挑選陽性菌并測(cè)序。

表1 PfCLEC17A擴(kuò)增及表達(dá)所用引物Tab.1 Primers used in amplification and expression of PfCLEC17A

1.2.3 生物信息學(xué)分析 測(cè)序結(jié)果經(jīng)Chromas軟件分析后，在DNAMAN 8.0軟件上進(jìn)行序列拼接，獲得合浦珠母貝PfCLEC17A基因的全長(zhǎng)序列。利用NCBI ORF Finder在線工具查找開放閱讀框和預(yù)測(cè)編碼蛋白序列。采用ProtParam tool在線工具預(yù)測(cè)編碼蛋白的理化特性；使用 SignalP 3.0(https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-3.0)預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽序列；采用 NetNGIys 1.0 預(yù)測(cè)糖基化位點(diǎn)；采用NetPhos 3.1預(yù)測(cè)蛋白磷酸化位點(diǎn)；采用 SMART 4.0 進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析；使用SWISS-MODEL在線軟件進(jìn)行同源建模，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用Expasy在線預(yù)測(cè)蛋白的親水性/疏水性；利用MegAlign分析序列同源性，在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索不同物種的同源序列，使用Clustal 2.1和GENEDOC軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)；挑選出最具代表性物種的C型凝集素序列，使用MEGA 7.0 軟件的 Neighbor-joining法構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.4PfCLEC17A基因的熒光定量PCR分析 選取6只健康的合浦珠母貝并對(duì)其進(jìn)行解剖，取鰓、外套膜、閉殼肌、性腺、血液、足和肝胰腺等7個(gè)組織用于分析PfCLEC17A基因在不同組織中的表達(dá)情況。以麻醉后注射閉殼肌的方式對(duì)合浦珠母貝進(jìn)行溶藻弧菌攻毒感染，在感染后的第0，1，3，6，12，24，48，72，96小時(shí)隨機(jī)采集6個(gè)合浦珠母貝的肝胰腺組織來分析PfCLEC17A基因的表達(dá)量變化，以注射0.1 mL PBS的個(gè)體作為空白對(duì)照組。所有樣品取下后立刻放于液氮中速凍，保存于-80 ℃冰箱備用。所有樣品的RNA提取和cDNA合成步驟如前所述。cDNA按照 1∶8稀釋后作為試驗(yàn)?zāi)０?，參照全式金公司的TransScript?Green qPCR SuperMix試劑盒說明書進(jìn)行熒光定量PCR分析，全程操作在冰上進(jìn)行。每次試驗(yàn)3個(gè)樣品，每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)。

1.2.5 熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析 熒光定量PCR結(jié)果使用 2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算，分析PfCLEC17A基因在合浦珠母貝各組織以及溶藻弧菌刺激后各時(shí)間段內(nèi)的相對(duì)表達(dá)情況。計(jì)算結(jié)果使用 IBM SPSS Statistics 22 軟件中的LSD(最小顯著性差異)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PfCLEC17A基因的克隆與序列分析

通過分析合浦珠母貝的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)PfCLEC17A-F和PfCLEC17A-R引物，擴(kuò)增獲得Ctypelectin17A基因的中間片段，經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證，該片段長(zhǎng)度為534 bp(圖1-A)。采用5′-RACE技術(shù)進(jìn)行巢式PCR得到RACE產(chǎn)物長(zhǎng)度為150 bp(圖1-B)，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，除去和ORF重疊的堿基后得到5′ 非編碼區(qū)(Untranslation region，UTR) 為117 bp。用同樣的方法進(jìn)行巢式PCR，得到3′-RACE產(chǎn)物長(zhǎng)311 bp(圖1-C)，測(cè)序驗(yàn)證后3′-UTR為48 bp。將所有測(cè)序序列進(jìn)行拼接，得到PfCLEC17A基因全長(zhǎng)為699 bp(圖2)。

DNA Marker為DL2000。The DNA Marker is DL2000.

雙下劃線.CLECT結(jié)構(gòu)域；陰影部分.信號(hào)肽區(qū)域；黃色陰影部分.二硫鍵；藍(lán)色陰影部分.糖基化位點(diǎn)。

2.2 PfCLEC17A的分子特征鑒定

生物信息學(xué)分析顯示，PfCLEC17A蛋白理論分子質(zhì)量為20.326 ku，理論等電點(diǎn)pI為6.11，預(yù)測(cè)前24個(gè)氨基酸為信號(hào)肽(圖2、圖3-A)，PfCLEC17A蛋白含有一個(gè)經(jīng)典的CLECT結(jié)構(gòu)域(圖3-B)，含有17個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中2個(gè)為Tyr、7個(gè)為Ser、8個(gè)為Thr位點(diǎn)，還有4個(gè)糖基化位點(diǎn)，分別位于N20、N85、N140和N142(圖2)。同時(shí)還預(yù)測(cè)到2對(duì)保守的二硫鍵(C16-C119和C93-C111)(圖2)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(準(zhǔn)確度高于70%)顯示，PfCLEC17A蛋白由2個(gè)α-螺旋和10個(gè)β-折疊組成。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的3D模型如圖3-C所示。蛋白質(zhì)親水/疏水性分析結(jié)果顯示(圖3-D)，大部分氨基酸殘基的分值為負(fù)值(正值代表疏水性，負(fù)值代表親水性)，所以PfCLEC17A蛋白為親水性蛋白。

A.蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測(cè)；B.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；C.蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；D.蛋白質(zhì)親水性/疏水性預(yù)測(cè)。A.Protein signal peptide prediction；B.Protein domain prediction；C.Protein tertiary structure prediction；D.Protein hydrophilicity/hydrophobicity prediction.

2.3 合浦珠母貝PfCLEC17A氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，PfCLEC17A與其他物種的C型凝集素氨基酸序列的同源性在14.7%～87.9%。其中，與櫛孔扇貝的相似性最高，為87.9%，與紫貽貝的相似性次之，為61.3%，與高原鼠兔的相似性最低，為14.7%。利用ClustalW 2.1和GENEDOC軟件將PfCLEC17A蛋白與其他幾種貝類蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示(圖4)，PfCLEC17A的氨基酸序列與其他物種的氨基酸序列具有部分相似的結(jié)構(gòu)，都含有形成二硫鍵的4個(gè)保守的半胱氨酸，糖結(jié)合位點(diǎn)幾乎都具有獨(dú)特的“EPN”結(jié)構(gòu)，但是在“WND”位點(diǎn)表現(xiàn)不一致，合浦珠母貝和櫛孔扇貝此位點(diǎn)為“WSD”基序，紫貽貝的則為“WDD”基序。

圖4 PfCLEC17A氨基酸序列比對(duì)Fig.4 PfCLEC17A amino acid sequence alignment

在MEGA 7.0中，以PfCLEC17A蛋白和其他物種的凝集素序列通過鄰近法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示(圖5)，白頭海雕等幾種鳥類聚在一起，智人和高原鼠兔2種哺乳動(dòng)物聚為一支，合浦珠母貝先與櫛孔扇貝聚在同一分支上，然后與其他軟體動(dòng)物聚在一起。以上聚類結(jié)果與傳統(tǒng)的分類方法相一致，也體現(xiàn)了PfCLEC17A在進(jìn)化上的保守性。

圖5 CLEC17A氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree analysis of CLEC17A

2.4 合浦珠母貝PfCLEC17A組織特異性表達(dá)分析

采用RT-qPCR方法檢測(cè)PfCLEC17A基因在合浦珠母貝鰓、外套膜、閉殼肌、肝胰腺、性腺、血細(xì)胞和足等不同組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示(圖6)，PfCLEC17A在所檢測(cè)的各組織中均有表達(dá)，但相對(duì)表達(dá)量存在顯著差異。在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量大小表現(xiàn)為肝胰腺>鰓>閉殼肌>足>性腺>外套膜>血細(xì)胞(P<0.05)。

M.外套膜；B.血細(xì)胞；GO.性腺；F.足；A.閉殼??；GI.鰓；HE.肝胰腺。不同字母表示在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量差異性顯著(P<0.05)。

2.5 溶藻弧菌感染后合浦珠母貝PfCLEC17A的表達(dá)量變化

熒光定量PCR分析結(jié)果顯示(圖7)，溶藻弧菌感染1 h后，PfCLEC17A表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高并達(dá)到最大值(圖7)，隨后表達(dá)量出現(xiàn)回落。除了1 h顯著上升(P<0.05)和第12，72小時(shí)外，在其他時(shí)間，溶藻弧菌感染后PfCLEC17A的相對(duì)表達(dá)量均低于注射PBS的對(duì)照組。由此可見，合浦珠母貝在受到病原微生物侵害初期，肝胰腺中PfCLEC17A基因會(huì)被迅速激活，但感染后期，其表達(dá)會(huì)受到一定程度的抑制。這可能與C型凝集素蛋白家族成員參與免疫激活的早期階段有關(guān)。

不同字母表示溶藻弧菌不同感染時(shí)間下的相對(duì)表達(dá)量有差異性顯著(P<0.05)。Different letters indicate significant differences in relative expression at different time after challenged with V.alginolyticus(P<0.05).

3 結(jié)論與討論

C型凝集素是一類含有鈣離子依賴糖識(shí)別域的蛋白超家族，根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能可以分為17個(gè)亞家族，每個(gè)成員都有其特有的結(jié)構(gòu)和功能[23-25]，除了一些C型凝集素(NK細(xì)胞受體家族)沒有經(jīng)典的CRD結(jié)構(gòu)域以外，大多數(shù)的C型凝集素受體都是聚糖結(jié)合受體，都含有一個(gè)或多個(gè)CRD識(shí)別域[26-27]。本研究獲得C型凝集素第17個(gè)亞家族成員A的序列，其開放閱讀框長(zhǎng)534 bp，編碼178個(gè)氨基酸殘基，含有一個(gè)經(jīng)典CRD碳水化合物識(shí)別域，有17個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中2個(gè)Tyr、7個(gè)Ser和8個(gè)Thr位點(diǎn)。C型凝集素根據(jù)參與聚糖識(shí)別和鈣離子配位的氨基酸基序不同可分為甘露糖基序(EPN，Glu-Pro-Asn)和半乳糖基序(QPN，Glu-Pro-Asp)兩類[27]。CLEC17A蛋白中存在EPN和WND 2個(gè)糖結(jié)合基序，其對(duì)甘露糖和Ca2+具有高度特異性[28]。本研究從合浦珠母貝中獲得的PfCLEC17A氨基酸序列中含有EPN和在WSD這2種基序。因?yàn)镋PN基序僅存在于膠原凝集素和選擇凝素中[29-30]，推測(cè)PfCLEC17A可能是一種膠原凝集素或選擇凝集素。據(jù)報(bào)道，第2個(gè)基序在脊椎動(dòng)物中一直是Trp-Asn-Asp(WND)，WND也在部分無脊椎動(dòng)物C型凝集素中存在。第2個(gè)基序在軟體動(dòng)物中表示出多樣性，目前已有10多個(gè)基序被報(bào)道，例如WND、Trp-Ile-Asp(WID)、Trp-Ser-Asp(WSD)、Trp-His-Asp(WHD)、Phe-Ser-Asp(FSD)和Leu-Ser-Asp(LSD)等[31-32]。其中EPN基序被認(rèn)為是與碳水化合物特異性結(jié)合的關(guān)鍵開關(guān)，第2個(gè)基序(WSD)會(huì)增加這種結(jié)合的親和力和特異性[31-32]。此外，用軟件分析得到序列中含有4個(gè)糖基化位點(diǎn)，分別是N20、N85、N140和N142，N-連接糖基化位點(diǎn)可能在CLEC17A向細(xì)胞表面的運(yùn)輸和定位中發(fā)揮生理作用[20]。

將合浦珠母PfCLEC17A氨基酸序列與其他物種進(jìn)行同源比對(duì)分析并構(gòu)建進(jìn)化樹，比對(duì)結(jié)果顯示，合浦珠母PfCLEC17A序列與櫛孔扇貝的序列相似性最高,為87.9%，與其他貝類相似性大部分在50%～60%，與其他物種序列同源性在10%～30%，與鼠兔的相似性最低僅為14.7%。進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，合浦珠母PfCLEC17A與其他軟體動(dòng)物親緣關(guān)系較近，與魚類鳥類的關(guān)系較遠(yuǎn)。將合浦珠母與其他物種的CTL所編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性和相似性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它們的同源性與相似性不高，僅凝集素特有的基序及功能位點(diǎn)基本保持一致。在其他貝類C型凝集素同源比較研究也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)論[33-35]，由此可見，C型凝集素是一類進(jìn)化較快但功能位點(diǎn)保守的蛋白質(zhì)。

本研究檢測(cè)了PfCLEC17A基因在不同組織中的表達(dá)情況，在所檢測(cè)組織中均有表達(dá)，其中在肝胰腺中表達(dá)最高。目前，關(guān)于貝類CLEC17A基因的研究較少，但是關(guān)于貝類C型凝集素家族其他成員的研究已有相關(guān)報(bào)道，如馬氏珠母貝PmLec-8基因在各組織中均有表達(dá)，在肝胰腺中表達(dá)量最高，其次是鰓[22]；在海灣扇貝中，C型凝集素在肝胰腺中表達(dá)量最高，血淋巴表達(dá)量最低，在其他組織中均有所表達(dá)[36]；在關(guān)于菲律賓蛤仔[37]的研究中，6個(gè)C型凝集素基因分別在鰓和肝胰腺中顯著高表達(dá)。最近在菲律賓蛤蜊中鑒定了VpClec-3和VpClec-4共2種C型凝集素基因，它們?cè)诟我认俸亡w組織中均高水平表達(dá)[17]。以上研究顯示，C型凝集素在多種組織中表達(dá)，說明它在多種病原免疫反應(yīng)中扮演重要角色。但在不同物種的不同組織中表達(dá)量不盡相同，可能是由不同物種C型凝集素的分布及功能不同造成的。肝胰腺不僅是軟體動(dòng)物的主要免疫器官，也是消化代謝最旺盛的器官，大多數(shù)免疫相關(guān)基因在肝胰腺中都有表達(dá)[37-38]。其次，鰓是軟體動(dòng)物免疫防御的第一道防線，與外界廣泛接觸，對(duì)環(huán)境中的有害物質(zhì)起到一定過濾和抵御作用[39]，PfCLEC17A在合浦珠母貝的肝胰腺和腮中的相對(duì)表達(dá)量都很高，可能在機(jī)體抵御外界病原微生物入侵過程中發(fā)揮重要作用。

在溶藻弧菌刺激下，合浦珠母貝PfCLEC17A基因在肝胰腺中的表達(dá)量迅速升高，這與魁蚶Sb-Lec1基因[40]和文蛤Mm-CTL基因[41]的表達(dá)模式相同，說明C型凝集素基因的表達(dá)受微生物的誘導(dǎo)，合浦珠母貝PfCLEC17A基因參與機(jī)體的前期免疫應(yīng)答。但是，PfCLEC17A基因在接收病原菌刺激后如何將信號(hào)傳遞給下游分子并改變基因表達(dá)，這方面的工作還需進(jìn)一步研究。本研究初步對(duì)PfCLEC17A基因功能進(jìn)行了探索，為后續(xù)深入了解凝集素在合浦珠母貝免疫防御系統(tǒng)中的作用奠定基礎(chǔ)。

本研究通過RACE技術(shù)獲得了PfCLEC17A基因的全長(zhǎng)序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)該基因在不同組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，該基因在肝胰腺中表達(dá)量較高。進(jìn)一步檢測(cè)溶藻弧菌刺激后合浦珠母貝肝胰腺中PfCLEC17A基因在不同時(shí)間段的變化情況，發(fā)現(xiàn)其在弧菌感染后表達(dá)量迅速上升并達(dá)顯著水平，以上結(jié)果表明，該基因分布廣泛，并在宿主和病原體相互作用的前期發(fā)揮重要作用。