普通白菜CYP同源基因克隆與表達(dá)分析

侯瑞澤，侯玉翔，許小勇,李 璿，李梅蘭

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801)

普通白菜(Brassicarapassp.chinensisMakino)又稱小白菜，屬于十字花科蕓薹屬，具有味道優(yōu)美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、物美價(jià)廉等特點(diǎn)，因而受到人們的廣泛關(guān)注，是我國(guó)重要的一種經(jīng)濟(jì)蔬菜[1-2]。植物開(kāi)花是高等植物生長(zhǎng)發(fā)育中的一個(gè)重要過(guò)程，意味著植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L(zhǎng)[3]。這一過(guò)程受植物自身的遺傳因子、發(fā)育狀態(tài)、生理信號(hào)及外界環(huán)境因素的精確調(diào)控，是植物響應(yīng)多種內(nèi)在及外界環(huán)境的信號(hào)并整合的結(jié)果。正是這種內(nèi)外因子協(xié)同調(diào)控的方式，能確保植物在最適合的時(shí)間開(kāi)花，為后續(xù)植物生殖生長(zhǎng)創(chuàng)造了良好的發(fā)育條件[4]。近年來(lái)有大量研究結(jié)果表明，植物有6條主要的開(kāi)花調(diào)控路徑，包括光周期途徑[5]、春化途徑[6]、環(huán)境溫度途徑[7]、赤霉素途徑[8]、自主途徑[9]、年齡途徑[10]。植物激素是植物體內(nèi)重要的活性信號(hào)分子，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育及細(xì)胞分化的調(diào)控過(guò)程。傳統(tǒng)的開(kāi)花素學(xué)說(shuō)認(rèn)為，成花素和赤霉素可作為開(kāi)花素調(diào)控植物的開(kāi)花過(guò)程，表明在成花過(guò)程中，植物激素的作用不可或缺。目前主要的5種植物激素中，生長(zhǎng)素對(duì)于成花作用也有著至關(guān)重要的作用[11-13]。正是內(nèi)外各方面因素的影響，交織形成了植物豐富且特殊的開(kāi)花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

根據(jù)生長(zhǎng)素代謝的相關(guān)報(bào)道[14-15]，生長(zhǎng)素的合成分為依賴色氨酸和非依賴色氨酸2種途徑，依賴性途徑又劃分為4條支路，其中，吲哚乙醛肟(IAOx)途徑是十字花科植物中最重要的一條途徑，在擬南芥中對(duì)吲哚-3-乙酸 (Indole-3-acetic acid，IAA)合成起到輔助作用，且IAOx是IAA和次生代謝物，包括吲哚族硫苷(Glucosinolates)、蕓薹葡糖硫苷(Glucobrassicin，GB)和植保素(Camalexin)的共同前體。且因在擬南芥中CYP79B蛋白是催化生長(zhǎng)素合成反應(yīng)中的主要酶，故該途徑又稱為CYP79B途徑。

CYP79B2酶是十字花科植物IAA合成過(guò)程中的重要物質(zhì)，其可通過(guò)催化生成IAOx進(jìn)入吲哚族硫苷和IAA代謝途徑。前人研究表明[16]，CYP79B2基因的過(guò)表達(dá)會(huì)使植物體內(nèi)IAA含量明顯提高，且參與色氨酸代謝的CYP79B2基因在1 μmol/L 2，4-D上生長(zhǎng)的擬南芥中被誘導(dǎo)表達(dá)，導(dǎo)致吲哚族硫苷積累量增加，說(shuō)明CYP79B2基因與IAA的代謝合成密切相關(guān)。目前，對(duì)于CYP79基因家族的研究多集中在硫代葡萄糖苷(簡(jiǎn)稱硫苷)、生氰糖苷類和腈類的生物合成關(guān)鍵酶的表達(dá)調(diào)控，其中硫苷通常被視為十字花科植物中具有抗病蟲(chóng)功能的重要次生代謝物。且有研究報(bào)道表明[17-18]，CYP基因家族在不同物種中的表達(dá)模式存在差異[19-20]，對(duì)于CYP79B2基因與IAA合成的分子機(jī)制也僅在擬南芥、大白菜等植物中得以研究。因此，可以將普通白菜作為研究對(duì)象，以IAA代謝的前體物吲哚乙醛肟為切入點(diǎn)，闡明CYP79B2基因與IAA的合成代謝模式，為十字花科植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控及其對(duì)開(kāi)花機(jī)理研究提供依據(jù)。

本試驗(yàn)以75#普通白菜為材料，通過(guò)RT-PCR方法克隆普通白菜擬南芥CYP79B2的同源基因，利用生物信息學(xué)方法對(duì)其序列及蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并通過(guò)熒光定量實(shí)時(shí)PCR對(duì)基因BrcCYP79B2-1不同組織器官和發(fā)育時(shí)期的表達(dá)進(jìn)行分析，旨在為后續(xù)對(duì)普通白菜的開(kāi)花調(diào)控及病蟲(chóng)防治機(jī)理研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為普通白菜品系75#，該品系在適宜環(huán)境下種子露白后，4 ℃低溫處理20 d即可完成春化，春化結(jié)束后移栽到穴盤中，并分別對(duì)移栽后0，10，15，16 d的植物組織莖尖進(jìn)行取樣，樣品分別標(biāo)記為V0、V10、V15、V16。取樣質(zhì)量為0.1 g，液氮速凍后于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取及cDNA第1鏈的合成

將移栽10 d的植物組織莖尖樣品在液氮中迅速研磨成粉末后，按照RNAprep Pure Plant Kit(TIANGEN，DP432)試劑盒提取RNA，并凍存于-80 ℃冰箱。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)(TaKaRa，RR037Q)試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成第1條cDNA，作為克隆基因所需要的模板。

1.3 BrcCYP79B2-1的基因克隆

利用大白菜數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//brassicadb.org)查找BrcCYP79B2-1的序列，用Primer 5.0在線軟件對(duì)基因設(shè)計(jì)克隆引物，序列為F：ATGAACACTCTTACC

TCAAACTCTTCG；R：CTACTTCACCGTCGGGTAAAGA。以1.2獲取的cDNA為模板，使用TaKaRa LA Taq?(TaKaRa：RR02MQ)試劑進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)體系為(共50 μL)：TaKaRa LATaq0.5 μL，LATaqBuffer Ⅱ(10×)5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)8 μL，正、反引物(10 μmol/L)以及cDNA模板各1 μL，無(wú)菌水33.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃終延伸5 min，4 ℃保存。用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物，確認(rèn)條帶大小正確且無(wú)雜帶后進(jìn)行膠回收。

將膠回收的DNA產(chǎn)物用pUCm-T Vector PCR Products Cloning Kit(Sangon Biotech，B522213)在PCR儀中與T-載體連接12 h。后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α Competent Cells中，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR，送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)分析

使用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序序列翻譯成氨基酸，以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)，進(jìn)行氨基酸序列多重比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。然后采用在線工具Protparam分析氨基酸的理化性質(zhì)。

1.5 基因的表達(dá)分析

為了更清楚地了解BrcCYP79B2-1的功能，將普通白菜75#品系的根、莖、葉、花蕾和果莢進(jìn)行取樣，用qRT-PCR的方法研究基因在不同器官中的表達(dá)情況。BrcCYP79B2-1的特異性引物序列為F：CTCCGTGAAGCTTTCCGTCT；R：AACTTTTGGGTTACGGCCCA。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因BrcCYP79B2-1的克隆和序列分析

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，目的條帶大小與實(shí)際大小一致(圖1)，可進(jìn)行后續(xù)的測(cè)序，由測(cè)序結(jié)果可知，BrcCYP79B2-1片段大小為1 623 bp。

M.DNA Marker；1—3.BrcCYP79B2-1。

使用DNAMAN軟件對(duì)BrcCYP79B2-1進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯，結(jié)果表明，BrcCYP79B2-1共編碼540個(gè)氨基酸(圖2)。

圖2 BrcCYP79B2-1基因及氨基酸序列Fig.2 Gene and amino acid sequence of BrcCYP79B2-1

對(duì)BrcCYP79B2-1編碼蛋白質(zhì)的理化分析結(jié)果表明，推測(cè)分子質(zhì)量為60.849 73 ku，其理論等電點(diǎn)為8.71，脂肪指數(shù)為86.33，親水性的平均值是-0.174；帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)是58，帶正電荷的殘基總數(shù)為64，不穩(wěn)定性指數(shù)(Ⅱ)為35.30，此蛋白質(zhì)分類也是穩(wěn)定的。

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 氨基酸多重序列比對(duì) 利用DNAMAN軟件對(duì)BrcCYP79B2-1基因的氨基酸序列同相近的物種進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果表明，克隆基因BrcCYP79B2-1氨基酸序列同大白菜(Brassicapekinensis)、甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)、甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar.capitata)、蕪菁(Brassicarapa)、花椰菜(Brassicaoleraceavar.botrytis)、蘿卜(Raphanussativus)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)具有較高的同源性，同源性分別達(dá)到98.70%，98.89%，98.52%，99.52%，98.33%，96.85%，93.16%(圖3)。

圖3 BrcCYP79B2-1的氨基酸序列多重比對(duì)結(jié)果Fig.3 Multiple alignment results of the amino acid sequence of BrcCYP79B2-1

2.2.2 蛋白質(zhì)親緣關(guān)系分析 為了進(jìn)一步了解BrcCYP79B2-1編碼蛋白與其同源蛋白在不同植物之間的進(jìn)化關(guān)系，使用DNAMAN軟件構(gòu)建這2個(gè)蛋白在不同植物物種間的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明，與BrcCYP79B2-1編碼蛋白親緣關(guān)系最近的是甘藍(lán)型油菜同源蛋白，并且同大白菜、花椰菜和蕪菁屬于一個(gè)小分支；與蘿卜和擬南芥親緣關(guān)系較近，與茶花(Camelliasinensis)、胡楊(Populuseuphratica)、黃麻(Corchoruscapsularis)等植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖4)。

圖4 BrcCYP79B2-1同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of BrcCYP79B2-1 homologous protein

2.2.3 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果 使用SOPMA預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示(圖5)，BrcCYP79B2-1編碼蛋白的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)是α-螺旋(47.41%)和無(wú)規(guī)則卷曲(37.04%)。使用Swissmodel預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖6所示，其三級(jí)結(jié)構(gòu)模型與二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果吻合。

圖5 BrcCYP79B2-1蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Protein secondary structure of BrcCYP79B2-1

圖6 BrcCYP79B2-1蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 Protein tertiary structure prediction of BrcCYP79B2-1

2.3 基因表達(dá)分析結(jié)果

為了了解BrcCYP79B2-1在普通白菜不同器官與不同生育期中的表達(dá)情況，使用qRT-PCR的方法對(duì)其進(jìn)行定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖7)，BrcCYP79B2-1基因在植物花蕾中的表達(dá)量最低，在莖中的表達(dá)量較低，在葉片中的表達(dá)量較高，而在根中的表達(dá)量最高。

不同小寫字母代表相對(duì)表達(dá)量在0.05水平上差異顯著。Different lowercase letters represent significant differences in relative expression at the 0.05 level.

從圖8可以看出，經(jīng)過(guò)低溫處理后，莖尖部位該基因的表達(dá)量都表現(xiàn)出先急劇上升，在移栽10 d后達(dá)到頂峰，而后逐漸下降，移栽15 d后處于相對(duì)較低的表達(dá)水平，有利于促進(jìn)花芽分化。

圖8 BrcCYP79B2-1在不同發(fā)育時(shí)期莖尖部位的表達(dá)Fig.8 Expression of BrcCYP79B2-1 in shoot apex at different developmental

3 結(jié)論與討論

CYP79B(IAOx)途徑又稱吲哚乙醛肟途徑，是十字花科植物合成生長(zhǎng)素的重要途徑[21]。吲哚-3-乙酸是十字花科植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要激素，而CYP79B2/B3基因催化生成的吲哚乙醛肟(IAOx)是這2條代謝途徑的前體物質(zhì)[22-23]。有研究表明[24-25]，CYP79B2基因的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)IAA含量升高，而IAA含量的增加也會(huì)形成反饋，使得CYP79B2表達(dá)水平提高。且CYP79B2表達(dá)受病原體感染和機(jī)械損傷誘導(dǎo)，在根、葉和花中表達(dá)最高。本試驗(yàn)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量研究在普通白菜不同器官中的表達(dá)情況，這個(gè)基因在根和葉中表達(dá)量較高，這與前人的研究結(jié)果相符[26]。而根據(jù)在菘藍(lán)中克隆到的基因IiCYP79B2的表達(dá)分析表明[27]，其在不同組織中的表達(dá)量由高到低依次為葉>莖>果>花>根，這也說(shuō)明CYP79B2基因在不同物種的表達(dá)存在明顯差異。另有研究表明[28]，CYP79B2/B3的表達(dá)主要集中在頂端分生組織、下胚軸、子葉葉脈、真葉葉脈、根和根尖，而這些都是生長(zhǎng)素的主要合成和運(yùn)輸部位，這也證實(shí)了其在十字花科植物生長(zhǎng)素合成過(guò)程中的作用；研究還認(rèn)為，CYP79B2/B3的表達(dá)可能與MYB轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)，但還需進(jìn)行進(jìn)一步研究。

BrcCYP及其同源基因在花發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用，普通白菜BrcCYP的同源基因所編碼的蛋白與十字花科蔬菜，如大白菜和蘿卜等具有較高的同源性，也進(jìn)一步說(shuō)明了十字花科蔬菜間較近的親緣關(guān)系。且近年來(lái)，越來(lái)越多的資料表明[29-31]，生長(zhǎng)素對(duì)植物開(kāi)花有著重要影響，如王小權(quán)等[32]研究認(rèn)為，其內(nèi)源因子與花序發(fā)育的內(nèi)源因子有關(guān)。徐振朋等[33]研究認(rèn)為，生長(zhǎng)素與其他激素的平衡對(duì)于成花有著重要的調(diào)控作用。鄧全恩[34]研究認(rèn)為，生長(zhǎng)素可以調(diào)控油菜花的花期、開(kāi)花樣式和花粉活力，并使花芽?jī)?nèi)部碳水化合物含量、激素含量、基因表達(dá)呈現(xiàn)與花器官發(fā)育進(jìn)程一致的改變。這些都說(shuō)明，生長(zhǎng)素在成花過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。而不同低溫時(shí)間處理下，BrcCYP79B2-1的表達(dá)量有所不同，且有峰值，其表達(dá)對(duì)于低溫的響應(yīng)，也將BrcCYP79B2-1的作用與植物開(kāi)花調(diào)控關(guān)聯(lián)起來(lái)，為植物開(kāi)花機(jī)制研究提供思路，也為后續(xù)功能驗(yàn)證提供理論基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)通過(guò)研究CYP79B2同源基因BrcCYP79B2-1的表達(dá)模式及其生物學(xué)信息分析，結(jié)果顯示，該基因的表達(dá)與低溫春化有關(guān)，可以影響花芽分化。這對(duì)于研究十字花科植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控機(jī)制具有重要意義。本研究以RT-PCR的方法從普通白菜中克隆到CYP79B2同源基因BrcCYP79B2-1，并通過(guò)與其他物種的同源蛋白進(jìn)行序列多重比對(duì)和親緣關(guān)系分析，結(jié)果表明，克隆到的基因BrcCYP79B2-1的確是普通白菜中的CYP79B2同源基因。采用qRT-PCR的方法對(duì)普通白菜不同器官和時(shí)期BrcCYP79B2-1的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BrcCYP79B2-1在根中的表達(dá)量最高，葉中次之，而在花蕾中的表達(dá)量最低，在低溫處理10 d表達(dá)量最高。本試驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)研究十字花科植物開(kāi)花機(jī)制的研究奠定了一定理論基礎(chǔ)。