石斛合劑對(duì)糖尿病大鼠糖脂代謝及其相關(guān)通路的影響

林心君，胡海霞，何昱霖，秦崇濤 ，施 紅*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122）

糖尿病已成為全球廣泛關(guān)注的公共健康問(wèn)題，截至2019 年，全球糖尿病患者人數(shù)已達(dá)4.63 億，據(jù)估算，到2045 年糖尿病患病率將上升至12.2%，其中2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）約占所有糖尿病病例的90%［1］。糖尿病是以高血糖為主要特征的代謝性疾病，與中醫(yī)“消渴”“脾癉”等病證相類［2］。本課題組經(jīng)過(guò)多年臨床-基礎(chǔ)的反復(fù)實(shí)踐，探索形成的中藥復(fù)方石斛合劑（石斛合劑1 號(hào)方和石斛合劑2 號(hào)方）已獲國(guó)家發(fā)明專利（專利號(hào)：ZL201110408411.0），是福建省第二人民醫(yī)院院內(nèi)制劑（批準(zhǔn)文號(hào)：閩藥制字Z 20120006）。課題組前期研究顯示：石斛合劑能明顯緩解糖尿病患者口干、乏力、燥熱等癥狀，具有穩(wěn)定的降糖調(diào)脂、改善肝功能等作用，還能改善糖尿病模型大鼠的糖脂代謝，促進(jìn)胰島細(xì)胞增殖和胰島素受體表達(dá)，抑制肝臟和腎臟纖維化［3-6］。糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，并發(fā)癥更是累及機(jī)體多器官、多系統(tǒng)，用相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記（iTRAQ）技術(shù)篩選糖尿病差異蛋白已成為糖尿病診療研究的新熱點(diǎn)之一［7］。故課題組應(yīng)用石斛合劑治療糖尿病大鼠，提取大鼠肝組織蛋白，以iTRAQ 技術(shù)鑒定并分析各組大鼠的差異蛋白質(zhì)，繼而進(jìn)行代謝通路富集分析，探討石斛合劑對(duì)糖尿病大鼠糖脂代謝相關(guān)通路的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí) Wistar 大鼠 40 只，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，單籠5 只飼養(yǎng)，自由取食和飲水，12 h 光照/12 h 黑暗，室溫 25 ℃，相對(duì)濕度60%～70%?；A(chǔ)飼料由動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，高脂飼料配方為60.7%基礎(chǔ)飼料、15%蔗糖、10%豬油、10%蛋黃粉、4%膽固醇和0.3%膽酸鹽。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 石斛合劑1 號(hào)方（黃芪20 g，石斛15 g，知母10 g，葛根 15 g，五味子 8 g，生地黃 15 g，丹參15 g，黃連6 g，地龍9 g）、石斛合劑 2 號(hào)方（茵陳18 g，滑石 15 g，扁蓄15 g，梔子10 g，車前子10 g，大黃3 g）購(gòu)自福建中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂，用水分別浸泡上述 2 方藥材 30 min，然后采用水提醇沉法［5］制備成含生藥量2 g/mL 的藥液，將藥液按每瓶100 mL分裝，密封保存在-20 ℃冰箱，待用時(shí)水浴加熱。二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：1302094）用蒸餾水稀釋至含藥量5 g/L，每瓶100 mL 分裝。

1.3 主要試劑與儀器 鏈脲佐菌素（STZ，美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)：WXBB2432）；質(zhì)譜級(jí)胰蛋白酶Trypsin（美國(guó) Thermo Scientific 公司，貨號(hào)：90057）；iTRAQ試劑（美國(guó)SCIEX 公司，貨號(hào)：4381664）；Triple TOF 5600 質(zhì)譜儀器（美國(guó)SCIEX 公司，型號(hào)：AB SCIEX，Concord，ON）；納升液相色譜儀（日本島津公司，型號(hào)：LC-20AD）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模、干預(yù)和取材 40 只Wistar 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，隨機(jī)抽取10 只大鼠作為正常組，予普通飼料喂養(yǎng)；剩余30 只為造模組，予高脂高糖飼料喂養(yǎng) 6 周后，腹腔注射 STZ（每次 25 mg/kg，連續(xù) 2 次，時(shí)間間隔3 d）加以誘導(dǎo)［8］。第2 次腹腔注射STZ 72 h 后尾靜脈采血，用快速血糖儀檢測(cè)血糖，以隨機(jī)血糖＞16.7 mmol/L 判定造模成功（本研究中造模組大鼠全部成模）。造模組按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、石斛合劑組、二甲雙胍組，每組10 只。石斛合劑組先以石斛合劑 1 號(hào)方按 8.6 mL/（kg·d）灌胃7 d，繼以石斛合劑2 號(hào)方按6.2 mL/（kg·d）灌胃3 d，如此循環(huán)灌胃60 d；二甲雙胍組以二甲雙胍溶液10 mL/（kg·d）灌胃，藥物劑量均按 60 kg 成人臨床等效劑量進(jìn)行干預(yù)；模型組、正常組按10 mL/（kg·d）生理鹽水灌胃，連續(xù)60 d。

2.2 血糖血脂檢測(cè) 灌胃結(jié)束，禁食12 h，腹腔注射10%烏拉坦麻醉，迅速開(kāi)腹，抽取各組大鼠腹主動(dòng)脈血，采用全自動(dòng)生化儀分析空腹血糖（FBG）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）。斷頭處死大鼠后每組隨機(jī)取3 只大鼠肝組織置于液氮中儲(chǔ)存以行蛋白組學(xué)檢測(cè)。

2.3 肝組織差異蛋白質(zhì)代謝通路富集分析 ①?gòu)母谓M織提取蛋白，對(duì)提取后的蛋白進(jìn)行還原烷基化處理，打開(kāi)二硫鍵以便后續(xù)步驟充分酶解蛋白。② 取出上述蛋白100 μg，按蛋白∶酶＝20∶1 加入胰蛋白酶Trypsin 酶解。③Bradford 法計(jì)算出蛋白濃度。④按照iTRAQ 試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用iTRAQ 技術(shù)標(biāo)記每一組肽段，室溫培養(yǎng)2 h；將標(biāo)記后的肽段進(jìn)行等量混合，混合后的肽段使用強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜進(jìn)行預(yù)分離；最后進(jìn)行液相串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析［9］。⑤ 選擇數(shù)據(jù)庫(kù) IPI（International Protein Index）Rat（39925 sequences）［10］，用蛋白質(zhì)鑒定軟件Mascot 2.3.02（檢索參數(shù)設(shè)置見(jiàn)表1）搜索數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)的肽段及蛋白質(zhì)鑒定；比較各蛋白在不同組間的相對(duì)含量，當(dāng)?shù)鞍棕S度差異倍數(shù)達(dá)到1.2 倍以上，且P＜0.05 時(shí)視為差異蛋白；通過(guò)富集分析確定差異蛋白質(zhì)參與的主要代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

表1 檢索參數(shù)設(shè)置

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料屬正態(tài)分布以（）表示，組間比較采用單因素方差分析（LSD 或Games-Howell）。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 4 組大鼠FBG、TC、TG 水平比較 見(jiàn)表2。

表2 4 組大鼠 FBG、TC、TG 水平比較（） mmol/L

表2 4 組大鼠 FBG、TC、TG 水平比較（） mmol/L

注：與正常組比較，1）P＜0.01，2）P＜0.05；與模型組比較，3）P＜0.01，4）P＜0.05。

TG 0.64±0.10 0.91±0.282）0.69±0.114）0.82±0.08組別正常組模型組石斛合劑組二甲雙胍組n 10 10 10 10 FBG 5.43±0.46 16.89±1.291）6.99±1.073）6.38±0.913）TC 1.75±0.09 2.05±0.212）1.82±0.104）1.75±0.114）

3.2 肝組織差異蛋白代謝通路富集分析結(jié)果 肝組織蛋白共鑒定出iTRAQ 標(biāo)記的肽段所代表的蛋白3 631 個(gè)，其中石斛合劑組/模型組的肝組織差異蛋白為352 種［9］；按差異蛋白在信號(hào)通路中的貢獻(xiàn)度（即該差異蛋白占該信號(hào)通路總蛋白數(shù)的百分比）從高到低排序，石斛合劑組/模型組肝組織差異蛋白代謝通路富集分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 石斛合劑組/模型組的肝組織差異蛋白代謝通路富集分析（n，%）

4 討 論

4.1 石斛合劑對(duì)糖尿病模型大鼠糖脂代謝的影響 本研究采用高糖高脂飼料加STZ 注射誘發(fā)的動(dòng)物模型，接近人類T2DM 的發(fā)病過(guò)程［8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：模型組大鼠FBG 顯著高于正常組，且在實(shí)驗(yàn)期間FBG 均＞11.1 mmol/L，說(shuō)明模型穩(wěn)定性好；治療后石斛合劑組、二甲雙胍組FBG 均明顯降低，說(shuō)明石斛合劑有確切的降血糖作用；與正常組比較，模型組TC、TG 有顯著上升，說(shuō)明模型大鼠存在脂代謝紊亂，高脂血癥是產(chǎn)生胰島素抵抗（insulin resistance，IR）、炎癥反應(yīng)等代謝障礙的關(guān)鍵因素［11-12］；石斛合劑治療后TC、TG 相較模型組下降顯著，說(shuō)明石斛合劑能糾正糖尿病模型大鼠血脂代謝紊亂；二甲雙胍組TC 也有顯著下降，而TG 雖有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上，石斛合劑能改善糖尿病大鼠的糖脂代謝，減少糖脂毒性的損傷，這與課題組前期研究結(jié)果一致。

4.2 肝組織差異蛋白代謝通路分析 在肝臟糖異生與糖酵解共同作用，使機(jī)體葡萄糖維持在一定的濃度，若糖異生過(guò)度可引起機(jī)體血糖升高。IR 已成為 T2DM 的主要病理標(biāo)志［13-14］，而炎癥與 IR 關(guān)系密切，近年來(lái)炎癥學(xué)說(shuō)在T2DM 發(fā)病機(jī)制的研究中備受關(guān)注。作為核轉(zhuǎn)錄因子之一的核因子κB（NF-κB）可被高血糖激活，通過(guò)多種途徑導(dǎo)致細(xì)胞和組織炎癥，不僅干擾胰島素分泌，還能通過(guò)抑制胰島素信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子導(dǎo)致IR 的發(fā)生［15］。本研究結(jié)果顯示石斛合劑組/模型組的肝組織差異蛋白涉及糖異生/糖酵解通路、胰島素信號(hào)通路、NF-κB通路，故石斛合劑可能通過(guò)上述多條信號(hào)通路改善糖尿病大鼠的糖脂代謝。

生糖氨基酸可通過(guò)糖異生轉(zhuǎn)化成葡萄糖，其代謝異常會(huì)導(dǎo)致機(jī)體糖異生異常［16］。研究發(fā)現(xiàn)在亮氨酸缺乏條件下，肝臟胰島素的靈敏度增高［17］；而當(dāng)異亮氨酸和纈氨酸缺乏時(shí)，小鼠出現(xiàn)脂肪組織產(chǎn)熱以及分解增加，而出現(xiàn)消瘦［18］。提示亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸信號(hào)通路障礙可導(dǎo)致糖異生失常［19］。此外精氨酸、脯氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸代謝異常等均可誘發(fā)或加重糖尿病，其中甘氨酸的降低與游離脂肪酸（FFA）的增加有關(guān)，并與T2DM 的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，色氨酸在糖尿病患者的血漿中升高，與T2DM 發(fā)病率呈顯著的正相關(guān)［20-21］。本研究結(jié)果顯示石斛合劑可能通過(guò)上述氨基酸信號(hào)通路調(diào)節(jié)糖異生，改善糖脂代謝。

糖尿病脂毒性學(xué)說(shuō)認(rèn)為：異常的脂代謝可造成胰島素敏感組織（肝臟、脂肪和骨骼肌）中異常的脂沉積并導(dǎo)致IR。脂肪細(xì)胞分泌的多種炎癥因子可引起β 細(xì)胞凋亡和 IR，誘發(fā)或加重T2DM［22］。有研究表明飽和脂肪酸與DM 患病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)［23］。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）包括α、β、γ 3 種表型，其中PPARα 是調(diào)控脂肪細(xì)胞分化的重要因子，而PPARγ 除了能調(diào)節(jié)脂代謝，還有抗肝纖維化的作用［24］。本研究結(jié)果顯示石斛合劑可能通過(guò)脂肪酸代謝通路和PPAR 通路調(diào)節(jié)糖尿病大鼠的脂代謝。

糖代謝產(chǎn)生的碳骨架、蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的氨基酸以及甘油都可進(jìn)入三羧酸循環(huán)（TCA）氧化，因此TCA 是糖類、脂肪和蛋白質(zhì)代謝的共同通路。這三大物質(zhì)都可轉(zhuǎn)化成丙酮酸，并通過(guò)中間產(chǎn)物乙酰輔酶A 進(jìn)入三羧酸循環(huán)，釋放出大量的ATP 為機(jī)體各項(xiàng)生理過(guò)程供能。與能量代謝有關(guān)的檸檬酸是TCA 的起始步驟，檸檬酸信號(hào)通路傳導(dǎo)異常直接導(dǎo)致TCA 出現(xiàn)異常。氧化磷酸化是合成ATP 的主要途徑，該信號(hào)通路傳導(dǎo)異常則誘發(fā)線粒體損傷及細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示石斛合劑可能通過(guò)淀粉與蔗糖的代謝、檸檬酸代謝、丙酮酸代謝和氧化磷酸化通路調(diào)節(jié)糖尿病大鼠的糖脂代謝。

本研究中差異蛋白所涉及的多條信號(hào)通路都與糖尿病糖脂代謝紊亂相關(guān)，這為石斛合劑防治糖尿病及其并發(fā)癥的研究提供了新的思路和方法。