巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶II對(duì)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及機(jī)制

王若妍，胡銘倩，瞿聞馨，范賽榮

溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院（生命科學(xué)學(xué)院），浙江 溫州 325035

前列腺癌的發(fā)病率在男性所有惡性腫瘤中高居第二，2020年全球約有141多萬人新患前列腺癌，約有37.5萬人因前列腺癌而喪生[1-2]。據(jù)我國2020年對(duì)前列腺癌的專項(xiàng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，2017年我國男性前列腺癌新增患者數(shù)、死亡人數(shù)、發(fā)病率及病死率均大幅增加[3]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中往往伴隨著異常的糖基化修飾，直接影響著腫瘤細(xì)胞的生長、黏附、轉(zhuǎn)移、規(guī)避免疫監(jiān)視等[4-6]，已逐漸被認(rèn)為是腫瘤的又一新特征[7]。巖藻糖基化是與癌癥最密切相關(guān)的糖基化修飾之一，由巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（fucosyltransferase, FUT）催化介導(dǎo)[8-9]。研究表明，F(xiàn)UT在多種腫瘤中存在異常表達(dá)，如乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胰腺癌等，且與腫瘤的分期、預(yù)后等具有一定的相關(guān)性[10-11]。研究表明FUT2在肺腺癌中異常表達(dá)，且參與了肺腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)控[12]，但FUT2與前列腺癌的相關(guān)性未見相關(guān)報(bào)道。為此我們以FUT2為研究對(duì)象，探討FUT2對(duì)前列腺癌生物學(xué)功能的影響，為前列腺癌的早期診斷及分子靶向治療提供潛在的靶標(biāo)和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 臨床前列腺癌組織芯片購自西安百思達(dá)生物科技有限公司。前列腺癌PC-3細(xì)胞株購自上海細(xì)胞生物所。FUT2低表達(dá)載體psi-U6.1/eGFP/Puro-FUT2、空載載體psi-U6.1/eGFP/Puro-NC均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建；胎牛血清FBS購自美國Hyclone公司；DMEM培養(yǎng)基、F-12培養(yǎng)基、PBS均購自美國Gibco公司；β-catenin抗體購自美國Santa Cruz公司；ICAM-1抗體、Cyclin D1抗體、FUT2抗體、β-actin抗體、Tubulin抗體、GAPDH抗體購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)：將組織芯片烤至石蠟融化后脫蠟、復(fù)水、洗滌，加適量枸櫞酸鈉緩沖液，加熱至沸騰，中高火8 min而后冷卻，反復(fù)3次后自然冷卻，PBS洗滌，3% H2O2孵育后洗滌，之后5% BSA封閉，孵育一抗，4 ℃過夜。孵育二抗，37 ℃恒溫箱孵育1 h，DAB顯色，蘇木素復(fù)染并沖洗，乙醇脫水，透明后封片。

1.2.2 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染構(gòu)建FUT2低表達(dá)的細(xì)胞株和空載細(xì)胞株：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將FUT2的兩種不同序列的RNA干擾質(zhì)粒、無義對(duì)照質(zhì)粒依托脂質(zhì)體載體轉(zhuǎn)入PC-3細(xì)胞；篩出陽性的單克隆細(xì)胞團(tuán)，構(gòu)建穩(wěn)定傳代的FUT2低表達(dá)細(xì)胞株和空載細(xì)胞株。

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn)：胰酶消化對(duì)數(shù)期細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以5 000個(gè)細(xì)胞/孔接種至96孔板，加入帶有MTT試劑的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后檢測吸光度。同樣方法分別檢測培養(yǎng)48 h和72 h后的細(xì)胞，最后將數(shù)據(jù)整理分析。

1.2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)：取生長對(duì)數(shù)期的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸液稀釋，以3 000個(gè)細(xì)胞/孔接種12孔板，培養(yǎng)10 d。出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，用結(jié)晶紫染液染色后相機(jī)拍照。

1.2.5 Transwell小室實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整懸液濃度，吸取200 μL至Transwell小室上室，下室加入600 μL含有20% FBS的培養(yǎng)基，輕輕搖晃放置培養(yǎng)箱中48 h拿出，將小室甲醛固定后染色，用ddH2O清洗后顯微鏡下拍照觀察。

1.2.6 Transwell基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)：Matrigel基質(zhì)膠與培養(yǎng)液按1∶9比例混合后向每個(gè)小室的上室加入40 μL置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，12 h后將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整懸液濃度，吸取200 μL至提前加入Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室上室，下室加入600 μL含有20% FBS的培養(yǎng)基，輕輕搖晃放置培養(yǎng)箱中48 h拿出，將小室甲醛固定后染色，用ddH2O清洗后顯微鏡下拍照觀察。

1.2.7 Western blot實(shí)驗(yàn)：提取細(xì)胞總蛋白并測定蛋白濃度，配置濃度為10%的分離膠和濃度為5%的濃縮膠，上樣，進(jìn)行穩(wěn)壓電泳分離待測蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，1×TBST洗滌3遍后根據(jù)目的蛋白分子量切目的條帶及內(nèi)參，一抗4 ℃搖床孵育過夜，孵育結(jié)束，1×TBST進(jìn)行洗滌，采用二抗室溫孵育1 h，1×TBST洗滌后曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料用±s表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FUT2在前列腺癌組織中的表達(dá)情況 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表明：FUT2在前列腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于其在正常前列腺組織中的表達(dá)水平（P＜0.05），見圖1。

圖1 FUT2在前列腺癌組織中的表達(dá)情況（免疫組化染色，×200）

2.2 FUT2低表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的鑒定 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染構(gòu)建FUT2低表達(dá)的細(xì)胞株和空載細(xì)胞株，Western blot檢測FUT2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，與空載對(duì)照（NC）組比，干擾FUT2表達(dá)后，PC-3細(xì)胞中的FUT2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2，表明FUT2低表達(dá)的前列腺癌PC-3細(xì)胞株構(gòu)建成功。

圖2 FUT2低表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的鑒定

2.3 FUT2對(duì)前列腺癌細(xì)胞克隆增殖的影響 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空載對(duì)照（NC）組相比，F(xiàn)UT2低表達(dá)的前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖能力顯著降低（P＜0.05）。平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組相比，F(xiàn)UT2低表組細(xì)胞的單克隆團(tuán)數(shù)量明顯減少（P＜0.05），表明干擾FUT2的表達(dá)能抑制PC-3細(xì)胞的單克隆形成能力。見圖3。

圖3 FUT2對(duì)前列腺癌細(xì)胞克隆增殖能力的影響

2.4 FUT2對(duì)前列腺癌細(xì)胞遷移的影響 Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與NC組比，F(xiàn)UT2低表達(dá)組（shFUT2#1和shFUT2#2）遷移至下室的細(xì)胞數(shù)目明顯減少（P＜0.05），見圖4。

圖4 FUT2對(duì)PC-3細(xì)胞遷移能力的影響（×100）

2.5 FUT2對(duì)前列腺癌細(xì)胞侵襲的影響 Transwell基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)表明，與NC組比，F(xiàn)UT2低表達(dá)組（shFUT2#1、shFUT2#2）細(xì)胞數(shù)目顯著減少（P＜0.05），提示下調(diào)FUT2的表達(dá)能抑制人前列腺癌細(xì)胞的侵襲能力，見圖5。

圖5 FUT2對(duì)PC-3細(xì)胞侵襲能力的影響（×100）

2.6 FUT2對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵分子β-catenin和Cyclin D1表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，與NC組相比，F(xiàn)UT2低表達(dá)組中β-catenin蛋白的表達(dá)水平并無明顯變化，但是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游關(guān)鍵信號(hào)分子Cyclin D1的表達(dá)水平在FUT2低表達(dá)組顯著降低（P＜0.05），見圖6，提示FUT2可能參與了Wnt/β-catenin信號(hào)的傳導(dǎo)。

圖6 FUT2對(duì)β-catenin和Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響

2.7 FUT2對(duì)ICAM-1蛋白的表達(dá)影響 ICAM-1是一種黏附分子，可以作為受體分子介導(dǎo)細(xì)胞的黏附，同時(shí)也具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體的功能。Western blot結(jié)果表明，F(xiàn)UT2低表達(dá)組（shFUT2#1、shFUT2#2）中ICAM-1的表達(dá)量顯著高于NC組（P＜0.05），見圖7，提示干擾FUT2能促進(jìn)ICAM-1的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的黏附能力。

圖7 FUT2對(duì)ICAM-1蛋白表達(dá)的影響

3 討論

糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾最為常見的一種修飾方式，通過糖基化修飾賦予了蛋白質(zhì)更為多樣的結(jié)構(gòu)及功能，以執(zhí)行細(xì)胞內(nèi)的各種復(fù)雜多樣的生命活動(dòng)。許多細(xì)胞膜表面受體及轉(zhuǎn)錄因子都存在糖基化修飾位點(diǎn)，影響蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮。蛋白質(zhì)的異常糖基化現(xiàn)象在腫瘤中較為常見，在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌中均有發(fā)現(xiàn)由糖基轉(zhuǎn)移酶異常表達(dá)而催化產(chǎn)生的異常糖基化現(xiàn)象[14]。FUT作為介導(dǎo)巖藻糖基化修飾的關(guān)鍵酶，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中往往存在異常的表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13，15]。

基于前列腺癌組織芯片的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)FUT2在前列腺癌與正常前列腺組織中的表達(dá)量存在差異；通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將空載載體和低表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到前列腺癌PC-3細(xì)胞中，采用抗藥性篩選得到穩(wěn)定低表達(dá)的FUT2前列腺癌細(xì)胞株，一系列生物學(xué)功能研究表明，F(xiàn)UT2能促進(jìn)前列腺細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，進(jìn)而影響前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路與器官形成、組織再生等有關(guān)，越來越多的研究報(bào)道證實(shí)，在腫瘤中經(jīng)常出現(xiàn)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路被激活的現(xiàn)象，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在密切的聯(lián)系[16-17]。Cyclin D1是Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游的關(guān)鍵信號(hào)分子，其表達(dá)水平的升高往往提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路的活化。本研究結(jié)果表明干擾FUT2的表達(dá)能顯著抑制Cyclin D1的表達(dá)水平，提示FUT2可能參與了Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)干擾FUT2的表達(dá)并不影響β-catenin的表達(dá)。作為Wnt/β-catenin信號(hào)的核心分子，β-catenin的磷酸化水平及其核漿分布將決定了該信號(hào)通路的活化狀態(tài)[18]。因此，F(xiàn)UT2是否參與了Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控有待進(jìn)一步深入探討。另一方面，Cyclin D1作為一種S期周期蛋白對(duì)細(xì)胞周期具有重要的調(diào)控作用[19]，這可能與下調(diào)FUT2表達(dá)能抑制PC-3細(xì)胞增殖相關(guān)。此外，F(xiàn)UT2對(duì)調(diào)黏附因子ICAM-1表達(dá)水平的調(diào)控作用，可能與前列腺癌細(xì)胞的遷移侵襲能力相關(guān)。

綜上所述，F(xiàn)UT2在前列腺癌組織中表達(dá)水平異常升高，干擾FUT2的表達(dá)能抑制前列腺細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)功能，表明FUT2在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有一定的調(diào)控作用，可能是前列腺癌診療潛在的靶標(biāo)，但相關(guān)的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入探討研究。