茯磚茶中冠突散囊菌的分離鑒定及富硒菌株篩選

劉 程梁靜一美王周利袁亞宏岳田利

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西楊陵 712100;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(楊凌),陜西楊陵 712100;3.西北大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,西安 710069)

茯磚茶屬于六大茶類(lèi)中的黑茶,它生產(chǎn)工藝復(fù)雜、品質(zhì)獨(dú)特[1],具有調(diào)節(jié)腸道菌群、降低血脂、抗氧化、消炎等功效[2]。冠突散囊菌(Eurotium cristatum)是茯磚茶在一定的溫度、濕度條件下,通過(guò)“發(fā)花”過(guò)程生長(zhǎng)得到的益生菌體[3],也被稱(chēng)為“金花菌”[4]。1990年,齊祖同等[5]對(duì)湖南茯磚茶中的“金花菌”進(jìn)行分離培養(yǎng),觀察到菌體表面具有冠狀突起,將其定義為冠突散囊菌。陳云蘭[6]將形態(tài)學(xué)鑒定與酯酶同工酶電泳相結(jié)合,分離鑒定多地茯磚茶中的“金花菌”,結(jié)果顯示它是由冠突散囊菌和謝瓦氏曲霉菌組成。由于散囊菌屬真菌存在很高的同源性,目前普遍接受的分類(lèi)為真菌門(mén)、子囊菌綱、真子囊菌亞綱、曲霉目、曲霉科、散子囊菌屬、冠突散囊菌,無(wú)性型為針刺曲霉[7]。

硒(Selenium)是哺乳動(dòng)物必需的微量營(yíng)養(yǎng)素,在自然界以有機(jī)和無(wú)機(jī)形式存在[8]。無(wú)機(jī)硒包括單質(zhì)硒、亞硒酸鹽和硒酸鹽等,具有較大的毒性。有機(jī)硒包括硒代氨基酸、硒蛋白、硒多糖等,研究已經(jīng)證實(shí),有機(jī)硒的毒性低且生物利用度高[9-10]。硒在生物體的能量代謝和基因表達(dá)中起著重要的作用[11],具有抗氧化、保護(hù)心血管、預(yù)防癌癥等功能[12-13],而硒攝入不足可能會(huì)引發(fā)克山病、甲狀腺腫等疾病。世界衛(wèi)生組織已確定飲食中硒的最佳攝入量為50μg/d,開(kāi)發(fā)低毒性和高生物利用度的硒補(bǔ)充劑尤為重要[14-16]。酵母、細(xì)菌、真菌等可以通過(guò)自身生理代謝實(shí)現(xiàn)無(wú)機(jī)硒到有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化[17],微生物富硒能力的大小可以通過(guò)生物量、硒形態(tài)等多種指標(biāo)判定[18]。利用生物對(duì)無(wú)機(jī)硒進(jìn)行轉(zhuǎn)化,是生產(chǎn)有機(jī)硒補(bǔ)充劑的一種安全有效的方法,已成為當(dāng)前重要的研究方向[19]。

本研究從陜西茯磚茶中分離冠突散囊菌,并利用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)對(duì)其進(jìn)行鑒定,根據(jù)微生物的富硒特性對(duì)冠突散囊菌富硒菌株進(jìn)行篩選,并對(duì)菌體硒形態(tài)進(jìn)行分析,旨在為冠突散囊菌的利用及硒補(bǔ)充劑的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

經(jīng)典1368茯茶(1 000 g)、手筑茯磚茶(1 000 g)、貢金茯茶(200 g)、貢福尊品(200 g)、茯茶柱(200 g)、吼秦腔(200 g),購(gòu)于咸陽(yáng)涇渭茯茶有限公司;涇茯源花開(kāi)月圓涇渭茯磚茶(1 000 g),購(gòu)于陜西涇陽(yáng)百富茯磚茶有限公司;涇陽(yáng)茯茶1368(450 g),購(gòu)于陜西古渡茯磚茶有限公司。所購(gòu)茯磚茶均金花茂盛、品質(zhì)優(yōu)良者。

1.2 主要試劑

葡萄糖、瓊脂、硝酸、高氯酸、鹽酸、過(guò)氧化氫、氫氧化鈉、戊二醛、磷酸銨、亞硒酸鈉等,購(gòu)自西安化學(xué)試劑廠,均為分析純。植物基因組DNA 提取試劑盒,購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。蛋白酶XIV、脂肪酶VII,購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。硒代蛋氨酸(Se Met)、硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒酸根(Se(IV))、亞硒酸根(Se(VI)),購(gòu)自中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

1.3 主要儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)(YT-CJ-2ND),北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司;恒溫培養(yǎng)箱(ZXSD-A1160),上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司;恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZWY-240),上海智城分析儀器制造有限公司;高速冷凍離心機(jī)(HC-3018R),安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;光學(xué)顯微鏡(Ni-U),日本尼康株式會(huì)社;掃描電子顯微鏡(S-3400N),日本株式會(huì)社日立制作所;PCR 儀(CFX CONNCT),美國(guó)Bio-Rad公司;電泳儀(JY600C),北京市六一儀器廠;凝膠成像儀(Gel Doc XR+),美國(guó)Bio-Rad公司;氫化物發(fā)生—原子熒光光譜儀(AFS-9300),江蘇艾塔科學(xué)儀器有限公司;液相色譜儀(ICS-600),賽默飛世爾科技公司;電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(NexION 2000),珀金埃爾默儀器有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 培養(yǎng)基制備 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基:取去皮馬鈴薯200 g,切片后置于1 000 m L蒸餾水中煮沸20 min,過(guò)濾后加入葡萄糖20 g、瓊脂20 g并再次煮沸,加蒸餾水定容至1 000 m L,121 ℃滅菌20 min。馬鈴薯葡萄糖(PDB)培養(yǎng)基:除不加入瓊脂外,其他步驟與PDA 培養(yǎng)基制備方法相同。

1.4.2 冠突散囊菌的分離純化 稱(chēng)取茯磚茶樣品25 g,粉碎后混懸于225 m L 無(wú)菌生理鹽水(0.85%),在28 ℃恒溫水浴箱中以200 r/min振蕩40 min,洗脫茶葉上附著的菌體[20]。將去除茶葉的洗脫液進(jìn)行梯度稀釋,取10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀釋液涂布PDA 培養(yǎng)基。置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng),適時(shí)對(duì)長(zhǎng)勢(shì)良好的菌落進(jìn)行劃線分離,將得到的純化菌株接種至PDA斜面培養(yǎng)基于4 ℃保存。

1.4.3 形態(tài)學(xué)特征觀察 將純化菌株接種于PDA 培養(yǎng)基,于28 ℃恒溫避光培養(yǎng)21 d,觀察菌落的生長(zhǎng)狀況并根據(jù)《中國(guó)真菌志》對(duì)其種屬進(jìn)行初步判斷[21]。培養(yǎng)5～7 d時(shí)通過(guò)顯微鏡與掃描電鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

顯微鏡觀察:通過(guò)直接制片與形態(tài)觀察相結(jié)合的方式進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察[22]。制備PDA 平板培養(yǎng)基時(shí),以45°斜插入4片無(wú)菌蓋玻片,接種后置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待菌絲延伸至蓋玻片上時(shí),用鑷子將蓋玻片夾出,蓋到滴有一滴無(wú)菌水的載玻片上,在顯微鏡下觀察。

掃描電鏡觀察:純化菌株在PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7 d,用無(wú)菌刀片切取5 mm×5 mm 且長(zhǎng)有菌落的培養(yǎng)基薄片,置于2.5%戊二醛常溫浸漬過(guò)夜。用0.1 mol/L PBS緩沖液(p H 7.2)浸洗3次,每次10 min。然后用30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇逐級(jí)脫水,每級(jí)脫水2 次,每次10 min[23]。脫水后的樣品通過(guò)超臨界CO2真空干燥,噴金后通過(guò)掃描電鏡觀察。

1.4.4 分子生物學(xué)鑒定 收集PDA 培養(yǎng)基上純化菌落的菌絲體,經(jīng)液氮研磨后利用植物基因組DNA 提取試劑盒提取DNA。采用真菌核糖體基因通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[18]。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系:上游、下游引物各1μL(5.65 nmo L,稀釋100倍),模板DNA 2μL,premixTaq10μL,加dd H2O 至20μL。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min,95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,34次循環(huán),72 ℃延伸10 min[24]。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),將條帶單一且明亮的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù),通過(guò)核酸BLAST 進(jìn)行比對(duì),對(duì)測(cè)序菌株進(jìn)行屬種歸類(lèi),篩選出冠突散囊菌。

1.4.5 孢子懸浮液制備 冠突散囊菌于PDA培養(yǎng)基活化3次,在28 ℃下恒溫培養(yǎng)5～7 d,用無(wú)菌生理鹽水將孢子洗脫至無(wú)菌離心管中,通過(guò)血球計(jì)數(shù)板調(diào)整孢子濃度為107cfu/m L 并于4 ℃保存。

1.4.6 生長(zhǎng)特性研究 以1%的接種量將孢子懸浮液接種于PDB 培養(yǎng)基中,于28 ℃、130 r/min振蕩培養(yǎng)10 d。每隔12 h取出3瓶培養(yǎng)液并收集菌絲體,于65 ℃烘干至恒質(zhì)量,即為菌體生物量[25]。繪制菌體生物量關(guān)于培養(yǎng)時(shí)間的曲線,即為冠突散囊菌在該條件下的生長(zhǎng)曲線。

1.4.7 耐硒菌株篩選 不同菌株對(duì)無(wú)機(jī)硒的耐受能力不同,在環(huán)境硒質(zhì)量濃度相同的情況下,根據(jù)菌體紅硒現(xiàn)象出現(xiàn)的程度,篩選耐硒能力強(qiáng)的菌株。配制硒質(zhì)量濃度為0、30、60、90、120 μg/m L的PDA 培養(yǎng)基,分別取32株冠突散囊菌孢子懸液100μL涂布于平板,每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置3個(gè)平行,于28 ℃下避光培養(yǎng)9 d,每天觀察菌落生長(zhǎng)狀況,篩選耐硒性能優(yōu)良的菌株。

1.4.8 富硒菌株篩選 配制硒質(zhì)量濃度為30 μg/m L的PDB培養(yǎng)基,以1%的接種量分別接種初篩得到的耐硒菌株的孢子懸液,于28 ℃、130 r/min振蕩培養(yǎng)7 d。加硒組和對(duì)照組均設(shè)置3個(gè)平行。通過(guò)測(cè)定菌體生物量、總硒含量篩選富硒能力強(qiáng)的菌株。

1.4.9 菌體生物量的測(cè)定 將培養(yǎng)7 d的冠突散囊菌培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中,在8 000 r/min離心10 min,棄去上清液,向沉淀中加入30 m L無(wú)菌水,震蕩清洗后再次離心,重復(fù)清洗3次。將菌體沉淀轉(zhuǎn)移至10 m L無(wú)菌離心管中,冷凍干燥24 h,稱(chēng)重得菌體生物量[26]。

1.4.10 菌體總硒含量的測(cè)定 通過(guò)氫化物發(fā)生原子熒光光譜法(HG-AFS)測(cè)定總硒含量[27]。

樣品消化:稱(chēng)取冠突散囊菌凍干菌體0.500 g于250 m L 錐形瓶中,依次加入9 m L 硝酸和1 m L高氯酸并充分混合。將錐形瓶置于200 ℃加熱板加熱,至混合物變?yōu)槌吻逋该鞑⒂邪谉煶霈F(xiàn)。待混合物冷卻后加入5 m L鹽酸(6 mol/L),混勻后繼續(xù)加熱,直到混合物再次澄清透明。冷卻后轉(zhuǎn)移至10 m L容量瓶中用蒸餾水定容。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:分別配制硒質(zhì)量濃度為0、10、20、30、40、50μg/L 的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液,充分混勻后測(cè)定其熒光強(qiáng)度。以硒質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

硒含量測(cè)定及計(jì)算:硒含量通過(guò)氫化物原子熒光儀測(cè)定,運(yùn)行條件如表1所示。對(duì)樣品和空白溶液進(jìn)行測(cè)定,與標(biāo)準(zhǔn)系列溶液比較定量,每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。硒含量按照以下公式計(jì)算:

表1 HG-AFS運(yùn)行參數(shù)Table 1 Operating conditions of HG-AFS

其中,x為硒含量(μg/g);ρ為樣品溶液中硒的質(zhì)量濃度(mg/m L);ρ0為空白溶液中硒的質(zhì)量濃度(mg/m L);V為消化液總體積(m L);m為樣品的質(zhì)量(g);1 000為換算系數(shù)。

1.4.11 菌體硒形態(tài)的測(cè)定 菌體硒形態(tài)的提取:稱(chēng)取0.200 g冠突散囊菌凍干菌體粉末于離心管中,加入20 mg蛋白酶XIV、20 mg脂肪酶VII、6 m L無(wú)菌超純水。將混合物置于磁力攪拌器上,以400 r/min速度在37 ℃避光孵育36 h。在8 000 r/min 離心5 min,收集上清液并通過(guò)0.45μm 無(wú)菌濾膜過(guò)濾,測(cè)定前置于-20 ℃保存。

LC-ICP/MS測(cè)定硒形態(tài):通過(guò)液相色譜—電感耦合等離子體質(zhì)譜(LC-ICP/MS)測(cè)定菌體硒形態(tài)及其含量。LC 系統(tǒng)使用PRP-X100陰離子交換柱(250 mm×4.1 mm×10μm)對(duì)硒形態(tài)進(jìn)行分離。流動(dòng)相為40 mmol/L磷酸銨(p H 6.0),流速為1.0 m L/min,進(jìn)樣量為50μL,運(yùn)行時(shí)間為25 min。ICP-MS系統(tǒng)用于硒形態(tài)的分析和定量,選擇78Se 和82Se 作為監(jiān)測(cè)同位素。ICP-MS的運(yùn)行條件如表2 所示。硒形態(tài)鑒定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為:Se Met、SeCys2、MeSeCys、Se(IV)、Se(VI),分別配制質(zhì)量濃度為0、20、40、60、80、100μg/m L的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)系列溶液。通過(guò)LC-ICP/MS對(duì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行測(cè)定,確定各硒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間,并繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

表2 ICP-MS運(yùn)行參數(shù)Table 2 Operating conditions of ICP-MS

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)特征

如圖1所示,生長(zhǎng)4 d的菌落(圖1-a,1-f)直徑約15～20 mm,可觀察到黃白色菌絲和黃色閉囊殼。菌落生長(zhǎng)7 d(圖1-b,1-g)時(shí),直徑達(dá)30～35 mm,整體呈較規(guī)則圓形,中心部位稍厚且有小突起;顏色由邊緣的淺黃色逐漸加深至中心的淺褐色。菌落生長(zhǎng)10 d(圖1-c,1-h)時(shí),直徑達(dá)到40～45 mm,菌落上布滿(mǎn)黃色閉囊殼,部分黃色菌絲已衰老,變?yōu)楹稚?菌落中心已近橄欖褐色,且有透明黃色液滴滲出。菌落生長(zhǎng)14 d(圖1-d,1-i)時(shí)為直徑50～55 mm 的較規(guī)則圓形;此時(shí)菌落已老化,產(chǎn)生大量閉囊殼;菌落邊緣變成鐵銹色,培養(yǎng)基被色素染為褐色。菌落生長(zhǎng)21 d(圖1-e,1-j)時(shí),直徑達(dá)到65～70 mm,菌落幾乎變成深橄欖色,反面呈黑褐色,菌落中心滲出黑色濃稠的液滴。

圖1 冠突散囊菌在PDA平板培養(yǎng)基生長(zhǎng)狀況Fig.1 Growth status of Eurotium cristatum on PDA plate medium

菌落顏色隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸加深,因?yàn)樵诰渖L(zhǎng)過(guò)程中,其形態(tài)結(jié)構(gòu)和色素分泌出現(xiàn)于不同階段。淺色菌絲和少量黃色閉囊殼產(chǎn)生于培養(yǎng)初期,使菌落呈淡黃色;大量黃色閉囊殼產(chǎn)生于中期,使菌落呈黃色;黑褐色色素分泌于后期,且此時(shí)菌落開(kāi)始老化,菌落顏色進(jìn)一步加深而呈褐色。

2.2 菌體顯微特征

在顯微鏡下對(duì)冠突散囊菌進(jìn)行觀察,可看到冠突散囊菌存在有性生殖(子囊孢子)和無(wú)性生殖(分生孢子)兩種生殖方式。如圖2所示,視野內(nèi)可觀察到具有不對(duì)稱(chēng)分枝的菌絲(圖2-a),以及大量球形或近球形的子囊果(黃色閉囊殼)。子囊果成熟后發(fā)生無(wú)規(guī)則破裂釋放出包含子囊孢子的子囊(圖2-b,2-c)。培養(yǎng)中后期可觀察到分生孢子結(jié)構(gòu)(圖2-d),未成熟分生孢子呈球形,孢子梗較光滑,具有燒瓶形或球形的頂囊。分生孢子從頂端以出芽的形式發(fā)育至成熟,并串生在孢子梗頂部。

圖2 冠突散囊菌顯微形態(tài)特征Fig.2 Microscopic morphological characteristics of Eurotium cristatum

2.3 菌體掃描電鏡特征

如圖3所示,掃描電鏡下可以觀察到冠突散囊菌茂盛的菌絲(圖3-a),菌絲為具有分枝的管狀,中間有隔膜。子囊果纏繞在菌絲中(圖3-b),直徑為70～100μm,含有大量子囊。子囊為橢球形或近球形,直徑為10～25μm,包裹著8個(gè)子囊孢子。子囊孢子為(3～5)μm×(5～8)μm,呈雙凸鏡形,“赤道”部分繞有兩圈縱向的“冠狀”凸起(圖3-c)?！肮跔睢蓖蛊馂楣谕簧⒛揖奶卣鹘Y(jié)構(gòu),是判斷其屬種的重要依據(jù)。分生孢子頭成熟后呈較疏松的掃帚狀(圖3-d),分生孢子為(3.0～4.0)μm×(4.0～5.0)μm,大部分為橢球形,外壁粗糙且生有小刺。無(wú)性孢子形成結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是曲霉家族的獨(dú)特特征[28]。

圖3 冠突散囊菌掃描電鏡形態(tài)Fig.3 Scanning electron microscopy morphological characteristics of Eurotium cristatum

2.4 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

從茯磚茶中共分離、純化得到54株菌株,部分優(yōu)勢(shì)菌株的ITS序列PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析如圖4所示,2至15號(hào)泳道條帶所對(duì)應(yīng)的基因片段長(zhǎng)度約為500～750 bp,且呈現(xiàn)單一明亮狀態(tài),表明所對(duì)應(yīng)DNA 純度高。將測(cè)得的基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源序列比對(duì),以ITS序列同源性＞99%為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行屬種歸類(lèi)。54株菌株序列比對(duì)結(jié)果如表3所示,SXFCA.1、SXFCB.7等32株菌與模式冠突散囊菌的相似度達(dá)到99%以上,其中SXFCC.12、SXFCF.23、SXFCF.25、SXFCH.32達(dá)到100%,表明這32株菌與冠突散囊菌有很高的同源性。結(jié)合形態(tài)學(xué)的鑒定結(jié)果,可將32株菌株判定為冠突散囊菌。

表3 茯磚茶分離菌株的測(cè)序結(jié)果Table 3 Sequencing results of strains isolated from Fucha tea

圖4 茯磚茶部分優(yōu)勢(shì)菌株的ITS序列PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖像Fig.4 Gel electrophoresis images of PCR amplification products of ITSsequences of dominant strains from Fucha tea

2.5 冠突散囊菌生長(zhǎng)特性曲線

通過(guò)液體培養(yǎng)繪制的冠突散囊菌生長(zhǎng)曲線如圖5所示。冠突散囊菌短時(shí)間內(nèi)便適應(yīng)了生長(zhǎng)環(huán)境,培養(yǎng)24 h時(shí)生物量開(kāi)始增加。由于培養(yǎng)基為冠突散囊菌的生長(zhǎng)提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),極大地促進(jìn)了菌體生長(zhǎng)[25]。在培養(yǎng)前132 h,菌絲體生物量呈穩(wěn)定增加趨勢(shì),在培養(yǎng)132 h～156 h 階段,菌絲體生長(zhǎng)速率出現(xiàn)大幅提升,菌絲體生物量在156 h時(shí)達(dá)到最大值184.33 mg/100 m L,說(shuō)明此時(shí)冠突散囊菌處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期且活力最旺盛。此后,菌絲體生物量出現(xiàn)緩慢下降并逐漸平穩(wěn)的趨勢(shì),這是因?yàn)榫z體的持續(xù)生長(zhǎng)繁殖使培養(yǎng)基體系內(nèi)菌體相對(duì)密度增加,導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)空間變小,也可能是由于長(zhǎng)時(shí)間半封閉培養(yǎng)使菌絲體發(fā)生輕微自溶[29]。

圖5 冠突散囊菌生長(zhǎng)特性曲線Fig.5 Growth characteristic curve of Eurotium cristatum

2.6 耐硒菌株篩選結(jié)果

當(dāng)微生物生長(zhǎng)環(huán)境中的無(wú)機(jī)硒濃度較高時(shí),它不僅會(huì)在胞內(nèi)轉(zhuǎn)化成有機(jī)硒,而且有一部分會(huì)被還原成單質(zhì)硒[30],使菌體在外觀上呈紅色。32株冠突散囊菌在含硒培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況如表4所示。在硒質(zhì)量濃度為30μg/m L 時(shí),菌落數(shù)量多且直徑大,與正常生長(zhǎng)的菌落相比顏色沒(méi)有明顯變化,且菌落在此濃度下生長(zhǎng)最快。為了提高有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率,減少單質(zhì)硒的累積[31],選擇冠突散囊菌生長(zhǎng)的適宜硒質(zhì)量濃度為30μg/m L。當(dāng)硒質(zhì)量濃度為60μg/m L時(shí),菌落顏色明顯變紅,說(shuō)明硒單質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的累積增多[18]。當(dāng)硒質(zhì)量濃度達(dá)到120μg/m L時(shí),大部分菌株已停止生長(zhǎng)或長(zhǎng)出零星的紅色或橙紅色菌落。部分菌株可以生長(zhǎng)出顏色較淺的菌落,分別為菌株SXFCB.7、SXFCC.1、SXFCC.8、SXFCC.10、SXFCD.7、SXFCD.8、SXFCE.7、SXFCG.3,表明這8株菌有很強(qiáng)的耐硒性能,可進(jìn)一步探究它們的富硒能力。

2.7 富硒菌株篩選結(jié)果

PDB培養(yǎng)篩選富硒菌株結(jié)果如圖6所示,不同菌株受硒的影響有明顯差別。菌株SXFCC.1與SXFCD.8 的生物量分別為(27.48±1.31)mg/100 m L和(28.92±0.94)mg/100 m L,均超過(guò)25 mg/100 m L,說(shuō)明這兩株菌在硒環(huán)境中能保持較好的活力,硒對(duì)其生長(zhǎng)產(chǎn)生的抑制作用小。SXFCC.8和SXFCD.8富硒量分別為(604.98±16.93)μg/g和(628.38±20.96)μg/g,說(shuō)明這兩株菌的富硒能力很強(qiáng),對(duì)硒的利用和轉(zhuǎn)化率高,但是菌株SXFCC.8的生物量較低,說(shuō)明硒對(duì)其生長(zhǎng)的抑制作用較強(qiáng)。綜合考量得出菌株SXFCD.8能夠在保持較高生物量的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)最大的富硒量,是一株富硒能力較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)菌株。

圖6 8株富硒冠突散囊菌生物量及總硒含量Fig.6 Biomass and total selenium content of 8 selenium-enriched Eurotium cristatum

為進(jìn)一步探究菌株SXFCD.8的有機(jī)硒轉(zhuǎn)化能力,通過(guò)LC-ICP/MS 對(duì)其菌體硒形態(tài)進(jìn)行測(cè)定。如圖7-b所示,菌株SXFCD.8硒形態(tài)色譜圖中共檢出6個(gè)清晰的峰,代表至少存在6種硒形態(tài)。通過(guò)與硒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間(圖7-a)比對(duì)可知,峰1為SeCys2,峰2 為MeSeCys,峰4 為Se(IV),峰5為Se Met。根據(jù)硒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)曲線計(jì)算出的硒形態(tài)濃度如表5所示。濃度最高的硒形態(tài)為Se Met,達(dá)到(338.03±3.78)μg/g,占總硒含量的53.79%。其次為SeCys2,含量為(183.30±2.43)μg/g,占總硒含量的29.17%。MeSeCys是含量最低的有機(jī)硒形態(tài),為(17.58±3.24)μg/g,僅占總硒含量的2.80%。作為原始硒源的Se(IV),在菌體內(nèi)的含量為(44.07±0.84)μg/g,僅占總硒含量的7.01%。Se(VI)未在菌體中檢測(cè)到。硒形態(tài)測(cè)定結(jié)果表明,菌株SXFCD.8能夠?qū)h(huán)境中的無(wú)機(jī)硒吸收并轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒,且主要以硒代氨基酸形式存在,進(jìn)一步說(shuō)明冠突散囊菌具有作為有機(jī)硒來(lái)源的巨大潛力。

表5 冠突散囊菌中硒形態(tài)及總硒含量(±s)Table 5 Se species contents and TSC of proteins isolated from Eurotium cristatum

表5 冠突散囊菌中硒形態(tài)及總硒含量(±s)Table 5 Se species contents and TSC of proteins isolated from Eurotium cristatum

注:ND.未檢出。Note:ND.Not detected.

硒形態(tài)Selenium species項(xiàng)目Item 硒代胱氨酸SeCyS2甲基硒代半胱氨酸MeSeCyS硒代蛋氨酸Se Met硒(Ⅳ)Se(Ⅳ)硒(Ⅵ)Se(Ⅵ)有機(jī)硒Organic selenium總硒Total selenium含量/(μg/g)Content 183.30±2.43 17.58±3.24 338.03±3.78 44.07±0.84 ND 538.91±4.59 628.38±7.96占總硒比例/%Percentage of total selenium 29.17 2.80 53.79 7.01 0 85.76

圖7 硒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(a)和冠突散囊菌硒形態(tài)(b)的LC-ICP/MS色譜圖Fig.7 LC-ICP/MS chromatogram of(a)selenium standards and(b)selenium species of Eurotium cristatum

3 討論

對(duì)冠突散囊菌的命名和分類(lèi)的研究自其被發(fā)現(xiàn)就開(kāi)始了,早期的研究多以形態(tài)學(xué)鑒定為主,溫瓊英[32]通過(guò)掃描電鏡觀察到“金花菌”菌體表面具有冠狀突起,其子囊孢子表面比較粗糙而分生孢子具有小刺,與齊祖同[5]的研究結(jié)果相符。雖然形態(tài)學(xué)觀察在菌株鑒定中起到重要作用,但是由于菌落形態(tài)具有不穩(wěn)定性,因而需要采用多種鑒定手段以確證鑒定結(jié)果。本研究將傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察與分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合,從陜西茯磚茶中鑒定出32株冠突散囊菌。從測(cè)序結(jié)果可以看到每個(gè)菌株在ITS保守區(qū)域中有各自的堿基變化,表明冠突散囊菌中存在遺傳多樣性[33]。從茯磚茶中分離的菌株除了冠突散囊菌外,其他菌株分別與阿姆斯特丹散囊菌、謝瓦散囊菌、赤散囊菌等有較高的相似性,說(shuō)明茯磚茶中的“金花菌”是一個(gè)菌種組成復(fù)雜的體系。胡治遠(yuǎn)等[34]鑒定了湖南地區(qū)茯磚茶中的“金花菌”,結(jié)果表明“金花菌”包括冠突散囊菌、謝瓦散囊菌、蠟葉散囊菌等多種散囊菌。盡管ITS 區(qū)域可用于散囊菌的分類(lèi)鑒定,但在反映種間的遺傳多樣性方面仍有欠缺。如果要得到種水平的相關(guān)信息,則應(yīng)利用分辨能力更高、更精準(zhǔn)的基因進(jìn)行鑒定,或進(jìn)行基因系統(tǒng)發(fā)育分析[35]。

目前,關(guān)于冠突散囊菌功能和應(yīng)用的研究較少,至于其富硒能力的研究更是鮮有報(bào)道,本研究關(guān)于陜西茯磚茶中的冠突散囊菌富硒菌株的報(bào)道為首次。在菌株篩選過(guò)程中發(fā)現(xiàn),硒對(duì)所有菌株的生長(zhǎng)都造成不同程度的影響,且質(zhì)量濃度越高對(duì)菌體生長(zhǎng)抑制越明顯。另外,不同冠突散囊菌在含硒PDA 培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)情況有顯著差異,如在大部分菌株可以耐受的30μg/m L 的硒環(huán)境中,菌株SXFCA.6和SXFCA.8幾乎沒(méi)有菌落產(chǎn)生,而在硒質(zhì)量濃度高達(dá)120μg/m L的環(huán)境中,菌株SXFCC.1、SXFCD.8等仍可以產(chǎn)生大量菌落,且紅硒現(xiàn)象并不嚴(yán)重,這說(shuō)明不同菌株對(duì)硒的耐受和轉(zhuǎn)化能力存在差異性。目前關(guān)于微生物硒轉(zhuǎn)化的機(jī)理并未明確,對(duì)富硒酵母富硒機(jī)理的研究表明[36],菌株富硒能力的差異可能與其自身的代謝系統(tǒng)有關(guān),因?yàn)樵撓到y(tǒng)對(duì)硒和硫元素的識(shí)別能力在微生物富硒過(guò)程中起決定性作用。也有研究表明由于不同微生物含有的酶類(lèi)不同,氧化還原反應(yīng)的胞內(nèi)環(huán)境也不盡相同,從而影響了富硒能力[37]。

對(duì)菌株SXFCD.8 硒形態(tài)的研究表明,冠突散囊菌具有轉(zhuǎn)化有機(jī)硒的能力。在其轉(zhuǎn)化得到的有機(jī)硒中,Se Met的含量最高,這與之前的報(bào)道相一致,表明Se Met是富硒微生物中有機(jī)硒的主要種類(lèi)[27,38],這也被認(rèn)為是富硒微生物“有機(jī)”的標(biāo)志[39]。SeCys2 占冠突散囊菌總硒含量的29.17%,而在富硒酵母中約為10%～15%[40],這一差異可能與蛋白質(zhì)中Met、Cys2和Cys的比例有關(guān)[41]。3種有機(jī)硒的總含量達(dá)到92.44%,表明冠突散囊菌中的硒物質(zhì)具有較高的生物利用度,更易于被生物吸收[42]。值得注意的是,所鑒定的4種硒形態(tài)總含量為(582.99±2.78)μg/g,低于HG-AFS檢測(cè)到的總硒含量,這可能是由于冠突散囊菌酶解不足所致[43]。除了這4種可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)確定的硒形態(tài)外,在圖7-b中還觀察到兩個(gè)未確定的峰。在沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的情況下,可以利用ESI-Orbitrap MS進(jìn)行鑒定。硒氨基酸的多樣性是微生物具有強(qiáng)大富硒能力的重要基礎(chǔ),對(duì)冠突散囊菌硒形態(tài)的分析表明,冠突散囊菌具有較強(qiáng)的有機(jī)硒轉(zhuǎn)化能力,有望被開(kāi)發(fā)為一種有機(jī)硒補(bǔ)充劑。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)手段相結(jié)合的方式,從陜西茯磚茶中分離并鑒定到32株冠突散囊菌,并通過(guò)硒脅迫篩選得到8株耐硒菌株,其中菌株SXFCD.8在硒質(zhì)量濃度為30μg/m L 的培養(yǎng)環(huán)境下,生物量為(28.92±0.94)mg/100 m L,富硒量達(dá)到(628.38±20.96)μg/g,是具有較強(qiáng)富硒能力的優(yōu)勢(shì)菌株。通過(guò)LC-ICP/MS在SXFCD.8菌體內(nèi)共檢測(cè)到6種硒形態(tài),其中Se-Met、SeCys2、MeSeCys、Se(IV)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相匹配,說(shuō)明冠突散囊菌具有較強(qiáng)的有機(jī)硒轉(zhuǎn)化能力。

本研究首次報(bào)道了陜西茯磚茶中冠突散囊菌富硒菌株,豐富了富硒微生物的種類(lèi),為微生物硒補(bǔ)充劑的研究提供了參考,并對(duì)硒缺乏現(xiàn)象的改善具有重要意義。