甘藍(lán)型油菜Bn WRKY41的理化性質(zhì)分析及BnWRKY41-2在花青素合成中的功能解析

于芮蘆魏澤樓郭 媛劉子金陳明訓(xùn)

(國(guó)家楊凌農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種中心,陜西省作物雜種優(yōu)勢(shì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

油菜(Brassica napusL.)不僅能為人類提供食用油,而且可作為生物燃料和動(dòng)物飼料的來源[1]。在中國(guó)油料作物中,油菜的種植范圍廣、面積大,占油料作物總種植面積的一半以上,其中冬油菜種植面積占油菜總種植面積的九成以上[2]?；ㄇ嗨貙儆邳S酮類化合物,具有較強(qiáng)的抗氧化特性,能夠增強(qiáng)植物抵御生物和非生物脅迫的能力[3-7],同時(shí)也能被人體所吸收,進(jìn)而提高機(jī)體免疫力[8-10]。冬油菜的抗寒性決定了其能否在北方地區(qū)安全過冬并獲得豐收[11]。研究表明油菜的抗寒性與花青素的含量息息相關(guān)[12-14],然而目前關(guān)于油菜花青素代謝調(diào)控的研究報(bào)道尚不多見。因此,挖掘調(diào)控油菜花青素合成的關(guān)鍵基因,有助于利用分子育種手段培育花青素含量高、對(duì)非生物逆境具有較強(qiáng)抵抗力的優(yōu)異油菜種質(zhì)資源。

WRKY 家族成員眾多,目前在擬南芥中報(bào)道的WRKYs有72個(gè)[15],是高等植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,通常在其N 端有WRKY 結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域包含一段保守氨基酸序列WRKYGQK 和結(jié)合鋅離子的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)[16-17]。大量研究表明,WRKY 家族轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物逆境脅迫[18-20]、根系發(fā)育[21]、葉片發(fā)育[22]、毛狀體形成[23]、種子發(fā)育[24]和衰老[25-26]等生理生化過程。近年研究表明WRKY 轉(zhuǎn)錄因子也參與花青素的生物合成。葡萄Vv WRKY26正調(diào)控色素的積累,在矮牽牛ph3突變體中過量表達(dá)Vv WRKY26后,色素含量也得到顯著提高[27]。Md WRKY11轉(zhuǎn)化蘋果愈傷組織后,類黃酮和花青素的含量顯著高于對(duì)照組,并且類黃酮通路中相關(guān)基因的表達(dá)量顯著上升[28]。WRKY41在植物響應(yīng)非生物逆境中也發(fā)揮關(guān)鍵作用。比如:在煙草中過量表達(dá)棉花Gh-WRKY41基因,可顯著增強(qiáng)其耐鹽抗旱能力[29];在番茄中,Sp WRKY41參與調(diào)控番茄的抗逆響應(yīng)過程,其表達(dá)模式受外源水楊酸、赤霉素和乙烯等激素影響[30]。在擬南芥中過量表達(dá)辣椒CaWRKY41基因可降低鎘的耐受性,增強(qiáng)鎘和鋅的吸收以及過氧化氫的積累[31]。在擬南芥中,At WRKY41促進(jìn)種子休眠[32],但抑制葉片花青素的生物合成[33]。盡管科研工作者對(duì)WRKY41轉(zhuǎn)錄因子研究較多,但對(duì)甘藍(lán)型油菜中該基因在花青素合成中的調(diào)控功能仍不清楚。

在甘藍(lán)型油菜品種‘中雙11’(ZS11)中,WRKY41有兩個(gè)拷貝,分別為Bn WRKY41-1和Bn WRKY41-2。西北農(nóng)林科技大學(xué)油菜生物育種理論與技術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn),Bn-WRKY41-1顯著抑制擬南芥葉片中花青素的積累[33]。但是,Bn WRKY41-2 在葉片花青素合成中的生物學(xué)功能尚不清楚。本研究對(duì)油菜Bn-WRKY41-1和Bn WRKY41-2兩個(gè)拷貝進(jìn)行生物信息學(xué)比較分析,并在擬南芥中初步分析Bn-WRKY41-2 在花青素合成過程中的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 植物材料與培養(yǎng)

植物材料包括擬南芥野生型(Col-0)、擬南芥At WRKY41基因的功能缺失突變體wrky41-2(SALK_028449)、甘藍(lán)型油菜‘中雙11’(ZS11)和以wrky41-2突變體為遺傳背景的T3代轉(zhuǎn)基因株系(wrky41-2 35S:Bn WRKY41-2-6HA)。所有材料均種植于人工培養(yǎng)箱中,溫度為22 ℃,光照周期為16 h光照和8 h黑暗,光照強(qiáng)度為160 μmol·m-2·s-1。

1.2 生物信息學(xué)分析

利用在線網(wǎng)站了解Bn WRKY41-1 和Bn-WRKY41-2 兩個(gè)蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能,預(yù)測(cè)它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的功能,相關(guān)網(wǎng)站及其網(wǎng)址如表1所示。

1.3 RNA提取與cDNA第一鏈合成

利用RNA 提取試劑盒(Steady Pure Plant RNA Extraction Kit,Cat:AG21019)提取擬南芥和油菜葉片中的總RNA。使用Naon Drop(NanoDrop ND-1000)測(cè)定RNA 濃度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Evo M-MLV RT for PCR Kit(Accurate Biotechnology,Cat:AG11603)合成cDNA,儲(chǔ)存在-20 ℃,供后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.4 基因克隆和植物表達(dá)載體構(gòu)建

依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中Bn WRKY41-2基因的CDS序列,利用PrimerBLAST 程序設(shè)計(jì)特異性引物(表2),以‘ZS11’幼嫩葉片的cDNA 為模板,利用高保真DNA 聚合酶(TaKaRa,Cat:R010A)通過PCR 技術(shù)擴(kuò)增目的基因。PCR 反應(yīng)程序如下:98 ℃預(yù)變性30 s,98 ℃變性10 s,58 ℃退火5 s,72℃延伸1 min 30 s,35個(gè)循環(huán),72℃延伸5 min,12 ℃保存。切膠,使用凝膠回收試劑盒(OMEGA,Cat:D2500-02)對(duì)膠條中的目的DNA 片段進(jìn)行回收。利用限制性內(nèi)切酶XmaⅠ和SpeⅠ對(duì)純化后的目的片段以及載體p Green-6HA、p Green-GFP進(jìn)行酶切處理,使用T4連接酶(Ta KaRa,Cat:2011A)連接酶切后的目的片段和載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α,隨機(jī)篩選6個(gè)陽性單克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。這6個(gè)陽性克隆的測(cè)序結(jié)果完全一致,并與目標(biāo)序列完全一致,表明從‘ZS11’中成功克隆Bn WRKY41-2基因的CDS序列,并成功構(gòu)建該基因的植物表達(dá)載體35S:Bn-WRKY41-2-6HA和35S:Bn WRKY41-2-GFP。

1.5 煙草葉片的亞細(xì)胞定位

利用農(nóng)桿菌侵染法[34]將35S:Bn WRKY41-2-GFP載體轉(zhuǎn)入到煙草(Nicotiana benthamiana)葉片細(xì)胞中表達(dá),分析油菜BnWRKY41-2在煙草葉片細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。步驟如下:將35S:Bn WRKY41-2-GFP載體轉(zhuǎn)染煙草幼嫩葉片,培養(yǎng)72 h后,將DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)染液(1 mol· L-1Tris,p H 7.4,5 mol·L-1NaCl,1μg·L-1DAPI)注入上述煙草葉片中,30 min后用激光共聚焦顯微鏡(ZEISS LSM700,Germany)觀察熒光信號(hào)并拍照。

1.6 轉(zhuǎn)基因株系的篩選與鑒定

將35S:Bn WRKY41-2-6 HA轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受 態(tài) 細(xì) 胞 (Agrobacterium tumefaciensGV3101),隨后在LB 培養(yǎng)基(含50μg·m L-1Kanamycin和25μg·m L-1Rifampicin)上挑取單克隆進(jìn)行PCR 鑒定。采用花序浸染法[35],轉(zhuǎn)化擬南芥突變體wrky41-2。將收獲的種子均勻撒在營(yíng)養(yǎng)土上,待其長(zhǎng)出真葉時(shí),每隔2～3 d噴施草銨膦(Basta),將篩選的抗性苗移至新的營(yíng)養(yǎng)土上,單株進(jìn)行DNA 水平和RNA 水平鑒定,確定是否成功轉(zhuǎn)入目的基因,鑒定結(jié)果為陽性的株系即為T1代轉(zhuǎn)基因株系,將收獲的種子置于MS培養(yǎng)基(含10μg·m L-1草銨膦)上繼續(xù)篩選,直至獲得T3代純合轉(zhuǎn)基因株系。

1.7 葉片花青素含量測(cè)定

參考Chory等[36]方法測(cè)定擬南芥葉片花青素的含量,簡(jiǎn)要步驟如下:準(zhǔn)確稱取0.1 g擬南芥葉片,用液氮研磨至粉末狀加入300μL 提取液[鹽酸∶甲醇=1∶99(W/V)],混合均勻后4 ℃避光過夜。加入200μL的蒸餾水和500μL的氯仿,上下?lián)u晃1 min,12 000 r·m L-1離心8 min。利用多功能酶標(biāo)儀(TECAN Spark,Austria)測(cè)定溶液在波長(zhǎng)為530 nm 和657 nm 處的吸光值。各樣品花青素相對(duì)含量=(A530-A657)/鮮質(zhì)量,鮮質(zhì)量單位為g。

1.8 基因表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)技術(shù)分析基因表達(dá)情況。使用SYBR○R Premix Ex TaqTMⅡ(TakaRa,Cat:DRR820A)試劑盒進(jìn)行熒光定量試驗(yàn)。試驗(yàn)每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)和3個(gè)生物學(xué)重復(fù),參照試劑盒說明書,反應(yīng)體系為20μL,反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,40個(gè)循環(huán),72 ℃延伸5 min,12 ℃保存。以管家基因At Actin7為內(nèi)參基因,各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量根據(jù)2-△△Ct法[37],RT-qPCR 試驗(yàn)所用引物見表2。

表2 引物序列Table 2 Sequences of primers

2 結(jié)果與分析

2.1 BnWRKY41-1 和BnWRKY41-2 蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)比較分析

2.1.1 理化性質(zhì)分析 如表3 所示,Bn-WRKY41-1氨基酸殘基總數(shù)為330,分子質(zhì)量為36 564.71 u,等電點(diǎn)為5.68,其中帶正電荷的氨基酸共有31個(gè),占9.4%,帶負(fù)電荷的氨基酸共有37個(gè),占11.2%,不穩(wěn)定系數(shù)為45.50,平均親水性為-0.618;Bn WRKY41-2 氨基酸殘基總數(shù)為323,分子質(zhì)量為35 948.9 6 u,等電點(diǎn)為5.90,其中帶正電荷的氨基酸共有32 個(gè),占9.9%,帶負(fù)電荷的氨基酸共有36個(gè),占11.1%,不穩(wěn)定系數(shù)為46.42,平均親水性為-0.693。結(jié)果表明Bn WRKY41-1 和Bn WRKY41-2 均為不穩(wěn)定、弱酸性的親水蛋白質(zhì)。

表3 BnWRKY41蛋白質(zhì)的基本理化特性Table 3 Physicochemical properties of BnWRKY41 proteins

2.1.2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 在線網(wǎng)站SOPMA 預(yù)測(cè)表明,Bn WRKY41-1 和Bn WRKY41-2蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)均以無規(guī)則卷曲為主,分別為62.73% 和59.44%,其次是α-螺旋,分別為21.21%和24.15%,β-轉(zhuǎn)角占比最少,分別為4.24%和2.79% (圖1-A、1-B)。在線網(wǎng)站SWISS-MODEL預(yù)測(cè)表明,BnWRKY41-1和Bn-WRKY41-2 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)基本一致,均可形成一個(gè)單體,沒有配體的結(jié)合(圖1-C、1-D)。

圖1 BnWRKY41蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.1 The secondary and tertiary structuresof BnWRKY41 proteins

2.1.3 結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析 利用在線網(wǎng)站TMHMM Server對(duì)Bn WRKY41兩個(gè)蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽和結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析,結(jié)果表明Bn-WRKY41兩個(gè)蛋白質(zhì)均沒有跨膜結(jié)構(gòu)域(圖2-A、2-B),各項(xiàng)預(yù)測(cè)指標(biāo)均低于閾值,沒有N 端信號(hào)肽(圖2-C、2-D),屬于非分泌性蛋白質(zhì),具有典型的WRKY 家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域(圖2-E)。

圖2 BnWRKY41蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析Fig.2 Prediction of functional domains of BnWRKY41 proteins

2.1.4 氨基酸翻譯后磷酸化修飾位點(diǎn)和N-糖基化修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析 利用在線網(wǎng)站NetPhos 3.1 Server對(duì)Bn WRKY41兩個(gè)蛋白質(zhì)的三類氨基酸殘基[絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)]進(jìn)行翻譯后的磷酸化修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bn WRKY41-1中磷酸化位點(diǎn)共有44個(gè),其中絲氨酸磷酸化位點(diǎn)最多,有28個(gè),其位置分別在:4、34、39、41、42、44、61、62、78、100、103、107、110、125、126、142、156、173、194、212、245、253、257、266、269、285、299、303。其次是蘇氨酸磷酸化位點(diǎn),有13個(gè)位點(diǎn),其位置分別在:49、54、94、178、182、204、210、223、224、261、291、298、300。酪氨酸磷酸化位點(diǎn)最少,僅3個(gè),其位置分別在:63、160、288(圖3-A)。BnWRKY41-2 的磷酸化位點(diǎn)共有42 個(gè),其中絲氨酸磷酸化位點(diǎn)最多,達(dá)26個(gè),其位置分別在:4、34、42、44、61、62、77、92、95、99、102、117、118、134、148、165、186、204、237、246、250、259、262、281、292、296。其次是蘇氨酸磷酸化位點(diǎn),有12個(gè)位點(diǎn),其位置分別在:49、54、86、170、174、196、202、215、216、254、289、291。酪氨酸磷酸化位點(diǎn)最少,僅有4個(gè),其位置分別在:63、152、264、277(圖3-B)。

通過在線網(wǎng)站Net NGlyc1.0 Server對(duì)Bn-WRKY41兩個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行N-糖基化修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè),結(jié)果顯示,BnWRKY41-1 和BnWRKY41-2均含有5個(gè)天冬酰胺(Asn)翻譯后的N-糖基化修飾位點(diǎn),分別位于第71、123、226、243、283位(圖3-C)和第71、115、218、235、276位(圖3-D)。

圖3 BnWRKY41蛋白質(zhì)磷酸化修飾位點(diǎn)和N-糖基化修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析Fig.3 Prediction of phosphorylation and N-glycosylation modification sites of BnWRKY41 proteins

氨基酸殘基修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果表明,Bn-WRKY41-1和Bn WRKY41-2 主要通過絲氨酸的磷酸化修飾發(fā)揮生物學(xué)功能。

2.1.5 蛋白質(zhì)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)分析 利用在線網(wǎng)站STRING 預(yù)測(cè)BnWRKY41 兩個(gè)蛋白質(zhì)的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(圖4-A、4-B),結(jié)果表明Bn-WRKY41-1 和Bn WRKY41-2 均能夠與含有WRKY 結(jié)構(gòu)域、B3結(jié)構(gòu)域、WD-repeat序列的蛋白質(zhì)形成互作網(wǎng)絡(luò),在DNA 結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程中發(fā)揮作用。此外,與Bn WRKY41-1互作的蛋白質(zhì)還參與細(xì)胞壁修飾(表4),與Bn WRKY41-2 互作的蛋白質(zhì)參與細(xì)胞組分構(gòu)成(表5)。

表4 BnWRKY41-1共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中的蛋白質(zhì)信息Table 4 The protein information in the coexpression network of BnWRKY41-1 protein

表5 BnWRKY41-2 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中的蛋白質(zhì)信息Table 5 The protein in formation in the coexpression network of the BnWRKY41-2 protein

圖4 BnWRKY41-1(A)和BnWRKY41-2(B)蛋白質(zhì)的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)Fig.4 The coexpression network of BnWRKY41-1(A)and BnWRKY41-2(B)proteins

2.2 油菜Bn WRKY41-2定位于煙草葉片細(xì)胞的細(xì)胞核中

通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)化使重組載體35S:Bn-WRKY41-2-GFP在煙草葉片細(xì)胞中表達(dá),在激光共聚焦顯微鏡下,根據(jù)熒光信號(hào)判斷Bn-WRKY41-2 的亞細(xì)胞定位情況。如圖5 所示,Bn WRKY41-2 蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞核中,因此推斷Bn WRKY41-2 蛋白質(zhì)在細(xì)胞核中發(fā)揮功能,可能具有轉(zhuǎn)錄因子特性。

圖5 BnWRKY41-2 在煙草葉片細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位Fig.5 Subcellular localization of the BnWRKY41-2 protein in N.benthamiana leaf cells

2.3 油菜BnWRKY41-2抑制擬南芥葉片花青素的積累

為探究Bn WRKY41-2 對(duì)花青素積累的影響,構(gòu)建植物過量表達(dá)載體35S:Bn WRKY41-2-6HA,并轉(zhuǎn)入到擬南芥突變體wrky41-2(圖6-A),利用草銨膦除草劑篩選獲得10個(gè)以上T1代轉(zhuǎn)基因單株,本研究隨機(jī)選取2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系,并用特異性引物對(duì)其進(jìn)行PCR鑒定(圖6-B)。利用RT-qPCR 技術(shù)檢測(cè)野生型、突變體和2 個(gè)獨(dú)立的擬南芥轉(zhuǎn)基因株系wrky41-2 35S:Bn-WRKY41-2中油菜Bn WRKY41-2基因的轉(zhuǎn)錄水平(圖6-C),結(jié)果顯示Bn WRKY41-2在擬南芥轉(zhuǎn)基因株系中均有大量表達(dá),在野生型和突變體wrky41-2中沒有表達(dá)。利用酶標(biāo)儀檢測(cè)野生型、突變體和2個(gè)獨(dú)立的擬南芥轉(zhuǎn)基因株系wrky41-2 35S:Bn WRKY41-2-6HA發(fā)芽20 d葉片中的花青素含量,結(jié)果顯示過量表達(dá)Bn WRKY41-2基因能夠使突變體葉片中高花青素含量的表型完全恢復(fù)至野生型水平(圖6-D),由此說明,Bn-WRKY41-2 在擬南芥葉片花青素積累過程中起負(fù)調(diào)控作用。

圖6 轉(zhuǎn)基因株系wrky41-2 35S:BnWRKY41-2-6HA 的分子鑒定及花青素含量分析Fig.6 Molecular characterization and quantitative assay of anthocyanin content of wrky41-2 35S:BnWRKY41-2-6HA transgenic plants

2.4 油菜Bn WRKY41-2抑制花青素積累相關(guān)基因的表達(dá)

前期研究表明擬南芥At WRKY41通過抑制At MYB75、At MYB111、At MYBD、AtGSTF12和At1G68840基因的表達(dá),負(fù)調(diào)控花青素的積累[33]。為進(jìn)一步探究Bn WRKY41-2 對(duì)花青素積累的影響,本研究利用RT-qPCR 技術(shù)檢測(cè)了以上5個(gè)基因在Col-0、wrky41-2和wrky41-2 35S:Bn WRKY41-2-6HA轉(zhuǎn)基因株系蓮座葉中的表達(dá)量。在突變體wrky41-2中At MYB75、At MYB111、At MYBD、AtGSTF12和At1G68840基因的表達(dá)量均顯著高于Col-0,而在wrky41-2 35S:Bn-WRKY41-2-6HA轉(zhuǎn)基因株系中,這些基因的表達(dá)量得到顯著抑制,其水平與Col-0相比并無顯著差異(圖7)。這些結(jié)果表明,BnWRKY41-2 與At WRKY41功能類似,均通過負(fù)調(diào)控At MYB75、At MYB111、At MYBD、At1G68840和AtGSTF12基因的表達(dá),抑制擬南芥葉片花青素積累。

圖7 過量表達(dá)油菜BnWRKY41-2 基因后花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)Fig.7 Expression of anthocyanin biosyn thesis genes under BnWRKY41-2 overexpression

3 討論

前期研究表明擬南芥At WRKY41除調(diào)控種子休眠[32]、逆境響應(yīng)外[38],還顯著抑制葉片花青素的積累[33]。甘藍(lán)型油菜Bn WRKY41 有兩個(gè)拷貝,序列同源性高,其中Bn WRKY41-1通過負(fù)調(diào)控At MYB75、At MYB111、At MYBD、AtGSTF12和At1G68840等花青素合成相關(guān)基因的表達(dá),顯著抑制擬南芥葉片花青素的積累,并與擬南芥At WRKY41在調(diào)控葉片花青素生物合成方面功能相似[33],但Bn WRKY41兩個(gè)拷貝蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及Bn WRKY41-2 在調(diào)控葉片花青素生物合成方面的功能尚不清楚。本試驗(yàn)旨在對(duì)Bn-WRKY41兩個(gè)拷貝進(jìn)行生物信息學(xué)分析,并研究Bn WRKY41-2 在調(diào)控葉片花青素生物合成中的功能。結(jié)果表明Bn WRKY41-1和Bn WRKY41-2分別編碼330 和323 個(gè)氨基酸殘基,均含有WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族典型結(jié)構(gòu)域WRKYGQK,兩個(gè)蛋白質(zhì)均屬于親水性、不穩(wěn)定(表3)、非分泌蛋白質(zhì)(圖2-A、2-B),不具備信號(hào)識(shí)別功能(圖2-C、2-D),二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲組成(圖1-A、1-B),蛋白質(zhì)磷酸化主要集中在絲氨酸殘基上,N-糖基化位點(diǎn)有5 個(gè)(圖3),推測(cè)Bn-WRKY41-1和BnWRKY41-2 蛋白質(zhì)功能相似;亞細(xì)胞定位結(jié)果表明Bn WRKY41-2 定位在細(xì)胞核中(圖5),說明可能作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用,這與前期研究的Bn WRKY41-1的亞細(xì)胞定位結(jié)果一致[33]。在擬南芥突變體wrky41-2中過量表達(dá)Bn WRKY41-2基因能夠完全恢復(fù)突變體蓮座葉花青素含量高的表型(圖6-D)。因此,以上研究結(jié)果表明,Bn WRKY41兩個(gè)拷貝不僅在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)方面相似,而且均可抑制擬南芥葉片花青素積累。以往研究顯示,高等植物中存在大量結(jié)構(gòu)類似,功能保守的拷貝,例如亞麻中Lu FAD25 個(gè)拷貝均能促進(jìn)亞油酸的生物合成[39]。

前人研究表明,At MYB75、At MYB111 和At MYBD 屬于MYB轉(zhuǎn)錄因子,在花青素合成過程中發(fā)揮重要作用。At MYB75基因參與調(diào)控植物體內(nèi)花青素的積累,調(diào)控類黃酮物質(zhì)生物合成相關(guān)基因的表達(dá)[40-41]。At MYB111 調(diào)控子葉中類黃酮的合成[42-43]。At MYBD 是花青素生物合成過程中的正向調(diào)控因子[44]。At1G68440 參與苯丙烷代謝途徑[45],生成花青素生物合成的關(guān)鍵底物香豆酰-輔酶A[46-47]。At GSTF12基因編碼谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶,將花青素從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中,促進(jìn)花青素積累[48-50]。前期研究表明,At-WRKY41突變以后,At MYB75、At MYB111、At MYBD、AtGSTF12和At1G68840等基因在葉片中的表達(dá)量顯著提高,而在wrky41-2突變體中過量表達(dá)Bn WRKY41-1則能夠顯著抑制這些基因的表達(dá)[33]。本研究發(fā)現(xiàn),在擬南芥wrky41-2突變體中過量表達(dá)Bn WRKY41-2也顯著抑制了這些基因的表達(dá)(圖7)。以上結(jié)果表明油菜BnWRKY41-1 和Bn WRKY41-2 與At-WRKY41在抑制擬南芥葉片花青素積累方面功能相似。

油菜作為中國(guó)第一大油料作物,栽培歷史悠久,多功能利用價(jià)值高。葉片花青素在抵御各種生物和非生物脅迫方面發(fā)揮著重要作用[6],本研究初步分析了油菜Bn WRKY41兩個(gè)拷貝蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及Bn WRKY41-2 在花青素積累過程中的調(diào)控作用,不僅為深入揭示其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ),而且為油菜的品質(zhì)改良育種提供了優(yōu)異基因資源。