柴胡三參膠囊通過調(diào)控PI3K/Akt 和p38MAPK通路抑制阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性

譚 彩，曹 蛟，張杼惠，劉建和*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

近年來，隨著抗腫瘤治療新型化療藥、靶向藥、免疫藥物[1]等治療方法的不斷改進(jìn)，腫瘤患者生存期延長(zhǎng)，帶瘤生存者越來越多，但抗腫瘤治療導(dǎo)致急性或長(zhǎng)期的心血管毒性成為影響患者生存的一個(gè)主要因素[2]，加上近些年來人口老齡化趨勢(shì)越來越明顯，因此抗腫瘤治療導(dǎo)致的心血管毒性問題越發(fā)凸顯，其中以蒽環(huán)類化療藥物引起的心臟毒性為甚。研究表明，阿霉素誘導(dǎo)DNA 損傷，抑制DNA 和蛋白質(zhì)合成，促進(jìn)肌纖維變性，抑制特定基因的轉(zhuǎn)錄，并通過Caspase 3 依賴性機(jī)制導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[3]。 心力衰竭時(shí)心肌細(xì)胞主要以凋亡細(xì)胞死亡的形式丟失，導(dǎo)致心臟收縮功能惡化和左心室重構(gòu)。Akt 的激活可能通過抑制細(xì)胞凋亡[4]從而保護(hù)心功能，而p38 絲裂原激活的蛋白激酶（p38MAPK）的抑制可以減弱細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。 柴胡三參膠囊是我院針對(duì)心律失常療效顯著的經(jīng)驗(yàn)方，由小柴胡湯化裁而來，前期研究證實(shí)其可緩解癥狀、減少急性發(fā)作次數(shù)，對(duì)心肌急性損傷具有保護(hù)作用[5-6]。 此外，其含藥血清在一定條件下能激活p38MAPK 信號(hào)通路[7]。 然而柴胡三參膠囊能否改善化療引起的心臟毒性尚不清楚。 故本實(shí)驗(yàn)通過建立阿霉素誘導(dǎo)的新生大鼠心肌細(xì)胞損傷模型和小鼠心力衰竭模型，從磷脂酰肌醇3 激酶(PI3K)/Akt 和p38MAPK 通路入手，探討柴胡三參膠囊對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性保護(hù)作用及可能的機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1～3 日齡的SD 大鼠10 只，雌性3 只，雄性7只，體質(zhì)量6～10 g；SPF 級(jí)健康C57BL/6 小鼠，60只，6～8 周齡，雄性，體質(zhì)量20～25 g，采購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司；動(dòng)物合格證批號(hào)：20170005050155。 飼養(yǎng)在（20±5） ℃的無病原體環(huán)境中，自由進(jìn)食和飲水，喂養(yǎng)1 周。 本研究取得湖南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，編號(hào)ZYFY20210506。

1.2 藥物

阿霉素由索萊寶公司提供，批號(hào)D8740。柴胡三參膠囊由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心提供，藥物組成：北柴胡、黃連、法半夏、丹參、苦參、青蒿、黨參、甘草，藥物劑量比例為15∶6∶10∶10∶10∶10∶15∶6，各藥物購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院劉紹貴教授鑒定均為正品，符合2015 年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)范。 制劑符合膠囊劑項(xiàng)下有關(guān)的各項(xiàng)規(guī)定（《中華人民共和國(guó)藥典》2015 年版四部通則0103）。

1.3 試劑

30%聚丙烯酰胺（上海生工生物工程有限公司，批號(hào)：CAS.9003-05-8）；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技公司，批號(hào)：BB150-2TCS）；DMEM-High glucose 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（批號(hào)：JXS0101）；0.25%胰酶消化液(含EDTA)（批號(hào)：JXS0101）；青鏈霉素混合液（批號(hào)：JXS0201） 均購(gòu)自蘇州君欣生物科技有限公司；HE染液（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號(hào)：G1005）；水合氯醛（批號(hào)：30037517-250 g）；二甲苯（批號(hào)：10023418）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；caspase 3、cleaved Caspase 3、p-p38MAPK、p-Akt、PI3K 抗 體（英國(guó)Abcam 公司，批號(hào)分別為ab184787、ab214430、ab178867、ab8805、ab32089）；Akt 蛋白（ABways，批號(hào)：CY5561）；TUNEL 凋亡檢測(cè)試劑盒（上海羅氏制藥有限公司，批號(hào)：43260100）；DHE 染色活性氧檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技公司，批號(hào)：C01201）；血清肌酸激酶（creatine kinase, CK）檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）檢測(cè)試劑盒、丙二醛（malondialdehyde, MDA）檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技公司，批號(hào)分別為BC1140、BC0680、BC0025）；CCK-8 細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒（上海東寰生物科技有限公司，批號(hào)：C00901）。

1.4 儀器

熒光定量PCR 儀（上海力康生物醫(yī)療科技有限公司，型號(hào)：CG-05）；熒光顯微鏡（日本OCYMPUS公司，型號(hào)：CKX53）；酶標(biāo)儀（芬蘭THERMO 公司，型號(hào)：117123001）；病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司，型號(hào)：RM2016）；超聲心動(dòng)圖（加拿大：Fujifilm VisualSonics，型號(hào)：VEVO LAZR-X）；離心機(jī)（上海菲恰爾分析儀器有限公司，型號(hào)：SF-TGL-20R）；正置光學(xué)顯微鏡及成像系統(tǒng)（日本尼康公司，型號(hào)：Nikon Eclipse E100）；電子天平（深圳市無限量衡器有限公司，型號(hào)：FA1004）。

2 方法

2.1 大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)

用胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化法從10 只1～3 日齡SD 大鼠分離出新生大鼠心室肌細(xì)胞(NRVM)[8]。 無菌條件下取SD 大鼠心尖部組織，使用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3 次，將心肌組織剪成約1 mm3大小后移入離心管中，加入0.08%胰蛋白液進(jìn)行反復(fù)吹打，動(dòng)作輕柔，然后置于37 ℃水浴消化10 min，棄去上清液，再加入0.08%胰蛋白液和0.05%膠原酶，反復(fù)吹打后置于37 ℃水浴消化8 min，取上清液移入新離心管中，加入等體積含10%新生牛血清的DMEM 培養(yǎng)液終止消化，將混合液以1500 r/min 離心10 min 后棄去上清液，加入培養(yǎng)液混懸細(xì)胞沉淀，放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

2.2 CCK-8 法測(cè)定最佳含藥濃度

將制備好的細(xì)胞懸液（10 000 個(gè)細(xì)胞/孔）接種到96 孔板中，每孔約100 μL 細(xì)胞懸液，分別加入含藥血漿5、10、20 μL，使終濃度分別為5%、10%、20%，每一濃度同時(shí)設(shè)3 個(gè)復(fù)孔；空白血漿對(duì)照組按上述操作加入無藥血漿。 隨后將培養(yǎng)板置于5%CO2，37 ℃環(huán)境中孵育48 h。 然后每孔加入10 μL CCK-8 溶液，培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm 處的吸光度（OD 值）。 以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)（即X 軸），以吸光度為縱坐標(biāo)（即Y 軸）制作曲線，并據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定細(xì)胞數(shù)量。采用心肌細(xì)胞生存率最高的血漿濃度作為干預(yù)度，心肌細(xì)胞存活率=[(實(shí)驗(yàn)孔-空白孔)/(對(duì)照孔-空白孔)]×100%。由CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力，初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示阿霉素(1 μmol/L)及5%含藥血漿濃度更適于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組、造模及給藥

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：用不同濃度的阿霉素(0、0.1、0.5、1、3、5、10、20 和30 μmol/L)培養(yǎng)NRVM 24 h 后備用。柴胡三參膠囊溶解在PBS 中至10 mg/mL，然后用含有10%不同濃度FBS 的DMEM 培養(yǎng)基稀釋。 以相同體積的磷酸緩沖鹽溶液無胎牛血清DMEM 作為對(duì)照。再進(jìn)一步將細(xì)胞分為對(duì)照（NT)組、阿霉素處理（Model）組、柴胡三參膠囊預(yù)處理后再用阿霉素處理(CHSSC)組。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：將60 只SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為正常對(duì)照（NT）組、模型（Model）組、柴胡三參膠囊預(yù)處理(CHSSC)組，每組20 只。Model：?jiǎn)未胃骨蛔⑸淙芙庥谏睇}水的阿霉素(15 mg/kg)[9]，并口服等劑量生理鹽水。 CHSSC 組：給予柴胡三參膠囊（0.728 g/kg），給藥劑量參考徐叔云教授主編的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》（第三版）[10]人鼠等劑量換算，以成人體質(zhì)量60 kg 為標(biāo)準(zhǔn)獲得，灌胃體積為0.3 mL，灌胃3 d 后，腹腔注射與模型組組相同劑量的阿霉素后再予以柴胡三參膠囊3 d。 NT 組：等劑量生理鹽水灌胃。 造模時(shí)間1 周。

2.4 標(biāo)本采集

末次給藥后次日，小鼠在氧氣中用10%水合氯醛輕度麻醉，直到心率穩(wěn)定到400～500 次/min，超聲心動(dòng)圖測(cè)量EF、LVIDS、LVIDd、ESV、EDV。 超聲心動(dòng)圖測(cè)量完成后，收集血清，頸椎脫位安樂死小鼠，摘取心臟，快速于冰臺(tái)上取心臟。 一部分心臟組織置于4%多聚甲醛固定24 h，脫水、石蠟包埋；另一部分組織置于凍存管中，過液氮，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 指標(biāo)檢測(cè)

2.5.1 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力 在制備好的NRVM 細(xì)胞懸液96 孔板每孔中加入10 μL CCK-8 溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞在450 nm 處的吸光度值。

2.5.2 超聲心動(dòng)儀檢測(cè)小鼠心功能 用小動(dòng)物超聲心動(dòng)儀在小鼠乳頭肌水平進(jìn)行二維定向M 型示蹤，測(cè) 量 和 計(jì) 算EF、LVIDS、LVIDd、LVESV、LVEDV,所有小鼠由一位專業(yè)超聲人員進(jìn)行檢測(cè)，每項(xiàng)測(cè)量平均連續(xù)3 次心動(dòng)周期。

2.5.3 試劑盒檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo) 各組心肌細(xì)胞經(jīng)過相應(yīng)處理后，6-磷酸葡萄糖脫氫酶法檢測(cè)CK 含量，硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA 含量，2,4-二硝基苯肼顯色法檢測(cè)LDH 含量，均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，并通過分光光度計(jì)比色法進(jìn)行檢測(cè)。

2.5.4 TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將吸附細(xì)胞的載玻片在4%多聚甲醛中固定25 min；PBS 浸洗2 次，每次5 min；制備TUNEL 反應(yīng)混合液；加入50 μL TUNEL 反應(yīng)混合液，暗濕盒中反應(yīng)37 ℃×1 h；PBS漂洗3 次；加入50 μL converter-POD，暗濕盒中反應(yīng)37 ℃×30 min；PBS 漂洗3 次；加入50～100 μL DAB底物，反應(yīng)（15～25） ℃×10 min；PBS 漂洗3 次；加1滴PBS 在視野下，用光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞并拍照。

2.5.5 Western blot 法檢測(cè)c-Caspase 3、p-p38MAPK、p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá) 稱取心肌組織50 mg，加入RIPA 裂解液，在冰上研磨離心，電泳、轉(zhuǎn)膜、3%BSA搖床1 h 封閉、一抗孵育（β-actin、1∶1000 稀釋）4 ℃搖床過夜，二抗孵育（兔抗、1∶8000 稀釋）室溫2 h、洗膜，進(jìn)行蛋白免疫印跡分析，用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒顯像，凝膠圖像系統(tǒng)分析各蛋白條帶灰度值，以目的蛋白/β－actin 表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用“±s”表示。滿足正態(tài)分布者，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者用最小顯著性差異法（LSD）檢驗(yàn)，方差不齊者用Dunnet's T3 法檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布者用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠一般狀況

喂養(yǎng)期間，NT 組小鼠活動(dòng)正常，皮毛光滑柔順，進(jìn)食及二便正常，無死亡。Model 組及CHSSC 組第4天開始小鼠活動(dòng)減少，毛發(fā)不光澤或干枯，進(jìn)食減少，各組皆無死亡。

3.2 細(xì)胞活力結(jié)果

Model 組用不同濃度的阿霉素（0、0.1、0.5、1、3、5、10、20 和30 μmol/L)培養(yǎng)NRVM 24 h 后，用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力，顯示阿霉素以劑量依賴性方式降低NRVM 細(xì)胞活力，而用柴胡三參膠囊預(yù)處理的NRVM 組提高了阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞活力(P＜0.01)。詳見表1 和圖1。

3.3 細(xì)胞凋亡結(jié)果

用不同濃度的阿霉素培養(yǎng)NRVM 24 h 后以TUNEL 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，顯示Model 組以阿霉素劑量依賴性方式觸發(fā)細(xì)胞凋亡，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而用柴胡三參膠囊預(yù)處理后凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少(P＜0.01)。 詳見圖2。 在心肌組織檢測(cè)中同樣顯示與NT 組比較，Model 組細(xì)胞凋亡明顯增加(P＜0.01)；與Model 組比較，CHSSC 組細(xì)胞凋亡減輕(P＜0.01)。 詳見圖3。

3.4 心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)結(jié)果

與NT 組相比，Model 組中CK、LDH、MDA 含量明顯增加（P＜0.01），與Model 組比較，CHSSC 組CK（P＜0.05）、LDH、MDA 含量降低（P＜0.01）。 詳見圖4。

3.5 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果

與NT 組比較，Model 組中左室EF 值明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.01），LVIDs、LVIDd、LVESV、LVEDV 值增加，差異有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.01）；與Model組比較，CHSSC 組中小鼠心臟彩色超聲情況都有不同程度的改善，其中EF 升高明顯（P＜0.05），LVESV降低（P＜0.05），LVIDs、LVIDd、LVEDV 皆明顯下降（P＜0.01）。 詳見圖5。

表1 各組心肌細(xì)胞OD 值及心肌細(xì)胞生存率

圖1 柴胡三參膠囊對(duì)NRVM 細(xì)胞活力影響（±s，n=4）

圖2 不同濃度阿霉素（A）及柴胡三參膠囊（B）對(duì)NRVM 細(xì)胞凋亡影響（±s，n=4）

圖3 柴胡三參膠囊對(duì)心肌組織細(xì)胞凋亡（±s，n=9）

圖4 柴胡三參膠囊對(duì)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響（±s，n=20）

3.6 NRVM 及心肌組織中c-Caspase 3、p-p38MAPK、p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)結(jié)果

在NRVM中與NT組比較，Model組中p-p38MAPK、p-PI3K 和c-Caspase 3 蛋白表達(dá)水平升高，且以阿霉素濃度劑量依賴性方式增加(P＜0.01），與Model 組比較，CHSSC 中p-p38MAPK、p-PI3K 和c-Caspase 3表達(dá)降低（P＜0.01）。 詳見圖6。

在心肌組織中，與NT 組比較，Model 組中p-PI3K、p-p38MAPK 蛋白（P＜0.01）和c-Caspase 3（P＜0.05）蛋白表達(dá)水平升高，與Model 組相比，CHSSC 組中p-PI3K、p-p38MAPK 蛋白(P＜0.01）和c-Caspase 3（P＜0.05）蛋白表達(dá)降低。 詳見圖7。

4 討論

圖5 各組小鼠心臟超聲結(jié)果比較(±s，n=20)

圖6 柴胡三參膠囊對(duì)NRVMc-Caspase3、p-P38MAPK、p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)水平的影響（n=3）

蒽環(huán)類化療藥物是臨床常用的一類抗腫瘤藥物，但其通過累積和劑量依賴方式引起的心臟毒性使其臨床應(yīng)用受到限制[11]。 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)抗腫瘤治療相關(guān)心血管毒性并無特殊有效方法，主要依靠右丙亞胺、β 受體阻滯劑或他汀類等心血管藥物來減輕不良反應(yīng)。 但由于右丙亞胺可能干擾蒽環(huán)類抗生素的抗癌活性，并增強(qiáng)阿霉素的骨髓抑制作用，而且價(jià)格相對(duì)昂貴，臨床應(yīng)用受到限制[12]。柴胡三參膠囊是本院針對(duì)心律失常療效顯著的經(jīng)驗(yàn)方。 方中柴胡為君，達(dá)肝經(jīng)入少陽，疏泄肝郁，升發(fā)肝氣，調(diào)暢氣機(jī)，和解少陽之邪；臣以法半夏化痰燥濕、消痰下氣；丹參活血通經(jīng)、涼血消腫、清心除煩；苦參清火燥濕，兼通利小便；黃連大苦大寒，燥濕清熱；青蒿辛開苦泄，宣可去壅，善開痰結(jié)，并能定悸；黨參補(bǔ)氣健脾，益氣以扶其正；甘草補(bǔ)脾益氣、滋咳潤(rùn)肺、緩急解毒、調(diào)和百藥為佐使。 在前期研究中發(fā)現(xiàn)，柴胡三參膠囊能明顯減少缺血性心律失常大鼠心肌中PKA、PKC 的表達(dá)及血清CRP 水平，對(duì)心肌急性損傷具有保護(hù)作用，此外，其含藥血清在一定條件下能激活p38MAPK信號(hào)通路和PI3K/Akt 通路[13]。 但該藥是否通過PI3K/Akt 及p38MAPK 通路的活化而發(fā)揮心肌保護(hù)作用尚不明確，因此，很有必要從蛋白分子水平上進(jìn)一步深入探討其保護(hù)心肌的作用機(jī)制，為蒽環(huán)類藥物所致心臟毒性的中醫(yī)藥防治提供科學(xué)可靠的理論依據(jù)。

圖7 柴胡三參膠囊對(duì)心肌組織中c-Caspase 3、p-P38MAPK、p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)水平的影響（n=8）

阿霉素被認(rèn)為會(huì)誘導(dǎo)心臟毒性，因其自由基會(huì)引起線粒體損傷[2]。 鑒于一系列研究報(bào)告活性氧清除劑未能有效預(yù)防心臟毒性，這一假設(shè)不足以解釋阿霉素的心臟毒性[14]。 研究表明，阿霉素可通過Caspase 3 依賴性機(jī)制誘導(dǎo)DNA 損傷，抑制DNA 和蛋白質(zhì)合成，促進(jìn)肌纖維變性，抑制特定基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[3]。 而在心力衰竭過程中，心肌細(xì)胞主要以細(xì)胞凋亡和自噬形式導(dǎo)致細(xì)胞損失，從而引起心臟收縮功能惡化和左心室重構(gòu)。在此過程中,多種凋亡因子共同發(fā)揮作用，而PI3K/Akt 信號(hào)通路可以通過直接或間接的方法抑制凋亡因子發(fā)揮效應(yīng)[15]。 PI3K/Akt 信號(hào)通路是一條廣泛存在的信號(hào)通路，已被認(rèn)為參與多種細(xì)胞生物學(xué)過程[16]。這一信號(hào)通路在各種病理或應(yīng)激刺激下被激活， 如炎癥、缺血、缺氧和氧化應(yīng)激等[17]。 Akt 是PI3K 的關(guān)鍵下游調(diào)節(jié)因子之一，活化的PI3K 將膜結(jié)合的磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PIP2)轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸(PIP3)，PIP3 作為重要的第二信使招募磷酸肌醇依賴激酶1(PDK1)在蘇氨酸308(Thr308)處磷酸化Akt。因此，Akt 的激活形式可以進(jìn)一步與多種凋亡和生存相關(guān)的調(diào)控因子相互作用，從而促進(jìn)細(xì)胞存活，抑制細(xì)胞凋亡[18]。MAPK 已被報(bào)道為最重要的信號(hào)通路蛋白激酶，作為MAPK 家族的一員，p38MAPK可以被化學(xué)和物理應(yīng)激激活，促進(jìn)生長(zhǎng)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激、凋亡和血管收縮[19]。 眾所周知，氧化應(yīng)激通過調(diào)節(jié)炎癥信號(hào)通路和促凋亡信號(hào)通路來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致人類和心力衰竭動(dòng)物模型的心室擴(kuò)張[20-21]。 氧化應(yīng)激被認(rèn)為可引起p38MAPK 的激活，p38MAPK 是氧化應(yīng)激所致心臟損傷的主要靶點(diǎn)，在氧化應(yīng)激或缺血再灌注等應(yīng)激狀態(tài)下，p38MAPK 的激活促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致心肌收縮功能和左心室的惡化。 相關(guān)研究證明，p38MAPK 已被證明在DOX 誘導(dǎo)的心臟毒性中起重要作用[22-23]。

本研究顯示，阿霉素在體外和體內(nèi)觸發(fā)心臟毒性，柴胡三參膠囊可保護(hù)心肌細(xì)胞免受阿霉素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。 研究表明，PI3K/Akt 信號(hào)通路提供了心肌細(xì)胞中必不可少的細(xì)胞存活信號(hào)[24]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)柴胡三參膠囊可以激活PI3K/Akt信號(hào)通路并減少阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。 阿霉素誘導(dǎo)Akt 磷酸化增加，這與SWAIN 等人的發(fā)現(xiàn)相似[25-26]，并被認(rèn)為是一種補(bǔ)償性保護(hù)性上調(diào)。 然而，本實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)過柴胡三參膠囊預(yù)處理后，磷酸化的Akt 降低，這可能與阿霉素誘導(dǎo)的Akt 磷酸化的時(shí)間過程相關(guān)，阿霉素治療可以在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)補(bǔ)償性Akt 磷酸化增加，但隨著時(shí)間推移，磷酸化量逐漸較少[27]，因本研究暫時(shí)未做時(shí)間梯度的對(duì)比，在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中可以完善這部分驗(yàn)證。柴胡三參膠囊預(yù)處理后，促凋亡蛋白，如活化的Caspase 3 和pp38MAPK 在體外和體內(nèi)均減少，表明柴胡三參膠囊可以通過激活A(yù)kt 通路抑制細(xì)胞凋亡。 既往研究顯示，阿霉素可誘導(dǎo)p38MAPK 的激活，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和細(xì)胞損傷[28]。 本研究中，發(fā)現(xiàn)阿霉素導(dǎo)致p38MAPK激活增加，而柴胡三參膠囊治療后大大降低了蛋白激活，鑒于氧化應(yīng)激可以激活p38MAPK 信號(hào)通路，柴胡三參膠囊可以有效地降低p38MAPK 磷酸化并減輕細(xì)胞炎癥，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡和損傷。

綜上所述，柴胡三參膠囊可保護(hù)心臟免受阿霉素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡損傷，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)PI3K/Akt 和p38MAPK 通路有關(guān)，但是否與劑量存在密切關(guān)系需進(jìn)一步探索。