萬(wàn)壽菊莖葉提取物對(duì)肉雞生產(chǎn)性能及其免疫系統(tǒng)的影響

曾 益，孫藝秋，何夢(mèng)雪，殷中瓊

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 611130）

在畜禽養(yǎng)殖業(yè)飼料全面禁止添加抗生素的大環(huán)境下，替代抗生素類(lèi)飼料添加劑（如植物提取物等）是畜禽營(yíng)養(yǎng)的重要研究方向。萬(wàn)壽菊（Tagetes erectaL.）作為菊科萬(wàn)壽菊屬一年生草本植物，除具有一定的觀賞價(jià)值外，還因其含有黃酮、葉黃素等多種生物活性物質(zhì)而具有藥用價(jià)值，故也是飼料添加劑的選擇之一[1-2]。目前，萬(wàn)壽菊主要采集部位為花，常用于葉黃素的提取，其莖葉卻往往被當(dāng)做廢棄物，未得到充分的利用。萬(wàn)壽菊莖葉中黃酮類(lèi)化合物不僅可以顯著增加肉雞飼料效率及平均日增重[3]，還能在肉雞生產(chǎn)中能夠發(fā)揮抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)作用[4-6]。我們前期研究[7]發(fā)現(xiàn)，萬(wàn)壽莖葉醇提物能夠有效降低LPS致炎小鼠肝和肺的臟器指數(shù)，維持血液的穩(wěn)定，下調(diào)血清中促炎因子的含量和提高抗炎因子水平，從而起到抗炎活性；王金等[8]從萬(wàn)壽菊莖葉中提取得到了3種黃酮類(lèi)化合物，均具有較強(qiáng)的抗氧化活性。已有研究表明，萬(wàn)壽菊莖葉可用于肉牛飼養(yǎng)[9]，但有關(guān)萬(wàn)壽菊莖葉及其提取物在家禽領(lǐng)域的研究在國(guó)內(nèi)外均未有報(bào)道。本試驗(yàn)以萬(wàn)壽菊莖葉提取物作為試驗(yàn)對(duì)象，研究其對(duì)肉雞生長(zhǎng)指標(biāo)、免疫功能以及血液相關(guān)指標(biāo)等方面的影響，為其在雞飼料添加劑生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的材料為萬(wàn)壽菊莖葉提取物，由晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司采用超聲波提取法提取，以70%乙醇為提取液，料液比為1:30，超聲溫度為70℃、一共提取2次，每次提取1 h。經(jīng)過(guò)抽濾、合并濾液，再將濾液減壓濃縮后，放于50℃烘箱干燥至恒重，得萬(wàn)壽菊莖葉浸膏。提取物為粉狀的萬(wàn)壽菊莖葉浸膏，總黃酮含量為13.29%。ELISA IL-1試劑盒、ELISA IL-1β試劑盒、ELISA IL-6試劑盒、ELISA IL-8試劑盒、ELISA IL-10試劑盒、ELISA IgM試劑盒、ELISA IgG試劑盒、ELISA IgA試劑盒，均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

15日齡健康青腳麻雞240只，隨機(jī)分為4組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只雞。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)低、中、高劑量組在飼喂基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上分別添加400、800和1 200 mg/kg萬(wàn)壽菊莖葉提取物，試驗(yàn)期28 d。

1.3 試驗(yàn)飼糧

試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧以玉米豆粕為主原料，依據(jù)我國(guó)雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)定制配方，日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平Table 1 Diet Ingredient and Nutrient Concentration

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在成都市金深港農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司下屬肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行，試驗(yàn)期為2021年8月21日至9月12日，試驗(yàn)肉雞采用3層雞籠飼養(yǎng)，上下交錯(cuò)排列，飼喂顆粒飼料，定時(shí)上料，自由采食和飲水，晝夜不間斷光照，雞舍第1周溫度調(diào)控在35℃，其后每周下降2℃，直至溫度降至25℃，相對(duì)濕度保持在45%～55%，雞舍定期開(kāi)展帶雞消毒，飼養(yǎng)管理按照成都市金深港農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司的肉雞飼養(yǎng)管理標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.5 樣品采集

于開(kāi)始飼喂前以及飼喂后第7、14、21和28天空腹稱重，再于試驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行放血屠宰（屠宰前1 d晚上開(kāi)始禁食，大約禁食12 h），頸靜脈采血，3 000 r/min離心10 min分離血清后，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。取下免疫器官（胸腺、脾臟、法氏囊）去除脂肪組織后稱重。

1.6 指標(biāo)測(cè)定

1.6.1 生產(chǎn)性能的測(cè)定

記錄正式飼喂第0、7、14、21和28天肉雞的體重，以每個(gè)重復(fù)組為單位稱量體重，計(jì)算平均日增重。

1.6.2 免疫相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

1.6.2.1 免疫器官指數(shù)

免疫器官指數(shù)/（g·kg-1）=免疫器官重量×100/肉雞活體重。

1.6.2.2 免疫球蛋白的測(cè)定

按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè)血清中免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）和免疫球蛋白G（IgG）。將標(biāo)準(zhǔn)品的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)曲線方程計(jì)算各待測(cè)因子在血清樣品中的濃度。

1.6.2.3 血清細(xì)胞因子的測(cè)定

按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè)血清中細(xì)胞因子IL-1、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和PGE2吸光度（OD值）。將標(biāo)準(zhǔn)品的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)曲線方程計(jì)算各待測(cè)因子在血清樣品中的濃度。

1.7 萬(wàn)壽菊莖葉提取物成分分析

為探究萬(wàn)壽菊莖葉提取物中所含有效成分，按照各類(lèi)天然藥物有效成分的常規(guī)檢識(shí)方法[10-11]，對(duì)萬(wàn)壽菊莖葉提取物進(jìn)行有效成分檢測(cè)。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用student’s-test檢驗(yàn)顯著性分析，P＜0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01視為差異極顯著，所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來(lái)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 萬(wàn)壽菊莖葉提取物對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的影響

由表2可得，與對(duì)照組相比，萬(wàn)壽菊莖葉提取物各劑量組在飼喂的前14 d，其肉雞體重雖有增長(zhǎng)，但差異不顯著（P＞0.05）。當(dāng)飼喂21～28 d后，萬(wàn)壽菊莖葉提取物中劑量組肉雞的體重與對(duì)照組相比，顯著增長(zhǎng)（P＜0.05），其平均日增重也顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。其余各組無(wú)明顯差異（P＞0.05）。由此可見(jiàn)，萬(wàn)壽菊莖葉提取物中劑量組能提高肉雞的生產(chǎn)性能。

表2 萬(wàn)壽菊莖葉提取物對(duì)肉雞體重的影響Table 2 Effects of the extract of stem and leaves of Tagetes erecta L.on body weight of broilers g

2.2 萬(wàn)壽菊莖葉提取物對(duì)肉雞免疫器官的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，萬(wàn)壽菊莖葉提取物高劑量組能顯著提高肉雞脾臟的免疫器官指數(shù)（P＜0.05），其余劑量組對(duì)脾臟的免疫器官指數(shù)無(wú)顯著的影響（P＞0.05）；萬(wàn)壽菊莖葉提取物各劑量組對(duì)法氏囊和胸腺的免疫器官指數(shù)有提高效果，但差異不顯著（P＞0.05）。

表3 萬(wàn)壽菊莖葉提取物對(duì)肉雞免疫器官的影響Table 3 Effect of the extract of stem and leaves of Tagetes erecta L.on organ indexes of broilers

2.3 萬(wàn)壽菊莖葉提取物對(duì)肉雞血清中免疫球蛋白的影響

肉雞血清中免疫球蛋白檢測(cè)結(jié)果如圖1所示：

圖1 萬(wàn)壽菊莖葉提取物對(duì)肉雞血清中免疫球蛋白的影響Figure 1 Effect of the extract of stem and leaves of Tagetes erecta L.on serum immunoglobulin in broilers

與對(duì)照組相比，萬(wàn)壽菊莖葉提取物中劑量組肉雞血清中IgG含量顯著上升（P＜0.05），其余各劑量組雖有所上升，但差異不顯著（P＞0.05）；萬(wàn)壽菊莖葉提取物高劑量組與對(duì)照組相比，其肉雞血清中IgM含量顯著上升（P＜0.05），其余各劑量組肉雞上升差異不顯著（P＞0.05）。萬(wàn)壽菊莖葉提取物各劑量組肉雞血清中IgA含量與對(duì)照組相比，無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

萬(wàn)壽菊莖葉提取物低、中、高劑量組間的IgA和IgG均無(wú)顯著差異（P＞0.05）；但與萬(wàn)壽菊莖葉提取物高劑量組相比，萬(wàn)壽菊莖葉提取物低劑量組肉雞血清中IgM含量極顯著下降（P＜0.01），萬(wàn)壽菊莖葉提取物中劑量組肉雞血清中IgM含量顯著下降（P＜0.05）。

2.4 萬(wàn)壽菊莖葉提取物對(duì)肉雞血清細(xì)胞因子的影響

肉雞血清中細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果如圖2。與對(duì)照組相比，萬(wàn)壽菊莖葉低、中劑量組肉雞血清中PGE2的含量顯著下降（P＜0.05），其高劑量組肉雞血清中PGE2含量則極顯著下降（P＜0.01）；萬(wàn)壽菊莖葉提取物高劑量組肉雞血清中IL-1β的含量與對(duì)照組相比，也顯著下降（P＜0.05），而其余各劑量組肉雞血清中IL-1β與對(duì)照組相比雖有所下降，但差異不顯著（P＞0.05）。此外，萬(wàn)壽菊莖葉中劑量組肉雞血清中的IL-10含量與對(duì)照組相比，顯著上升（P＜0.05）；其余各劑量組肉雞血清中IL-10含量雖有所上升，但差異不顯著（P＞0.05），萬(wàn)壽菊莖葉提取物各劑量對(duì)肉雞血清中IL-1、IL-6和IL-8含量無(wú)明顯影響（P＞0.05）。

圖2 萬(wàn)壽菊莖葉提取物對(duì)肉雞血清細(xì)胞因子的影響Figure 2 Effects of the extract of stem and leaves of Tagetes erecta L.on serum cytokines in broilers

萬(wàn)壽菊莖葉提取物低、中、高劑量組間的IL-1、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和PGE2均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.5 萬(wàn)壽菊莖葉提取物的有效成分檢測(cè)

萬(wàn)壽菊莖葉提取物中主要包含的有效成分為黃酮類(lèi)化合物和酚類(lèi)化合物，見(jiàn)表4。

表4 萬(wàn)壽菊莖葉提取物的有效成分檢測(cè)結(jié)果Table 4 Results of active component detection of the extract of stem and leaves of Tagetes erecta L.

3 討論與小結(jié)

現(xiàn)有研究表明植物黃酮可以提升肉雞的生產(chǎn)性能，鄭偉等[12]發(fā)現(xiàn)在飼料中添加0.05%沙棘葉黃酮后可使肉雞的平均增重相對(duì)于對(duì)照組提升8.28%，李莉等[13]發(fā)現(xiàn)飼料中添加萬(wàn)壽菊黃酮可以顯著提升4～6周齡的黃羽肉雞平均日增重。萬(wàn)壽菊是一種常見(jiàn)的經(jīng)濟(jì)作物，具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)動(dòng)物免疫性能等作用[14-15]。目前，關(guān)于萬(wàn)壽菊莖葉提取物對(duì)家禽的生產(chǎn)性能和免疫系統(tǒng)的影響還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中，給予肉雞不同劑量的萬(wàn)壽菊莖葉提取物并檢測(cè)其平均日增重，得到萬(wàn)壽菊莖葉提取物各劑量組均有所提高，其中萬(wàn)壽菊莖葉提取物中劑量組肉雞的平均日增重與對(duì)照組相比，極顯著提高，表明萬(wàn)壽菊莖葉提取物能提高肉雞的生產(chǎn)性能，以中劑量組為最佳，不具備有量效關(guān)系。與萬(wàn)壽菊花提取物以及其他菊科植物相比，萬(wàn)壽菊莖葉提取物同樣能提高肉雞的生產(chǎn)性能[16-19]。植物黃酮具有提升肉雞的生產(chǎn)性能的作用，且在本次實(shí)驗(yàn)中通過(guò)成分分析發(fā)現(xiàn)萬(wàn)壽菊莖葉提取物中主要含有黃酮類(lèi)化合物，因此我們推測(cè)萬(wàn)壽菊莖葉提取物中起著提高肉雞生產(chǎn)性能的活性成分可能為黃酮類(lèi)化合物[20-22]。

免疫器官的發(fā)育狀況及機(jī)能強(qiáng)弱直接決定著禽類(lèi)的免疫水平。脾是禽類(lèi)最大的外周免疫器官，參與機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫，其重量的增加可說(shuō)明機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫機(jī)能的增強(qiáng)[23-24]。除免疫器官外，免疫系統(tǒng)中的免疫因子在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中起著非常重要的作用。其中免疫球蛋白是能夠決定體液免疫程度的重要因素[25]；免疫球蛋白的表達(dá)水平直接放反映了機(jī)體的抗病能力；免疫球蛋白的表達(dá)水平直接放反映了機(jī)體的抗病能力；細(xì)胞因子則是評(píng)估細(xì)胞免疫的重要指標(biāo)[26]，其中IL-1、IL-6和IL-8與機(jī)體炎癥反應(yīng)有密切的聯(lián)系，IL-10作為一種抗炎因子，可以抑制炎癥的發(fā)生[27]。而PGE2作為一種強(qiáng)烈的血管擴(kuò)張劑，則在炎癥后期大量地表達(dá)。鄭艷等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在雞的日糧中添加青刺果黃酮后，相較于對(duì)照組，其血清中的IgM和IgG的含量顯著增加；朱紅崗等[29]也發(fā)現(xiàn)雞肝散總黃酮可以提升小鼠血清中的IgM的含量。而在本實(shí)驗(yàn)的研究中發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，萬(wàn)壽菊莖葉提取物也能顯著提高肉雞脾臟的免疫器官指數(shù)，并上調(diào)肉雞血清中IgG、IgM的表達(dá)水平，可能是因?yàn)槿f(wàn)壽菊莖葉提取物中的黃酮類(lèi)物質(zhì)刺激了脾臟淋巴細(xì)胞的增殖，從而促進(jìn)了免疫球蛋白的產(chǎn)生。同時(shí)萬(wàn)壽菊莖葉提取物顯著上調(diào)抗炎因子IL-10的表達(dá)水平，顯著降低血清中IL-1β和PGE2的含量。萬(wàn)壽菊莖葉提取物通過(guò)提升血清中的免疫球蛋白的濃度，增強(qiáng)機(jī)體的抗病能力，降低了外源物質(zhì)入侵機(jī)體后帶來(lái)的損害，從而降低了機(jī)體炎性反應(yīng)，因此降低了炎性因子的水平，使肉雞消化吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)中用于抵抗疾病的部分減少，從而用于生長(zhǎng)的部分增加，所以提高了動(dòng)物的生產(chǎn)性能[30]。

綜上，萬(wàn)壽菊莖葉提取物能顯著提高肉雞生產(chǎn)性能及其機(jī)體的免疫性能，可作為飼料添加劑應(yīng)用于肉雞日糧中，其最佳用量為800～1 200 mg/kg。