宮腔鏡下宮腔黏連手術(shù)后患者血清miR-543、miR-135a表達(dá)及預(yù)測(cè)黏連復(fù)發(fā)價(jià)值

王 青 黃先華 謝 蓉 劉 婷

湖北省宜昌市夷陵區(qū)婦幼保健院(443000)

宮腔鏡下宮腔黏連分離術(shù)是目前臨床治療宮腔黏連的主要治療手段，可在直視下切除或分離宮腔黏連，但部分患者術(shù)后會(huì)再?gòu)?fù)發(fā)[1]。研究表明，微小RNA-543(miR-543)參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，且對(duì)宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及侵襲有重要作用[2]；微小RNA-135a(miR-135a)與宮頸疾病密切相關(guān)，可參與調(diào)控宮頸癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、糖代謝及下游分子機(jī)制[3]。miR-543、miR-135a在宮頸癌中的研究較多，但二者與宮腔黏連關(guān)系還有待進(jìn)一步探究。因此，本研究探討宮腔鏡下宮腔黏連分離術(shù)后患者血清miR-543、miR-135a水平與復(fù)發(fā)關(guān)系，為臨床預(yù)防宮腔再黏連提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年12月—2020年12月于本院行宮腔鏡下宮腔黏連分離術(shù)的127例宮腔黏連患者為研究對(duì)象，隨訪術(shù)后3個(gè)月經(jīng)周期后月經(jīng)第3～7 d，根據(jù)復(fù)查再次黏連情況分為復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合宮腔黏連診斷標(biāo)準(zhǔn)，且III-IV度[4]；②病例資料及影像學(xué)信息完整；③無(wú)宮腔鏡手術(shù)禁忌；④簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有凝血功能障礙、惡性腫瘤；②術(shù)后未遵從醫(yī)囑規(guī)律用藥；③合并肝腎功能不全及感染性疾病；④1個(gè)月內(nèi)有重大手術(shù)史。收集并整理患者一般資料，主要包括年齡、病程、孕次、術(shù)前月經(jīng)狀況、手術(shù)時(shí)間、宮腔黏連部位、人工流產(chǎn)次數(shù)。本研究經(jīng)院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器

miRNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Life公司；TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自哈爾濱新?；驒z測(cè)有限公司；miScriptSYBR Green qPCR Kit購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；Rox reference dye購(gòu)自武漢純度生物科技有限公司。qRT-PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司；宮腔鏡(26003BA)購(gòu)自德國(guó)STORZ公司。

1.3 治療方法

采用宮腔鏡進(jìn)行手術(shù)治療(5%葡萄糖溶液為膨?qū)m液)。患者取膀胱截石位。麻醉后采用宮頸擴(kuò)張棒擴(kuò)張宮頸，直至宮頸擴(kuò)張器深入，確定宮頸黏連程度、部位、類(lèi)型。宮腔鏡視野下采用微型剪鉗分離，直至宮腔形態(tài)正常，術(shù)后宮腔內(nèi)置O型宮內(nèi)節(jié)育器，常規(guī)抗炎并采用雌、孕激素治療。

1.4 血清miR-543、miR-135a檢測(cè)

采集患者術(shù)后24 h晨空腹靜脈血，分別采用miRNA提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒提取血清總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)儀擴(kuò)增目的基因miR-543、miR-135a和內(nèi)參U6。反應(yīng)體系：cDNA模板(50 ng/μl)1 μl，上下游引物(10 μM)各0.4 μl，miScriptSYBR Green qPCR Mix(2×)5 μl，Rox reference dye(50×)0.2 μl，ddH2O 3.0 μl，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：95℃ 15 min；94℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，采用2-ΔΔCT法計(jì)算血清中miR-543、miR-135a相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后復(fù)發(fā)情況

復(fù)發(fā)組34例，年齡(35.1±11.5)歲(22～47歲)，未復(fù)發(fā)組93例，年齡(35.4±11.1)歲(22～48歲)。兩組年齡、孕次、術(shù)前月經(jīng)狀況、手術(shù)時(shí)間、宮腔黏連部位、人工流產(chǎn)次數(shù)比較無(wú)差異(均P>0.05)，病程有差異(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.2 血清miR-543、miR-135a水平

復(fù)發(fā)組血清miR-135a(1.46±0.29)高于未復(fù)發(fā)組(1.02±0.23)，miR-543(0.64±0.19)低于未復(fù)發(fā)組(0.99±0.21)(t=8.879、8.523，均P=0.000)。Pearson法分析顯示，復(fù)發(fā)組血清miR-543與miR-135a水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.539，P<0.05)。

2.3 血清miR-543、miR-135a水平預(yù)測(cè)宮腔鏡治療后宮腔黏連復(fù)發(fā)的價(jià)值

ROC曲線分析顯示，血清miR-543、miR-135a預(yù)測(cè)宮腔鏡治療后宮腔黏連復(fù)發(fā)的曲線下面積(AUC)分別為0.897(95%CI: 0.843～0.950)、0.864(95%CI: 0.790～0.937)，截?cái)嘀捣謩e為0.854、1.293，特異性分別為76.3%、92.5%，敏感度分別為91.2%、70.6%；二者聯(lián)合預(yù)測(cè)的AUC為0.947(95%CI: 0.907～0.987)，特異性為88.2%，敏感度為94.1%。

2.4 影響宮腔鏡治療后宮腔黏連復(fù)發(fā)的因素分析

將宮腔鏡治療宮腔黏連后是否復(fù)發(fā)作為因變量，以miR-543、miR-135a、年齡、病程、孕次、術(shù)前月經(jīng)狀況、手術(shù)時(shí)間、宮腔黏連部位、人工流產(chǎn)次數(shù)為自變量進(jìn)行單因素logistic回歸分析；再以單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的miR-543、miR-135a、病程為自變量行多因素logistic回歸分析。結(jié)果顯示，miR-135a是影響宮腔鏡治療宮腔黏連后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，miR-543是復(fù)發(fā)保護(hù)因素(P<0.05)。見(jiàn)表3、表4。

表3 影響宮腔鏡治療后宮腔黏連復(fù)發(fā)的單因素logistic回歸分析

表4 影響宮腔鏡治療宮腔黏連后再?gòu)?fù)發(fā)的多因素logistic回歸分析

3 討論

宮腔黏連又稱(chēng)為Asherman綜合征，是各種因素造成子宮內(nèi)壁黏連而形成的纖維組織增生性疾病[5]。宮腔黏連可導(dǎo)致患者月經(jīng)減少、閉經(jīng)、早產(chǎn)、流產(chǎn)甚至不孕[6]。盡管目前宮腔鏡下宮腔黏連分離術(shù)日益成熟、臨床應(yīng)用較為普遍，但術(shù)后再黏連的發(fā)生仍不可避免[7]。以往研究中影響宮腔黏連患者術(shù)后療效的危險(xiǎn)因素主要集中于宮腔黏連性質(zhì)、患者病程等方面[8]，關(guān)于生物學(xué)指標(biāo)與術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)性研究較少。

miRNA為小分子非編碼RNA，可參與調(diào)控基因表達(dá)，并在細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[9]。miR-543的功能和表達(dá)有一定的組織特異性，在許多腫瘤中表達(dá)上調(diào)且發(fā)揮致癌作用[10]，但在子宮內(nèi)膜癌及子宮內(nèi)膜異位相關(guān)不孕癥患者中呈低表達(dá)[11]。miR-135a參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，且起到原癌基因或抑癌基因的作用[12-13]。Petracco等[14]研究表明，miR-135a可能影響子宮內(nèi)膜功能，影響胚胎著床。

本研究結(jié)果顯示，宮腔鏡治療后宮腔黏連復(fù)發(fā)患者的血清miR-543水平低于未復(fù)發(fā)患者，miR-135a高于未復(fù)發(fā)患者，二者呈負(fù)相關(guān)且均是術(shù)后再?gòu)?fù)發(fā)的影響因素。提示miR-543低表達(dá)、miR-135a高表達(dá)可能與宮腔黏連術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)。Liu等[15]研究結(jié)果表明，嚴(yán)重宮內(nèi)黏連患者miR-543及其相應(yīng)靶基因表達(dá)下調(diào)，miR-135a-3p表達(dá)上調(diào)，與本研究趨勢(shì)一致?；谀壳把芯浚琺iR-543、miR-135a均對(duì)子宮內(nèi)膜容受性有明顯影響[11,14]。本研究推測(cè)miR-543、miR-135a異常表達(dá)可能通過(guò)相互作用影響體內(nèi)纖維組織增生，進(jìn)而造成子宮內(nèi)膜基底層損傷后愈合發(fā)生異常，最終宮腔黏連形成并進(jìn)一步加重，子宮內(nèi)膜容受性發(fā)生改變，發(fā)生不良預(yù)后。本文分析，患者術(shù)后血清miR-543、miR-135a預(yù)測(cè)宮腔鏡治療后宮腔黏連復(fù)發(fā)，miR-543預(yù)測(cè)價(jià)值略高于miR-135a，但miR-135a預(yù)測(cè)時(shí)特異性較高達(dá)92.5%；且miR-543聯(lián)合miR-135a的AUC、敏感度均高于單獨(dú)指標(biāo)檢測(cè)。提示臨床，可考慮將二者聯(lián)合作為預(yù)測(cè)宮腔鏡治療后宮腔黏連復(fù)發(fā)的參考指標(biāo)，當(dāng)miR-543≤0.854、miR-135a≥1.293時(shí)提示患者再?gòu)?fù)發(fā)的概率更大。

綜上所述，血清miR-543低表達(dá)、miR-135a高表達(dá)對(duì)宮腔黏連患者宮腔鏡下宮腔黏連分離術(shù)后復(fù)發(fā)均有重要影響，可作為輔助指標(biāo)預(yù)測(cè)、評(píng)估患者預(yù)后；有效控制宮腔黏連患者術(shù)后血清miR-543、miR-135a水平，可能有助于預(yù)防再黏連發(fā)生。但作為回顧性研究，本研究無(wú)法完全排除病例選擇的偏倚因素，尚需加大樣本量進(jìn)行前瞻性研究，同時(shí)需開(kāi)展動(dòng)物或細(xì)胞學(xué)研究以進(jìn)一步證實(shí)作用機(jī)制。