預(yù)測類固醇抵抗性哮喘的生物標(biāo)志物

武娟娟 李建強

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種氣道慢性炎癥性疾病,糖皮質(zhì)激素尤其是吸入激素聯(lián)合長效β2受體激動劑是目前治療哮喘的一線療法,大部分患者通過規(guī)范化治療可獲得哮喘控制，但有5%～10%的患者對這些藥物的反應(yīng)不滿意，導(dǎo)致哮喘癥狀難以控制，類固醇抵抗(SR)被認(rèn)為是糖皮質(zhì)激素治療反應(yīng)不佳的最重要原因，它們對醫(yī)療保健造成了不成比例的巨大負(fù)擔(dān)。SR定義為在適當(dāng)劑量的類固醇治療2周后，1秒內(nèi)用力呼氣量 (FEV1)改善<15%[1]。

臨床上目前缺乏準(zhǔn)確預(yù)測哮喘患者類固醇反應(yīng)性的生物標(biāo)志物，診斷基于充分類固醇治療后的臨床病史和肺功能，這導(dǎo)致患者長時間接受高劑量的類固醇，直到認(rèn)識到這對治療無效。事實上，這些患者發(fā)病的一個關(guān)鍵原因來自長期高劑量類固醇的毒副作用。這些包括對感染、骨質(zhì)疏松癥、高血糖癥和心血管疾病的易感性增加[2-3]，因此尋找能夠預(yù)測類固醇抵抗性哮喘(SRA)的無創(chuàng)性生物標(biāo)志物已成為研究熱點。早期識別SRA患者有助于提供更有效的抗炎治療，并避免與長期皮質(zhì)類固醇治療相關(guān)的潛在副作用。本文簡要總結(jié)了目前預(yù)測SRA的幾種生物標(biāo)志物，例如：維生素D結(jié)合蛋白 (VDBP)，微RNA-21(miRNA-21)，磷酸化的p38絲裂原活化蛋白激酶(p-p38 MAPK)和應(yīng)激活化蛋白激酶1(p-MSK1)，血清OX40配體(OX40L)和胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)。

VDBP

最近，人們對維生素D軸在肺病中的作用非常感興趣，其中包括維生素D(VitD)、維生素D受體(VDR)和維生素D結(jié)合蛋白(VDBP)。許多研究表明哮喘和維生素 D 之間存在聯(lián)系。維生素D是一種脂溶性維生素，除了對鈣和磷酸鹽的體內(nèi)平衡有影響，越來越多的研究表明它還是一種復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)分子。維生素 D 水平通常通過血清25-羥基維生素D3 (25-(OH)-D3)水平來衡量；因為這種形式的維生素 D 更穩(wěn)定，而維生素 D 的活性形式 1,25-二羥基維生素D3(1,25(OH)2-D3)的半衰期較短。維生素D需要通過VDR介導(dǎo)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[4]。多項研究發(fā)現(xiàn)1,25(OH)2-D3聯(lián)合糖皮[]質(zhì)激素不僅可以有效改善患者癥狀，還可以與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合發(fā)揮抗炎效果，并能在較大程度上降低糖皮質(zhì)激素的用藥量[5]。在Bassam Mahboub等人[6]的實驗中強調(diào)了 VitD 在SRA中的作用，類固醇抗性與糖皮質(zhì)激素受體 (GR-β)的表達(dá)增加有關(guān)，糖皮質(zhì)激素(GC)與細(xì)胞質(zhì)中GR結(jié)合以及 GC/GR 復(fù)合物易位到細(xì)胞核中，在細(xì)胞核中GC/GR 復(fù)合物通過直接 DNA 結(jié)合或轉(zhuǎn)錄因子失活來修飾特定基因的轉(zhuǎn)錄。GR有兩種變體，GR-α和GR-β，在 C 末端結(jié)構(gòu)域有細(xì)微的剪接差異。GR-β不能與 GC 結(jié)合，因此不能轉(zhuǎn)導(dǎo)GC誘導(dǎo)的功能。我們評估了維生素 D 缺乏的哮喘患者補充維生素 D 前后糖皮質(zhì)激素受體GR-α和GR-β的表達(dá)水平。有趣的是，校正 VitD 水平通過上調(diào) GR-α水平而不影響 GR-β水平來提高 GR-α/GR-β比率?？傊?，恢復(fù) VitD 水平可通過增強 GR-α的表達(dá)來改善哮喘患者對類固醇治療的反應(yīng)。

VDBP是一種糖基化的球蛋白，它是白蛋白基因家族的一部分，與白蛋白具有多個二硫鍵連接的三重結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)[7]。幾乎所有維生素 D 代謝物循環(huán)時都與 VDBP(對維生素 D 配體的高親和力)或血清白蛋白(對維生素 D 配體的豐度高但親和力低)結(jié)合。有研究發(fā)現(xiàn)，過量的VDBP會限制未結(jié)合的維生素D在細(xì)胞中的自由擴散，限制維生素D的活性，從而導(dǎo)致潛在的免疫后果。已有研究證明維生素D對哮喘患者具有抗炎和增強類固醇激素的作用，上述研究也表明維生素D不足可導(dǎo)致SRA的發(fā)生。另一方面，血清25-(OH)-D3的降低有可能會反過來影響血清VDBP，這可能會促進SRA患者血清VDBP的升高。目前機制尚不清楚，但這表明維生素D軸在SRA的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

循環(huán)中只有5%的VDBP與維生素D代謝物復(fù)合，這使得相當(dāng)數(shù)量的VDBP可用于其他功能。VDBP的另一主要功能與中性粒細(xì)胞趨化性和巨噬細(xì)胞活化有關(guān)[8]。最近的研究表明SRA的一種表型與中性粒細(xì)胞性炎癥有關(guān)。在重癥哮喘和SRA患者的血液循環(huán)和痰液中發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞增多。因此，我們推測血清VDBP升高誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞募集，從而引起SRA患者中性粒細(xì)胞炎癥和類固醇耐藥性。此外，前期研究發(fā)現(xiàn)VDBP的另一重要功能是轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞活化因子后誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化。肺泡巨噬細(xì)胞是哮喘氣道中最豐富的細(xì)胞類型，因此我們推測血清VDBP的增加可能通過激活SRA患者的巨噬細(xì)胞促進氣道炎癥的發(fā)生。由此我們推測，血清VDBP升高可能誘發(fā)SRA患者中性粒細(xì)胞炎癥和巨噬細(xì)胞活化，可能在SRA的發(fā)病機制中參與了慢性氣道炎癥和SR的發(fā)生。在江洪娟等[9]的一項研究中，評估了類固醇敏感性哮喘(SSA)和SRA患者血清蛋白質(zhì)組的差異， 發(fā)現(xiàn)SRA組血清VDBP水平顯著高于SSA組和對照組，證實血清VDBP升高是SRA的危險預(yù)測因子。綜上，血清 VDBP 可能是一種有用的非侵入性生物標(biāo)志物，可以預(yù)測哮喘患者的類固醇抵抗。盡管目前針對該指標(biāo)開展的臨床實驗相對較少，其在 SRA 患者中的作用未完全明確，臨床尚未應(yīng)用其評估哮喘患者是否存在類固醇抵抗，但有部分臨床研究已證實VDBP 對 SRA 患者具有潛在的臨床價值，故有必要進一步研究 VDBP 在 SRA 患者中的生物學(xué)機制。

miRNA-21

非編碼 RNA (ncRNA) 是非編碼蛋白質(zhì)的 RNA 轉(zhuǎn)錄物，特別是微RNA (miRNA)，由于它作為基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的多功能作用，最近受到越來越多的關(guān)注[10]。miRNA 通常在轉(zhuǎn)錄后階段，通過mRNA裂解和降解和/或通過抑制翻譯，以序列特異性方式負(fù)調(diào)控基因表達(dá)[11]。越來越多的證據(jù)表明，miRNAs對肺發(fā)育和維持肺無病狀態(tài)至關(guān)重要。在哮喘中研究最多的 miRNA 之一是 miRNA-21，對哮喘小鼠模型和哮喘患者的多項研究表明，miRNA-21 的上調(diào)負(fù)調(diào)節(jié) IL-12p35、組蛋白去乙?；?2 (HDAC2)，并正調(diào)節(jié)磷酸肌醇 3-激酶 (PI3K)，這可能會促進 Th2 細(xì)胞因子的表達(dá)增加并抑制 Th1 細(xì)胞因子的表達(dá)[12]。Th2/Th1失衡是哮喘重要的發(fā)病機制之一。

最近的一項研究表明，T淋巴細(xì)胞分泌的一種重要細(xì)胞因子IL-12，可能在哮喘發(fā)病機制中起重要作用。IL-12是一種來自巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的由IL-12p35和IL-12p40亞基組成的異二聚體細(xì)胞因子，也是先天免疫和適應(yīng)性免疫之間的重要聯(lián)系。有研究證實IL-12p35是miRNA-21的一個分子靶點，miRNA-21可以顯著抑制IL-12轉(zhuǎn)錄后的翻譯過程[13]。隨著miRNA-21的表達(dá)增加會導(dǎo)致IL-12表達(dá)降低。IL-12在過敏原激發(fā)之前和期間阻止了過敏原誘導(dǎo)的氣道嗜酸性粒細(xì)胞增多、氣道高反應(yīng)性、Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生和過敏原特異性血清IgE的產(chǎn)生，而它增加了干擾素-γ以及過敏氣道浸潤中CD4+T細(xì)胞凋亡增強。多項研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-21 的上調(diào)可以負(fù)調(diào)節(jié) IL-12p35，導(dǎo)致IL-12水平降低，限制其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

解釋哮喘患者相對皮質(zhì)類固醇耐藥性的最重要機制之一是HDAC2降低。HDAC2屬于HDAC家族，它主要位于細(xì)胞核內(nèi)，可以阻止RNA聚合酶Ⅱ及轉(zhuǎn)錄因子與其上的轉(zhuǎn)錄位點相結(jié)合，在抑制炎性基因的轉(zhuǎn)錄和炎性蛋白的表達(dá)中起重要作用。之前的研究表明，糖皮質(zhì)激素通過將HDAC2招募至炎性基因轉(zhuǎn)錄起始位點，使乙?；慕M蛋白去乙?；?，從而抑制炎性基因轉(zhuǎn)錄，使炎性因子表達(dá)降低。John A. Marwick等人[14]研究發(fā)現(xiàn)類固醇不敏感和HDAC2活性降低都與異常的PI3K活性有關(guān)。PI3Ks是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、代謝、增殖、葡萄糖穩(wěn)態(tài)和囊泡運輸?shù)牡鞍准易?。miRNA-21可以下調(diào)磷酸酶和緊張素同源物(PTEN)的表達(dá)， PTEN通過催化磷脂酰肌醇3,4,5-二磷酸的去磷酸化，轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇4,5-二磷酸來拮抗PI3K活性，所以哮喘患者miRNA-21增加，PI3K活性增強，它的靶蛋白是AKT，AKT是一類高強度保守性的絲氨酸蛋白激酶物質(zhì)及蘇氨酸蛋白激酶物質(zhì)。PI3K介導(dǎo)AKT的磷酸化和核易位，從而抑制HDAC2水平導(dǎo)致GR過度磷酸化，降低了由糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的各種抗炎基因的表達(dá)，從而降低了糖皮質(zhì)激素的敏感性。Richard Y. Kim等人[15]研究中發(fā)現(xiàn) miRNA-21 通過放大 PI3K 介導(dǎo)的 HDAC2 抑制來驅(qū)動嚴(yán)重的、類固醇不敏感的實驗性哮喘，因此，抑制增加的 miRNA-21 或 PI3K 反應(yīng)可抑制疾病并恢復(fù)類固醇敏感性。由此我們認(rèn)為哮喘患者血清中高的miRNA-21可以預(yù)測類固醇不敏感。Elbehidy等人[16]的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，與SSA患者相比，SRA哮喘患者血清定量表達(dá)miRNA-21水平顯著升高。Logistic回歸分析評估m(xù)iRNA-21是否能預(yù)測哮喘患者的吸入皮質(zhì)類固醇(ICS)反應(yīng)，結(jié)果示miRNA-21是ICS反應(yīng)的獨立預(yù)測因子。由此得出結(jié)論，miRNA-21 可以成為跟蹤吸入性皮質(zhì)類固醇治療反應(yīng)的有前途的生物標(biāo)志物。

P-P38 MAPK和P-MSK1

絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。在哺乳動物細(xì)胞中，有三個明確的MAPK通路:細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)通路，JUN N-末端激酶(JNK)途徑和p38途徑。p38 MAPK與哮喘的氣道炎癥相關(guān)[17]。研究報道p38 MAPK的激活與皮質(zhì)類固醇的反應(yīng)性降低有關(guān)，糖皮質(zhì)激素(GC)與糖皮質(zhì)激素受體 (GR) 結(jié)合，后者從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。GR與糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件 (GRE) 結(jié)合，并調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，包括絲裂原活化激酶磷酸酶 (MKP-1)。MKP-1 是一種磷酸酶，可選擇性地滅活磷酸化 p38 絲裂原活化激酶 (p-p38 MAPK)，從而抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[18]。據(jù)報道，在SRA患者中，IL-2和IL-4氣道表達(dá)增強，IL-2和IL-4可誘導(dǎo)p-p38 MAPK。活躍的p38 MAPK造成過度 GR 絲氨酸 226 磷酸化，從而破壞GR的核易位和DNA結(jié)合，降低GR的活性，從而導(dǎo)致相對糖皮質(zhì)激素抵抗[19]。此外，先前的研究表明，使用p-p38 MAPK 抑制劑，抑制p38 MAPK 通路激活可顯著增強地塞米松 (DEX) 誘導(dǎo)的 SRA患者對 GC 的反應(yīng)性。另一方面多項研究證實SRA的一種表型與中性粒細(xì)胞性炎癥有關(guān)，p38 MAPK可上調(diào)多種促炎細(xì)胞因子(如IL-8、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等)和趨化因子的表達(dá)， IL-8 是一種中性粒細(xì)胞趨化劑[20]。p38 還可通過上調(diào)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的表達(dá)，促進中性粒細(xì)胞釋放TNF-α[21]，引起中性粒細(xì)胞流入哮喘患者氣道，從而導(dǎo)致激素不敏感。最近的證據(jù)也支持p38 MAPK在嚴(yán)重哮喘患者SR中的關(guān)鍵作用。與激素敏感性哮喘相比，激素抵抗性哮喘患者外周血單個核細(xì)胞(PBMC)中p-p38 MAPK水平顯著升高，導(dǎo)致直接p38 MAPK下游激酶應(yīng)激激活蛋白激酶-1(MSK1)的磷酸化水平也升高。

MSK1是一種直接位于 p38 下游的激酶，可介導(dǎo)不同炎癥基因啟動子絲氨酸上組蛋白H3的磷酸化, 導(dǎo)致局部染色質(zhì)松弛，誘導(dǎo)炎癥基因轉(zhuǎn)錄。然而，糖皮質(zhì)激素會抵消炎癥基因啟動子處激活的 MSK1 的募集，從而抑制 NF-κβp65反式激活和同時發(fā)生的組蛋白 H3 磷酸化。核因子 κB (NF-κB) 是參與免疫和炎癥反應(yīng)的多種基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一。NF-κB 是一種二聚體，包含一個 p65 和一個 p50 亞基，其中前者具有反式激活功能。NF-κβp65在S276位點被MSK1磷酸化對炎癥基因表達(dá)的正常啟動至關(guān)重要。GR 和 MSK1 相互作用的一個例子是 MSK1 主要定位在細(xì)胞核中，然而，激活的 GR 可以將MSK1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，從而抑制 MSK1 對其下游靶標(biāo)的作用。有研究檢測到激活的 MSK1 的增加與 SRA外周血單核細(xì)胞(PBMC)中p-p38 的增加平行，表明 MSK1 可能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞類固醇反應(yīng)。Ling-bo Li等人[22]研究也發(fā)現(xiàn)，與SSA患者相比，在來自SRA患者的PBMC裂解物中檢測到顯著更高的p-p38 和p-MSK1 水平。而SRA患者的 PBMC 中的 ERK 和 JNK 磷酸化并不顯著或呈陰性，該數(shù)據(jù)表明p-p38和p-MSK1可作為預(yù)測類固醇抵抗性哮喘的生物標(biāo)志物。

OX40L和TSLP

OX40 配體 (OX40L) 及其受體 OX40是腫瘤壞死因子受體超家族的成員[23]。OX40L主要表達(dá)于B淋巴細(xì)胞、樹突細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。OX40、OX40L在哮喘患者氣道固有層表達(dá)增加，促進幼稚T細(xì)胞極化，產(chǎn)生大量Th2細(xì)胞因子，如IL-4、IL-5、IL-13。這些細(xì)胞因子誘導(dǎo) B 細(xì)胞 (IL-4)、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤 (IL-5) 和杯狀細(xì)胞增生 (IL-13) 的 IgE 類別轉(zhuǎn)換。這些機制促使維持高IgE水平、炎癥細(xì)胞組織浸潤、嗜酸性粒細(xì)胞增多、粘液釋放和平滑肌收縮，導(dǎo)致嚴(yán)重過敏癥狀[24]。哮喘患者外周血單核細(xì)胞 (PBMCs) OX40 和 OX40L 蛋白水平顯著升高, 與 T 細(xì)胞增殖能力增強有關(guān)。氣道固有層和 PBMC 中升高的 OX40L 可以釋放到循環(huán)中，所以哮喘患者的血清 OX40L 升高。Su-li Ma等人研究[25]得出，哮喘患者的血清 OX40L 水平顯著高于健康對照組，而SRA的血清 OX40L 水平高于SSA。ICS治療降低了血清 OX40L 水平，SSA 中血清 OX40L 的降低比 SRA 更顯著。研究證實了血清 OX40L 是 SRA 的獨立風(fēng)險預(yù)測因子。因此我們推測OX40L可能參與了糖皮質(zhì)激素抵抗的發(fā)病機制。這些結(jié)果表明，血清OX40L可能是一種有用的無創(chuàng)便捷指標(biāo)，可作為識別皮質(zhì)類固醇耐藥哮喘患者的生物標(biāo)志物。但其中存在一些問題，針對該指標(biāo)的大部分的臨床研究為回顧性的，依賴于冷凍血清和醫(yī)療記錄。目前需要進行大量的前瞻性研究來進一步證實血清 OX40L在SRA患者中的臨床應(yīng)用價值。

除此之外，在上述研究中，與 SSA 和對照組相比，SRA 患者的血清胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)水平顯著更高，并且與血清 OX40L 呈正相關(guān)。TSLP 是一種由受損上皮細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，可刺激樹突細(xì)胞成熟并誘導(dǎo) Th2 介導(dǎo)的炎癥[26]。OX40L 參與 TSLP 驅(qū)動的特應(yīng)性炎癥和病理性 Th2 免疫反應(yīng)。TSLP 可以激活樹突細(xì)胞(DCs)并促進 T 濾泡輔助細(xì)胞從幼稚 CD4+T 細(xì)胞分化，這取決于OX40L[27]。因此，形成了 TSLP-DC-OX40L 通路，通過增加炎癥細(xì)胞因子和減少 CD4+CD25+Treg 細(xì)胞來促進氣道炎癥和哮喘發(fā)病[28]。TSLP 可以誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞趨化和延遲凋亡，表明其在過敏性炎癥中的潛在作用。除了嗜酸性粒細(xì)胞炎癥，TSLP還在中性粒細(xì)胞氣道炎癥中發(fā)揮作用[29]。最近的一份報告表明，TSLP 可能是哮喘皮質(zhì)類固醇抵抗的重要因素。與健康對照相比，哮喘患者支氣管肺泡灌洗液 (BAL) 中的 TSLP 升高， TSLP 可消除地塞米松對 ILC2 細(xì)胞中 2 型細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制作用誘導(dǎo)類固醇抵抗[30]。此外，Kabata H.等人[31]的研究也發(fā)現(xiàn)TSLP 可通過控制 STAT5 磷酸化和 BCL-XL 表達(dá)，在自然輔助細(xì)胞(NH細(xì)胞)中發(fā)揮皮質(zhì)類固醇抵抗作用。同時，鑒于TSLP還位于OX40L的上游，我們推測TSLP也可作為預(yù)測哮喘患者類固醇反應(yīng)性的血清標(biāo)志物。

展望和總結(jié)

哮喘是研究最多的類固醇難治性疾病。SRA患者通常有持續(xù)的氣道炎癥、長時間的高劑量 ICS 治療和不必要的副作用[32]。由于全球哮喘患病率的增加，SR 已成為一個具有挑戰(zhàn)性的健康問題，從而導(dǎo)致高成本的哮喘護理。因此，尋找敏感的無創(chuàng)性生物標(biāo)志物來早期識別 SRA 患者對于提供有效的個性化治療和避免哮喘患者的相關(guān)副作用非常重要。本文總結(jié)了VDBP、miRNA-21、p-p38 MAPK和p-MSK1、OX40L和TSLP這些生物標(biāo)志物作為哮喘患者ICS反應(yīng)的預(yù)測因子，有助于決策和確定可能或不可能接受ICS治療的患者。它會減少無效治療，并使患者免受治療失敗的失望。

總之，雖然在一小部分哮喘患者中觀察到糖皮質(zhì)激素抵抗，但它代表了一個嚴(yán)重的臨床和社會經(jīng)濟問題。在其他炎癥性疾病(如慢性阻塞性肺疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和炎癥性腸病)中同樣觀察到類似的不敏感，發(fā)生率更高。因此需要有早期識別和篩選不敏感性的生物標(biāo)志物，這樣才能更好地研究哮喘中 GC 不敏感相關(guān)的多種機制可以為其他炎癥性疾病提供可轉(zhuǎn)移的知識。針對不同的機制盡早為類固醇反應(yīng)不佳的患者找到有效的最佳治療方案。