血清細(xì)胞色素C可作為慢性阻塞性肺疾病細(xì)胞損傷凋亡的生物標(biāo)志物

張佑揚(yáng) 朱述陽 朱潔晨 施斌 王小雨

慢性阻塞性肺疾病(COPD)屬于一種氣道慢性炎癥性氣流受限性疾病。其患病率、發(fā)病率及死亡率逐年上升，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)負(fù)擔(dān)[1]。研究發(fā)現(xiàn)肺組織細(xì)胞過度凋亡在COPD的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[2]。細(xì)胞色素C(Cytc)是細(xì)胞凋亡事件中的關(guān)鍵物質(zhì)。正常情況下，Cytc在線粒體內(nèi)介導(dǎo)呼吸鏈的電子轉(zhuǎn)移，而當(dāng)細(xì)胞發(fā)生損傷時(shí)，Cytc可大量進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，引起細(xì)胞凋亡[3]。同時(shí)，Cytc可作為一種線粒體損傷相關(guān)分子模式(mtDAMPs)引起機(jī)體炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體病變[4-6]。外周血Cytc水平可作為反映機(jī)體病理嚴(yán)重程度的臨床生物標(biāo)志物。但Cytc與COPD之間的關(guān)系尚不明確，因此本研究旨在分析COPD患者血清Cytc水平的變化，探討其在COPD診療中的意義，為臨床決策提供一定的依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料

選取2021年6月至2022年2月就診于南京鼓樓醫(yī)院集團(tuán)宿遷醫(yī)院門診的穩(wěn)定期COPD患者(sCOPD組)36例，同期因急性加重而住院的COPD患者(AECOPD組)39例，選擇同時(shí)期健康體檢人員(NORMAL組)28例為對(duì)照組。三組患者基本資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性(見表1)。本研究取得了所有入組研究對(duì)象的知情同意，已獲得南京鼓樓醫(yī)院集團(tuán)宿遷醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(2021020)。

1 sCOPD組及AECOPD組納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡40～80歲；②既往有吸煙史，戒煙半年以上；③符合2021中華醫(yī)學(xué)會(huì)《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2021年修訂版)》[7]的診斷標(biāo)準(zhǔn)。④sCOPD組入組前4周內(nèi)無病情惡化的表現(xiàn)。NORMAL組納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡40～80歲；②既往吸煙史，戒煙半年以上；③不服用任何藥物，無其他器官及系統(tǒng)疾病。

2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在其他肺部疾病，如支氣管擴(kuò)張、肺癌、肺結(jié)核、肺纖維化、肺炎、塵肺病等；②合并其他系統(tǒng)疾病，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等結(jié)締組織病，糖尿病，炎性腸病，腫瘤，心力衰竭、冠心病、心臟瓣膜病等心臟疾病，腎功能不全；③長(zhǎng)期服用藥物，如糖皮質(zhì)激素。

二、血液指標(biāo)測(cè)定

采集三組受試者清晨空腹肘靜脈血3～5 mL，經(jīng)3000轉(zhuǎn)離心10 min，取上層血清保存于-80℃冰箱待檢。采用ELISA法測(cè)定血清Cytc，試劑盒購買于上海富雨生物科技有限公司，嚴(yán)格遵循試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。CRP采用beckman coulter AU5800生化儀測(cè)定。在呼吸空氣條件下，采集受試者橈動(dòng)脈血1 mL，采用動(dòng)脈血?dú)夥治鰞x(德國(guó)羅氏診斷公司，cobas b 123 POC系統(tǒng)，軟件版本4.16)檢測(cè)PaO2。采集受試者肘靜脈血2～3 mL，采用sysmex xn-2000血細(xì)胞分析儀檢測(cè)NEUT。

三、肺功能測(cè)定

由取得資質(zhì)的醫(yī)務(wù)人員使用Masterscope肺功能儀(德國(guó)耶格公司)測(cè)定三組患者的FEV1/FVC以及FEV1%pred。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、三組間一般資料的比較

三組間性別構(gòu)成、年齡、BMI、吸煙指數(shù)、病程相比無顯著差異(P>0.05)(見表1)。

表1 各組患者一般臨床資料比較

二、三組間血清Cytc水平比較

AECOPD組高于sCOPD組，sCOPD組高于NORMAL組(P<0.05)(見表2)。

三、三組間NEUT、CRP、FEV1%pred、PaO2水平比較

NEUT、CRP水平比較，AECOPD組高于sCOPD組，sCOPD組高于NORMAL組(P<0.05)。FEV1%pred、PaO2水平比較，AECOPD組低于sCOPD組，sCOPD組低于NORMAL組(P<0.05)(見表2)。

四、AECOPD組中及sCOPD組中FEV1%pred≥50%和FEV1%pred<50%的患者血清Cytc水平比較

兩組中，F(xiàn)EV1%pred<50%的患者血清Cytc水平均高于FEV1%pred≥50%的患者血清Cytc水平(P<0.05)(見表3)。

表3 根據(jù)FEV1%pred分組對(duì)血清Cytc水平比較

五、sCOPD組及AECOPD組中血清Cytc分別與NEUT、CRP、FEV1pred%、PaO2相關(guān)性的分析

兩組中，血清Cytc水平與NEUT、CRP水平均呈正相關(guān)(P<0.05)，與FEV1%pred、PaO2水平均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)(見圖1～8)。

圖1 AECOPD組：Cytc(nmol/L)與 CRP(mg/L)水平呈正相關(guān)(r=0.849，P<0.001)

圖2 AECOPD組：Cytc(nmol/L)與 NEUT(×109/L)水平呈正相關(guān)(r=0.781，P<0.001)

圖3 AECOPD組：Cytc(nmol/L)與 FEV1%pred(%)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.819，P<0.001)

圖4 AECOPD組：Cytc(nmol/L)與 PaO2(mmhg)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.726，P<0.001)

圖5 sCOPD組：Cytc(nmol/L)與 CRP(mg/L)水平呈正相關(guān)(r=0.771，P<0.001)

圖6 sCOPD組：Cytc(nmol/L)與 NEUT(×109/L)水平呈正相關(guān)(r=0.806，P<0.001)

圖7 sCOPD組：Cytc(nmol/L)與 FEV1%pred(%)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.748，P<0.001)

圖8 sCOPD組：Cytc(nmol/L)與 PaO2(mmhg)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.559，P<0.001)

討 論

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種常見的、可防可治的氣道慢性炎癥疾病，表現(xiàn)為持續(xù)存在的呼吸道癥狀和氣流受限[1]，嚴(yán)重影響了患者的身體健康和生活質(zhì)量。COPD在我國(guó)高度流行，40歲以上成人患病率在10年間增長(zhǎng)了約67%[7]，我國(guó)的COPD防治形勢(shì)嚴(yán)峻。AECOPD是COPD的急性加重狀態(tài)，可導(dǎo)致穩(wěn)定期COPD患者肺功能下降、病情進(jìn)展，極大的增加了患者的醫(yī)療支出，是導(dǎo)致COPD患者死亡的重要原因[8]。因此早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療及合理用藥顯得尤為重要。然而，目前尚無客觀有效的生物學(xué)指標(biāo)診斷COPD，以及評(píng)估病情狀態(tài)。

COPD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中，細(xì)胞過度凋亡是其發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制[2]。COPD患者機(jī)體氧化應(yīng)激增強(qiáng)、炎細(xì)胞活化并增多、炎癥因子和趨化因子增加以及蛋白酶和抗蛋白酶失衡[9]，這些因素相互促進(jìn)、共同作用，引起肺組織細(xì)胞損傷及凋亡增加、肺結(jié)構(gòu)損害，最終引起肺功能異常[10]。Cytc在細(xì)胞凋亡途徑中發(fā)揮著重要的作用。人Cytc是由104個(gè)殘基組成的單鏈大分，由三個(gè)大的和兩個(gè)小的α螺旋組成[11]。正常情況下在線粒體內(nèi)外膜之間參與呼吸鏈電子轉(zhuǎn)移，但當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)，Cytc從線粒體大量釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，通過激活下游的凋亡因子而引起細(xì)胞凋亡[3]。外周血Cytc水平是判斷細(xì)胞損傷凋亡情況、評(píng)估病情嚴(yán)重程度及判斷預(yù)后的重要指標(biāo)。Cosentino N.等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)術(shù)前，可檢測(cè)到血清Cytc的ST 段抬高型心肌梗死(STEMI)患者的心功能更嚴(yán)重，預(yù)后更差，檢測(cè)血清Cytc有助于早期識(shí)別高危患者，指導(dǎo)早期的治療。李寧[13]等研究提示，血清Cytc水平在膿毒血癥患者中顯著升高，可作為評(píng)價(jià)膿毒血癥患者感染程度、病情嚴(yán)重性及治療效果的重要指標(biāo)。在造影劑腎病(CIN)方面，Tang C.等[14]研究發(fā)現(xiàn)，外周血高水平的Cytc與CIN發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加顯著相關(guān)，是CIN發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可作為STEMI患者PCI術(shù)前預(yù)測(cè) CIN 的標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)，AECOPD組及sCOPD組血清Cytc水平高于NORMAL組，AECOPD組高于sCOPD組，提示COPD患者肺組織細(xì)胞損傷凋亡增加，AECOPD患者更顯著，表明血清Cytc水平可作為判斷COPD患者病情活動(dòng)性的生物學(xué)指標(biāo)。

FEV1是反映小氣道氣流受限的一個(gè)重要參數(shù)，而FEV1%pred是COPD氣流受限嚴(yán)重程度的分級(jí)依據(jù)[1]，F(xiàn)EV1%pred越低，病情越重，預(yù)后越差。高云等[15]研究發(fā)現(xiàn)，隨著FEV1%pred逐漸降低，AECOPD患者體內(nèi)炎癥及氧化應(yīng)激水平逐漸增高，且呈正相關(guān)。錢建德等[16]研究顯示肺功能越差的COPD患者機(jī)體免疫力越低。何國(guó)慶等[17]發(fā)現(xiàn)，存活組的AECOPD患者入院時(shí)FEV1%pred水平明顯高于死亡組，且與患者預(yù)后呈正相關(guān)。PaO2隨著COPD患者病情加重而降低，與病情的嚴(yán)重程度相關(guān)[18]。王述紅等[19]研究表明，F(xiàn)EV1%pred越低的COPD患者，PaO2亦越低，CAT評(píng)分越高，AECOPD組中PaO2低于穩(wěn)定期COPD組，而CAT評(píng)分高于穩(wěn)定組，PaO2與CAT評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。與上述研究一致，本研究中AECOPD組及sCOPD組FEV1%pred、PaO2水平低于NORMAL組，AECOPD組低于sCOPD組。并且在AECOPD組中及sCOPD組中，F(xiàn)EV1%pred<50%組的血清Cytc水平均高于FEV1%pred≥50%組。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，AECOPD組及sCOPD組血清Cytc水平與FEV1%pred、PaO2成負(fù)相關(guān)。說明肺功能越差、缺氧越嚴(yán)重的COPD患者，其外周血Cytc水平越高，肺組織細(xì)胞損害凋亡越嚴(yán)重，血清Cytc水平可作為反映COPD患者病情嚴(yán)重程度的標(biāo)志物。

CRP是由肝臟合成的一種急性期蛋白，在大多數(shù)感染、炎癥、腫瘤或組織損傷等情況下都會(huì)升高，當(dāng)CRP與細(xì)菌或損傷的細(xì)胞結(jié)合時(shí)可引起機(jī)體的炎癥防御反應(yīng)[20]。Fermont J.M.等[21]進(jìn)行一項(xiàng)薈萃分析表明，在至少 6 個(gè)月的隨訪期間，高基線水平的CRP與穩(wěn)定期 COPD 患者過早死亡、病情惡化的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)及相關(guān)住院風(fēng)險(xiǎn)增高有關(guān)。而李小龍[22]研究發(fā)現(xiàn)，CRP在AECOPD患者中顯著升高，且呼吸衰竭組高于非呼吸衰竭組，可作為反映AECOPD患者病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)。中性粒細(xì)胞炎癥是COPD的重要特征，持續(xù)存在的中性粒細(xì)胞性炎癥可引起肺組織損傷從而促進(jìn)COPD的發(fā)展，而在急性加重期中性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，進(jìn)一步加劇了肺組織的損害[23]。本研究結(jié)果顯示，AECOPD組及sCOPD組CRP、NEUT水平高于NORMAL組，AECOPD組高于sCOPD組，并且血清Cytc水平與CRP、NEUT水平成正相關(guān)。表明COPD患者體內(nèi)炎癥水平高，在急性加重期時(shí)更明顯，Cytc可作為反映COPD患者機(jī)體炎癥水平的指標(biāo)，可能參與了COPD的進(jìn)程。推測(cè)可能的機(jī)制為：在COPD發(fā)病機(jī)制的作用下，肺組織細(xì)胞發(fā)生線粒體損傷、過度凋亡，因吞噬細(xì)胞吞噬功能缺陷[24]，導(dǎo)致大量損傷凋亡的細(xì)胞不能被及時(shí)清除，過多的Cytc釋放到細(xì)胞外，作為一種mtDAMPs激活中性粒細(xì)胞[4]，引起肺組織炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致肺組織損傷、肺功能障礙。

本研究的不足之處在于樣本量偏少，可能存在一定的偏倚。并且未對(duì)住院期間AECOPD患者血清Cytc水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，來進(jìn)一步分析血清Cytc水平與病情變化之間的關(guān)系。未對(duì)AECOPD的預(yù)測(cè)價(jià)值進(jìn)行分析。納入的對(duì)象無危重癥患者，其對(duì)COPD患者的預(yù)后價(jià)值有待進(jìn)一步研究。

總之，細(xì)胞過度凋亡在COPD的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。血清Cytc水平不僅可反映COPD患者肺組織細(xì)胞損傷及凋亡狀況，也反映了COPD患者機(jī)體的炎癥水平，有助于對(duì)COPD患者疾病活動(dòng)狀態(tài)、病情嚴(yán)重程度的判斷，從而為臨床的決策提供一定的參考價(jià)值。并且未來通過對(duì)COPD患者肺組織細(xì)胞凋亡機(jī)制的進(jìn)一步研究，為COPD患者的治療開辟一條新路徑。