兒茶乙酸乙酯萃取物治療大鼠變應(yīng)性鼻炎的病理形態(tài)學(xué)研究

金建波，盧浙文，呂建森，俞余，沈雅君

變應(yīng)性鼻炎（AR）是一種以免疫球蛋白E（IgE）為基礎(chǔ)的慢性鼻咽炎癥[1]，好發(fā)于兒童和青少年，全世界發(fā)病率呈持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)[2]。目前治療AR的傳統(tǒng)抗過敏藥物僅能起到暫時(shí)緩解癥狀的作用，停藥后易復(fù)發(fā)，甚至可能會(huì)引起不同程度的不良反應(yīng)，如長(zhǎng)期倍他米松滴鼻易引起庫(kù)欣綜合征，抗組胺藥易引起中樞神經(jīng)反應(yīng)如嗜睡，白三烯調(diào)節(jié)劑可能對(duì)情緒有害，且與自殺有關(guān)等。中藥兒茶學(xué)名孩兒茶，為豆科植物落葉小喬木兒茶的枝干煎汁濃縮而成的干燥浸膏，具有強(qiáng)大的抗炎作用[3]。關(guān)于兒茶治療鼻炎早在《本草權(quán)度》中就有詳細(xì)記載：鼻淵流水：孩兒茶末，吹之，良?，F(xiàn)代學(xué)者應(yīng)用兒茶粉與凡士林混合外用治療慢性鼻炎的，有效率達(dá)94%[4]。然而，中藥兒茶治療AR的具體藥理作用機(jī)制卻知之甚少，在一定程度上限制其在臨床上的使用和推廣。因此，本文擬建立AR模型，觀察兒茶乙酸乙酯萃取物對(duì)AR大鼠后鼻黏膜嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和血管通透性的病理形態(tài)學(xué)影響。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料SPF級(jí)SD大鼠[浙江省維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0001]20只，體質(zhì)量142～160 g。飼養(yǎng)環(huán)境：恒溫，溫度（22±2）℃，濕度50%～60%，光照每12小時(shí)明暗交替。按隨機(jī)數(shù)字法分為實(shí)驗(yàn)組和模型組。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器酶標(biāo)儀（CMaxPlus，MD，美國(guó)）、低溫高速離心機(jī)（Micro 17R，Thermo，美國(guó)）、超聲波清洗機(jī)（SB-5200D，寧波新芝生物科技股份有限公司，中國(guó)）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑兒茶（云南，寧波濟(jì)康藥業(yè)有限公司），卵白蛋白（ovalbumin，OVA）、氫氧化鋁（sigma，美國(guó)），伊文思藍(lán)（Evans blue，EB）[生工生物工程（上海）股份有限公司，上海]，甲酰胺、變色酸2R（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國(guó)），蘇木素溶液、伊紅（醇溶）（北京索萊寶科技有限公司，北京），甲苯胺藍(lán)（上海麥克林生化科技有限公司，上海）。

1.3 兒茶提取兒茶藥材經(jīng)本院中藥房中藥師鑒定為豆科植物兒茶Acacia catechu（L.f.）Willd的去皮枝干所得的干燥煎膏，用80%乙醇超聲提取，重復(fù)3次，每次30 min，乙醇提取液減壓濃縮得兒茶浸膏，然后用適量水混懸，依次用3倍體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取6次，留乙酸乙酯萃取液部分，真空干燥至恒重，得兒茶乙酸乙酯萃取物粗品粉末，用于AR治療。給藥前，加純化水配制成濃度為10 mg/ml。

1.4 AR建模[5]及給藥（1）基礎(chǔ)致敏：用30 mg OVA作抗原，氫氧化鋁粉末3 g作佐劑，加0.9%氯化鈉注射液100 ml制成混懸液，每只大鼠腹腔注射1 ml，隔天1次，共7次。（2）鼻激發(fā)試驗(yàn)：配制2%OVA 0.9%氯化鈉注射液，滴入雙側(cè)鼻腔，每側(cè)0.05 ml，1次/d，共7次。造模成功后，給予1 g/L OVA滴鼻以維持對(duì)鼻黏膜的刺激，每側(cè)鼻腔0.05 ml，隔天1次，共10次。本模型持續(xù)42 d。模型制作成功標(biāo)準(zhǔn)[6]：（1）噴嚏，一次連續(xù)3～9個(gè)為1分，10～14個(gè)為2分，≥15個(gè)為3分。（2）鼻癢，搔鼻2～3次為1分，3～5次為2分，5次以上為3分。（3）流涕，流至鼻孔為1分，超過前鼻孔為2分，流涕滿面為3分。記錄結(jié)果以疊加法計(jì)總分，總分（a+b+c）≥5分表示AR動(dòng)物模型建立成功。觀察時(shí)間為每次給藥后10 min內(nèi)，計(jì)算各組給藥后AR癥狀評(píng)分。造模成功后，實(shí)驗(yàn)組給予兒茶乙酸乙酯萃取物灌胃100 mg·kg1·次1，2次/d，連續(xù)給藥14 d。模型組不作任何處理，自由生長(zhǎng)。

1.5 組織取材大鼠于末次給藥后，頸椎脫臼迅速處死后斷頭并剝除上頜骨骨部皮膚，將上頜骨從顱骨中游離，取鼻中隔黏膜組織，置于4%多聚甲醛溶液中，固定24 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋。于石蠟切片機(jī)上，做連續(xù)切片，片厚4 m，隔4張取一片，用于HE、甲苯胺藍(lán)和Chromotrope 2R染色。

1.6 EB法檢測(cè)鼻黏膜血管通透性各組大鼠于末次給藥后2 h通過尾靜脈注射2%的EB溶液（0.5ml/kg），經(jīng)血液循環(huán)后可見眼周、鼻唇、四肢、睪丸等淺表皮膚呈藍(lán)色。予以10%水合氯醛（0.4ml/100g）行腹腔注射麻醉，置于平板上仰臥固定。開胸暴露大鼠心臟，切開左心室，從左心室插管到主動(dòng)脈并固定導(dǎo)管，右心房切開引流，用0.9%氯化鈉注射液灌注沖洗血管中的EB，直至右心房無血液流出。用脊髓脫臼法迅速處死，剝除上頜骨骨部皮膚，將上頜骨從顱骨中游離出來，取鼻中隔黏膜組織，0.9%氯化鈉注射液輕輕漂洗，濾紙吸干，準(zhǔn)確稱重50 mg置于3 ml甲酰胺中，于37℃恒溫水溫箱中孵育24 h，然后以3 000 r/min離心10 min。取藍(lán)染液200 l，置于酶標(biāo)儀620 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色，測(cè)出EB的濃度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到EB濃度，并計(jì)算單位重量鼻黏膜中所含的EB的量。血管通透性以EB漏出量表示。

1.7 HE染色利用Harris氏HE染色法進(jìn)行組織染色，顯微鏡下觀察各組鼻黏膜組織病理改變。

1.8 甲苯胺藍(lán)染色法檢測(cè)鼻黏膜肥大細(xì)胞數(shù)切片置于甲苯胺藍(lán)溶液30min，水稍洗，置于1%冰醋酸溶液中分化，直至細(xì)胞核和顆粒清晰，水稍洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。于光鏡下觀察肥大細(xì)胞浸潤(rùn)情況。采用ImageJ圖像分析系統(tǒng)對(duì)鼻中隔黏膜肥大細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，每組隨機(jī)取5個(gè)切片，光鏡下觀察3個(gè)高倍視野（×400），計(jì)算均值。

1.9 Chromotrope 2R染色法檢測(cè)嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)切片放入Chromotrope 2R溶液中，浸染10 min，水稍洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。光鏡下觀察嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況。采用ImageJ圖像分析系統(tǒng)對(duì)鼻中隔黏膜嗜酸性粒細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，每組隨機(jī)取5個(gè)切片，光鏡下觀察3個(gè)高倍視野（×400），計(jì)算均值。

1.1 0統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析，采用SNK檢驗(yàn)；若符合正態(tài)分布但方差不齊，則采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；若不符合正態(tài)分布，則采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)評(píng)價(jià)經(jīng)OVA誘導(dǎo)后，所有大鼠均出現(xiàn)抓鼻、噴嚏、流涕等過敏癥狀，評(píng)分全部超過5分，提示造模成功。實(shí)驗(yàn)組AR大鼠行為學(xué)評(píng)分隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降（P＜0.05）。模型組隨時(shí)間的延長(zhǎng)，行為學(xué)評(píng)分未見明顯下降（P＞0.05）。經(jīng)兒茶乙酸乙酯萃取物口服治療后的AR大鼠行為學(xué)評(píng)分在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)要小于模型組，至治療7 d后，行為學(xué)評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

2.2 鼻黏膜血管通透性情況實(shí)驗(yàn)組EB含量明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.3 組織病理形態(tài)學(xué)觀察

2.3.1 HE染色模型組鼻黏膜可見大量上皮破壞、嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞浸潤(rùn)以及杯狀細(xì)胞增生明顯。實(shí)驗(yàn)組可見散在嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和杯狀細(xì)胞分布，上皮破壞減少，見封三彩圖4。

2.3.2 甲苯胺藍(lán)染色肥大細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含有肝素和組織胺等異色性物質(zhì)遇到甲苯胺藍(lán)可呈異染性紫紅色，模型組可見大量的肥大細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組肥大細(xì)胞陽性數(shù)明顯減少（P＜0.05），見表3。

2.3.3 Chromotrope 2R染色鼻黏膜組織中嗜酸性粒細(xì)胞的胞質(zhì)呈粉紅色，其他細(xì)胞不著色。模型組大鼠鼻黏膜組織中可見嗜酸性粒細(xì)胞增多，絕大多數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞成堆分布，細(xì)胞呈圓形，胞質(zhì)內(nèi)充滿粗大、整齊、均勻、其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見紫紅色顆粒樣物質(zhì)。與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠嗜酸性粒細(xì)胞粒細(xì)胞顯著減少（P＜0.05），見表3。

表1 各組大鼠行為學(xué)評(píng)分 分

表2 兩組大鼠鼻黏膜EB含量變化g/g

表3 各組大鼠鼻黏膜嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞計(jì)數(shù) 個(gè)

3 討論

既往研究認(rèn)為肥大細(xì)胞是AR的重要效應(yīng)細(xì)胞，在AR速發(fā)相和遲發(fā)相反應(yīng)中具有重要價(jià)值[7]。當(dāng)AR動(dòng)物吸入變應(yīng)原時(shí)，肥大細(xì)胞表面的IgE與抗原分子交聯(lián)活化肥大細(xì)胞，并誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒分泌大量組胺等貯存在肥大細(xì)胞顆粒物中的炎性介質(zhì)，引起速發(fā)相反應(yīng)，降低AR動(dòng)物鼻黏膜上皮屏障的完整性，維持上皮屏障的滲漏[8]，使毛細(xì)血管通透性增加、腺體分泌增多等病理變化[9]，誘導(dǎo)出現(xiàn)AR的鼻反應(yīng)，包括打噴嚏、瘙癢和鼻漏[10]。在參與遲發(fā)相反應(yīng)的過程中，肥大細(xì)胞募集和活化嗜酸粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞，導(dǎo)致炎性介質(zhì)的進(jìn)一步釋放，炎性反應(yīng)持續(xù)和加重，鼻黏膜出現(xiàn)明顯組織水腫導(dǎo)致鼻塞。本研究結(jié)果顯示OVA激發(fā)誘導(dǎo)AR后，肥大細(xì)胞浸潤(rùn)脫顆粒明顯，血管通透性增加，伴隨而來的AR大鼠噴嚏、抓鼻等鼻部行為學(xué)評(píng)分明顯增加，經(jīng)兒茶乙酸乙酯萃取物處理后，肥大細(xì)胞浸潤(rùn)減少，脫顆粒水平顯著抑制，并下調(diào)了血管通透性水平，使鼻過敏行為學(xué)癥狀明顯減輕，尤其是鼻摩擦。

嗜酸性粒細(xì)胞局部浸潤(rùn)是AR重要病理學(xué)特征之一[11]，其浸潤(rùn)程度與鼻部癥狀評(píng)分顯著相關(guān)[12]。本研究模型組大鼠光鏡下可見鼻黏膜嗜酸性粒細(xì)胞出現(xiàn)特征性的大量浸潤(rùn)，鼻黏膜血管通透性增加，鼻部行為學(xué)評(píng)分顯著升高，與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致。AR大鼠經(jīng)兒茶乙酸乙酯萃取物干預(yù)處理后，HE染色結(jié)果和嗜酸性粒細(xì)胞染色結(jié)果均顯出鼻黏膜嗜酸性粒細(xì)胞局部浸潤(rùn)和脫顆粒現(xiàn)象明顯減少，血管通透性降低，AR大鼠鼻部行為學(xué)特征顯著改善，這表明兒茶乙酸乙酯萃取物可能通過減少嗜酸性粒細(xì)胞局部浸潤(rùn)來改善AR鼻部癥狀。

綜上所述，兒茶乙酸乙酯萃取物對(duì)AR大鼠具有一定的治療作用，可能通過抑制肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，降低肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞脫顆粒，抑制活化而發(fā)揮作用，為臨床中藥兒茶治療鼻炎提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。中藥兒茶的主要活性成分兒茶素和表兒茶素[14]，兒茶乙酸乙酯萃取物治療AR的活性物質(zhì)可能與兒茶素類化合有相關(guān)[15]，但其相關(guān)性研究仍需進(jìn)一步深入。