GeneXpert MTB/RIF技術(shù)在臨床肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用

蔣泓宇，車洋，顧曉敏，桑國鑫，賀天鋒

感染結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病是全球面臨的熱點公共衛(wèi)生問題。WHO《2021年全球結(jié)核病年度報告》報道中國2020年新發(fā)患者數(shù)為84.2萬，估算發(fā)病率為59/10萬，居全球結(jié)核病高負擔國家第2位[1]。結(jié)核病病原學檢測對傳染源的發(fā)現(xiàn)、確診及臨床治療具有重要的意義[2]。目前，國內(nèi)臨床上檢測結(jié)核分枝桿菌（MTB）仍然是以痰涂片鏡檢、固體（液體）培養(yǎng)法等傳統(tǒng)檢測方法為主。作為WHO推薦的一種實時熒光定量核酸擴增技術(shù)，GeneXpert MTB/RIF具有操作簡便、自動化程度高及結(jié)果報告時間短等優(yōu)勢，已在國內(nèi)部分地區(qū)進行了臨床應(yīng)用[3-5]。本研究以寧波地區(qū)結(jié)核病定點醫(yī)療機構(gòu)2021年1—12月收集的1 649例疑似肺結(jié)核患者痰標本為研究對象，比較GeneXpert MTB/RIF技術(shù)與痰涂片及液體培養(yǎng)等傳統(tǒng)檢測方法在MTB檢測敏感性和特異性等方面的差異，以進一步評價GeneXpert MTB/RIF在本地區(qū)臨床肺結(jié)核診斷及利福平耐藥檢測方面的應(yīng)用價值?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2021年1—12月寧波市奉化區(qū)人民醫(yī)院門診收治的具備完整檢測信息的1 649例疑似肺結(jié)核患者痰液標本，其中男1 038例，女611例；年齡13～88歲，中位年齡35歲。臨床診斷肺結(jié)核544例，非肺結(jié)核1 105例（非結(jié)核分枝桿菌病173例）。疑似肺結(jié)核患者納入標準：咳嗽≥2周，發(fā)熱或呼吸困難，有肺結(jié)核影像學特征，有效的痰液標本（大于3 ml）。排除標準：不能提供有效的痰標本，不能隨訪及失訪者，胸部影像學無任何臨床活動性肺結(jié)核表現(xiàn)。臨床肺結(jié)核診斷標準參照最新版肺結(jié)核診斷標準（WS288-2017）[6]。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑GeneXpert MTB/RIF設(shè)備及配套試劑盒（Cartrige反應(yīng)盒）、痰液處理試劑等購自美國Cepheid公司；BACTEC MGIT 960系統(tǒng)及其配套試劑（MGIT培養(yǎng)管、分枝桿菌培養(yǎng)添加劑、分枝桿菌藥敏試劑盒）購自美國BD公司；涂片用抗酸染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 痰涂片鏡檢按照《痰涂片鏡檢標準化操作及質(zhì)量保證手冊》[7]要求完成標準化操作。

1.2.3 液體培養(yǎng)及藥敏采用BACTEC MGIT 960系統(tǒng)，參照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[8]進行分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏檢測的標準化操作。

1.2.4 GeneXpert MTB/RIF檢測按照GeneXpert MTB/RIF操作說明書，移取1.0 ml痰液至螺紋蓋試管中并加入2倍體積痰液處理液，漩渦振蕩混勻10 s后靜置15 min，用專用吸管轉(zhuǎn)移樣本至Cartrige反應(yīng)盒后放入儀器樣本艙進行DNA提取、PCR擴增及結(jié)果判定，通過專用軟件判讀結(jié)果。

1.2.5 質(zhì)量控制檢測涉及的各標本均嚴格按照《結(jié)核病實驗室標準化操作與網(wǎng)絡(luò)建設(shè)》[9]要求進行處理。痰涂片鏡檢按照《痰涂片鏡檢標準化操作及質(zhì)量保證手冊》[7]實施了盲法復檢及室內(nèi)質(zhì)控。液體培養(yǎng)及藥敏每批次均分別接種了質(zhì)控株H37Rv進行結(jié)果判定。GeneXpert MTB/RIF系統(tǒng)每個檢測匣定期進行樣品處理質(zhì)量控制（SPC）和探針質(zhì)量控制（PCC），確保檢測系統(tǒng)合格。

1.3 統(tǒng)計方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料采用檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同實驗方法檢測MTB陽性情況1 649例患者痰標本中，涂片鏡檢陽性361例（21.89%），陰性1 288例（78.11%）；液體培養(yǎng)法陽性717例（43.48%），陰性932例（56.52%）；GeneXpertMTB/RIF檢出陽性614例（37.23%），陰性1 035例（62.77%）。717例液體培養(yǎng)陽性的痰標本中經(jīng)菌種鑒定為MTB的544例，非結(jié)核分枝桿菌173例。361例涂片鏡檢為陽性的患者標本經(jīng)GeneXpertMTB/RIF檢測有357例陽性，1 288例涂片陰性的患者標本經(jīng)GeneXpert MTB/RIF檢測有257例陽性。544例液體培養(yǎng)法為陽性且菌種鑒定為結(jié)核的患者標本經(jīng)GeneXpert MTB/RIF檢測陽性484例，932例液體培養(yǎng)法陰性的患者標本經(jīng)GeneXpert MTB/RIF檢測陽性129例。以液體培養(yǎng)法為“金標準”，涂片法和GeneXpert MTB/RIF檢測MTB的敏感性分別為65.26%和88.97%，差異有統(tǒng)計學意義（=86.67，P＜0.05）。特異性分別為99.46%和86.16%，差異有統(tǒng)計學意義（=123.63，P＜0.05）。一致性分別為86.86%和87.20%，差異無統(tǒng)計學意義（=0.08，P＞0.05）。

2.2 GeneXpert MTB/RIF檢測涂陽及涂陰痰標本MTB陽性情況液體培養(yǎng)陽性及菌種鑒定為MTB的544例痰標本中，涂陰患者189例（GeneXpert MTB/RIF檢出陽性129例），涂陽患者355例（GeneXpert MTB/RIF檢出陽性355例）；液體培養(yǎng)陰性的932例痰標本中，涂陰患者927例（GeneXpert MTB/RIF檢出陽性128例），涂陽患者5例（GeneXpert MTB/RIF檢出陽性1例）。以液體培養(yǎng)結(jié)果為“金標準”，GeneXpertMTB/RIF檢測涂陰痰標本中MTB的敏感性及特異性分別為68.25%和86.19%，檢測涂陽痰標本中MTB的敏感性及特異性分別為100.00%和80.00%。GeneXpert MTB/RIF檢測涂陽痰標本的敏感性高于涂陰痰標本（=126.67，P＜0.01）。GeneXpert MTB/RIF檢測涂陽痰標本的特異性與涂陰痰標本差異無統(tǒng)計學意義（=0.16，P＞0.05）。

2.3 GeneXpert MTB/RIF檢測利福平耐藥性評價基于液體培養(yǎng)法藥敏檢測利福平耐藥共34例，GeneXpertMTB/RIF檢出利福平耐藥34例，以液體培養(yǎng)法藥敏檢測結(jié)果為“金標準”，GeneXpert MTB/RIF對MTB利福平耐藥性檢測的敏感性和特異性分別為100.00%和97.16%。

3 討論

病原學檢測對結(jié)核病疫情的有效防控及臨床化療方案的合理制定具有重要意義。目前我國結(jié)核病診斷傳統(tǒng)檢測方法主要為涂片鏡檢和痰培養(yǎng)。涂片鏡檢敏感性及特異性較低，痰培養(yǎng)雖為結(jié)核病診斷的“金標準”，但由于耗時較長，限制了其在臨床上的應(yīng)用[10]。早期、快速及準確的檢測MTB及其耐藥性成為結(jié)核病防控中迫切需要解決的問題。作為WHO推薦的GeneXpert MTB/RIF技術(shù)已在多個國家和地區(qū)進行了驗證評估，效果良好[11-12]。

本研究以液體培養(yǎng)法結(jié)果為“金標準”，比較了GeneXpert MTB/RIF和涂片鏡檢在痰標本MTB檢測中的效能，結(jié)果顯示GeneXpert MTB/RIF檢測MTB的敏感性與特異性均遠高于涂片鏡檢，與國內(nèi)外研究報道相符[3-4,13-14]。同時和作為“金標準”的液體培養(yǎng)法相比，GeneXpert MTB/RIF檢測MTB陽性率雖略低于液體培養(yǎng)法，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），且GeneXpert MTB/RIF檢測結(jié)果報告時間大幅縮短，這提示該技術(shù)對MTB的早期診斷具備更大的優(yōu)勢。

提高涂陰患者MTB的檢出率有助于肺結(jié)核的早期診治及疫情的有效控制[15]，但涂陰肺結(jié)核的診斷一直是臨床工作中的重點和難點。有研究報道鏡檢涂片陽性至少每毫升痰液中需含5000～10000拷貝的抗酸桿菌[16]。本研究結(jié)果顯示以液體培養(yǎng)法結(jié)果為“金標準”，GeneXpert MTB/RIF檢測涂陽痰標本MTB的敏感性高于涂陰痰標本，這可能是由于涂陽痰標本含菌量更高，導致MTB更易被檢測出。同時本研究結(jié)果顯示1 116例涂陰痰標本經(jīng)GeneXpert MTB/RIF檢測后，檢出陽性標本257份，檢出陽性率為23.03%，這一現(xiàn)象可能與GeneXpert MTB/RIF技術(shù)本身具有更高的敏感性（每毫升痰液中含131拷貝即可檢出）有關(guān)。這提示GeneXpert MTB/RIF可作為涂陰肺結(jié)核患者涂片鏡檢后有效的補充檢測手段，以提高涂陰肺結(jié)核患者的病原學陽性率。

MTB利福平耐藥性檢測常被作為耐多藥肺結(jié)核（MDR-TB）的監(jiān)測指標。結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥主要分子機制為rpoB基因發(fā)生突變[17]。本研究結(jié)果顯示以MGIT 960藥敏試驗結(jié)果為“金標準”，GeneXpert MTB/RIF對MTB利福平耐藥性檢測的敏感性、特異性及一致性均較高，且操作更簡便，耗時更短。這提示GeneXpert MTB/RIF技術(shù)更適合于基層結(jié)核病實驗室開展MTB利福平耐藥性的測定。

臨床上目前對NTM和MTB感染的鑒別主要還是依靠基于痰培養(yǎng)方法的菌型鑒定，耗時較長，準確性較低。本研究結(jié)果顯示173例非結(jié)核分枝桿菌中，GeneXpert MTB/RIF檢測結(jié)果為陰性的有172例（99.42%），這提示GeneXpert MTB/RIF對NTM感染的早期鑒別診斷具有重要的臨床應(yīng)用價值。

綜上所述，基于快速、簡便、敏感性及特異性強且生物安全要求不高等特點，GeneXpert MTB/RIF能更好的輔助于臨床醫(yī)生對MTB的早期發(fā)現(xiàn)及利福平耐藥性的快速判定，從而為臨床有效治療肺結(jié)核及減少疫情傳播提供技術(shù)支撐。