扶正化結(jié)湯對二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的肝細胞癌大鼠炎癥反應(yīng)的影響

趙鵬杰，趙旭，高繼良

肝癌是常見的惡性消化系統(tǒng)腫瘤，位居我國癌癥發(fā)病率第4位[1]。炎癥因素在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色。肝癌歸屬于中醫(yī)學(xué)“積聚”、“臌脹”、“脅痛”、“黃疸”及“巖”等范疇，“凡屬肝病，勢必乘土”，可見肝病的治療中調(diào)脾至關(guān)重要[2]。杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院總結(jié)出抗癌經(jīng)驗方扶正化結(jié)湯，具有健脾運脾及消瘀化結(jié)功效。本文擬探討扶正化結(jié)湯對二乙基亞硝胺（DEN）誘導(dǎo)的肝細胞癌大鼠炎癥反應(yīng)的影響，報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料研究獲得浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物管理與倫理委員會審核通過（IACUC-20200824-02）。雄性SPF級WISTAR大鼠30只，體質(zhì)量150～170g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號SCXK（滬）2017-0005。DEN購自美國Sigma公司，貨號：N0756-10ML。扶正化結(jié)湯顆粒劑，杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院中藥房提供，主要組成：黃芪15g，白花蛇舌草15g，半枝蓮30g，蜂房5g，佛手10g，雞內(nèi)金10 g，貓爪草20 g，三葉青5 g，酸棗仁10 g，預(yù)知子10g，腫節(jié)風30g，茯苓15g，米仁30g。

1.2 分組造模與干預(yù)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后隨機分為3組（n=10）：正常對照組、造模組及中藥治療組。各組均以普通飼料喂養(yǎng)。對照組予以0.9%氯化鈉注射液0.4 ml/100 g腹腔注射，1次/周，0.9%氯化鈉注射液1ml/100g灌胃，1次/d；造模組予DEN皮下注射50mg·kg-1·次-1，1次/周，0.9%氯化鈉注射液1 ml/100 g灌胃，1次/d；中藥治療組予DEN皮下注射50 mg·kg-1·次-1，1次/周，予扶正化結(jié)湯1ml/100g灌胃，1次/d，連續(xù)17周。

1.3 血清指標檢測各組大鼠血清指標檢測實驗結(jié)束后，大鼠腹主動脈采血，用日立3100全自動生化分析儀檢測大鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平，ELISA法檢測白介素6（IL-6）、甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、糖類抗原199（CA199）及核轉(zhuǎn)錄因子B（NF-B）水平。

1.4 大鼠肝重、體質(zhì)量、肝臟系數(shù)及病理學(xué)觀察采血后處死大鼠，稱體質(zhì)量及肝臟質(zhì)量，計算肝重/體質(zhì)量（肝臟系數(shù)）。取肝臟最大葉距肝緣約1 cm的部位切取大小約1cm×1cm×0.3cm組織塊，置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于病理學(xué)檢查。

1.5 肝組織中環(huán)氧合酶2（COX-2）及核因子B（NF-B）表達處死大鼠，取一部分肝組織快速置于液氮中，采用實時熒光定量RT-PCR法檢測肝組織中COX-2及NF-B表達。

1.6 統(tǒng)計方法數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用F檢驗，多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清指標檢測比較造模組ALT、AST、IL-6、AFP、CEA、CA199及NF-B水平均高于對照組（t≥3.10，均P＜0.05），中藥治療組上述指標均低于造模組（t≥4.92，均P＜0.05），見表1。

表1 3組間血清指標比較（=10）

2.2 大鼠總體觀察、肝重及體質(zhì)量比較

大鼠飼養(yǎng)過程中，正常對照組大鼠毛色光亮，體型健壯，活動靈活；造模組大鼠毛色晦暗，體型較瘦，活力下降；中藥治療組經(jīng)治療后，活力稍有恢復(fù)。

與正常對照組相比，造模組大鼠體質(zhì)量下降（t=9.97，P＜0.01），肝重及肝指數(shù)明顯上升（t=12.47、25.23，均P＜0.01）。與造模組相比，中藥治療組大鼠體質(zhì)量與造模組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.68，P＞0.05），但肝重及肝指數(shù)均明顯下降（t=4.01、5.74，均P＜0.01），見表2。

2.3 病理結(jié)果病理顯示，造模組大鼠肝組織中，纖維組織增多，假小葉形成，肝細胞壞死、變性，偶見癌巢；中藥治療組大鼠的肝組織中，肝細胞壞死及纖維化減少，見封三彩圖3。

2.4 COX-2及NF-B表達比較正常對照組、造模組及中藥治療組COX-2表達量分別為1、3.29±1.62及2.29±2.03，造模組表達量高于正常對照組（t=5.30，P＜0.01），中藥治療組表達較模型組低（t=2.31，P＜0.01）。正常對照組、造模組、中藥治療組NF-B表達量分別為2.19±1.06及1.69±0.48，與正常對照組相比，造模組表達量高于正常對照組（t=6.12，P＜0.01），中藥治療組表達較模型組低（t=2.54，P＜0.05）。

3 討論

研究證實，炎癥相關(guān)的NF-B在包括肝癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤組織及細胞中表達上調(diào)并維持異常激活狀態(tài)，且和抗腫瘤治療密切相關(guān)，參與腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)[3]。靜息狀態(tài)時，NF-B二聚體（p50，p65）與細胞質(zhì)的抑制因子I B結(jié)合，以無活性的狀態(tài)存在于細胞質(zhì)中；當細胞內(nèi)外的各種信號通過級聯(lián)傳導(dǎo)，使I B激酶磷酸化I B僅導(dǎo)致I B降解而NF-B恢復(fù)活性的游離狀態(tài)，激活的NF-B入核與DNA結(jié)合，促進下游靶基因轉(zhuǎn)錄[4]。

COX-2相關(guān)通路可直接調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展。有報道顯示，卵巢癌細胞中高表達COX-2、分泌PGE2，與其受體結(jié)合后可上調(diào)NF-B P65的磷酸化水平，增強卵巢癌細胞的增殖能力[5]。高水平的COX-2/PGE2不僅能直接調(diào)控腫瘤細胞的惡性生物學(xué)行為，還可通過阻礙各種免疫細胞中的促炎反應(yīng)并介導(dǎo)TME的重編程，使TME處于免疫抑制狀態(tài)[6]。COX-2還可影響巨噬細胞活化狀態(tài)。經(jīng)典活化型巨噬細胞M1和替代活化型巨噬細胞M2分別具有促炎性和抗炎性，NF-B介導(dǎo)巨噬細胞向M1型極化[7]，恢復(fù)巨噬細胞的促炎功能，而NF-B又是COX-2的反式激活因子，可增加腫瘤細胞和巨噬細胞中COX-2的表達[8]，二者具有相同的信號分子，COX-2參與調(diào)節(jié)巨噬細胞向M1型極化。本研究結(jié)果顯示，扶正化結(jié)湯通過調(diào)控肝組織中COX-2、NF-B表達水平，對肝癌大鼠炎癥反應(yīng)具有明顯的調(diào)節(jié)作用，與肝臟炎癥及壞死相關(guān)的ALT、AST、IL-6指標均顯著降低，有效降低肝組織纖維化、抑制肝細胞壞死，對肝細胞起到一定的保護作用。

綜上所述，扶正化結(jié)湯具有控制炎癥水平、抑制肝癌細胞增殖、促進肝癌細胞凋亡的作用，其機制可能與下調(diào)COX-2及NF-B的表達有關(guān)。

表2 3組大鼠體質(zhì)量、肝重及肝指數(shù)比較（=10）