維生素D3對紫杉醇誘發(fā)大鼠周圍神經(jīng)病理性疼痛的影響

吳春嫻，高彬，王亮，張瑞，孫建良

腫瘤化療藥物誘導的周圍神經(jīng)病理性疼痛是化療藥物最常見的不良反應之一，總體發(fā)生率可高達38%～87%。紫杉醇（PTX）等化療藥物誘發(fā)的周圍神經(jīng)病變（CIPN）主要表現(xiàn)為手足疼痛、麻木或痛覺超敏等癥狀，嚴重影響患者生活質(zhì)量和化療療程的完成[1]。目前臨床常用的治療藥物，如離子通道阻滯劑、抗炎藥、三環(huán)類抗抑郁藥和抗驚厥藥物，均不能達到臨床預期的治療目標，且常伴有嚴重的毒副作用。研究表明，維生素D在治療神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮良好作用，在已建立的多種大鼠CIPN模型中，如坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷（CCI）導致的神經(jīng)性疼痛模型和糖尿病周圍神經(jīng)性疼痛模型等，都證實補充維生素D可減輕大鼠神經(jīng)病理性疼痛的超敏反應，這可能與維生素D抑制炎癥和氧化應激有關[2]。本研究擬探討維生素D3對PTX誘發(fā)的大鼠周圍神經(jīng)病理性疼痛的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物及分組健康SD雄性大鼠35只（維通利華實驗動物技術有限公司提供），6周齡，體質(zhì)量200～220 g，于寧波大學實驗動物中心（SPF級）適應3～5 d；大鼠飼養(yǎng)環(huán)境：室溫20～25℃，濕度60%，自由攝食和飲水，光照與黑暗時間均為12 h。將大鼠按隨機數(shù)字表法分為5組（n=7）：對照組（Con組）、PTX溶劑組（PTX Vehicle組)、PTX組、PTX+維生素D3溶劑組（PTX+VitD3Vehicle組）和PTX+維生素D3組（PTX+VitD3組)。

1.2 主要試劑和儀器PTX（阿拉丁公司，批號：D2123072，規(guī)格：250mg/瓶）；聚氧乙烯蓖麻油（阿拉丁公司，批號：I1805053，規(guī)格：250g/瓶）；無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20210820，規(guī)格：500 ml/瓶）；維生素D3（阿拉丁公司，批號：J2112208，規(guī)格：1g/瓶）；Von Frey纖維絲（美國Danmicglobal公司，型號：Aesthesio）；多功能微型臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司，型號：Centrifuge 5430R）；智能冷熱痛覺測試儀（法國BIOSEB公司，型號：BIO-CHP）；ELISA試劑盒（上海泛柯實業(yè)有限公司，批號：202111）。

1.3 實驗動物建模及給藥將PTX溶于PTX溶劑（聚氧乙烯蓖麻油∶無水乙醇=1∶1，6 mg/ml），再用0.9%氯化鈉注射液稀釋至2 mg/ml。PTX組、PTX+VitD3組和PTX+Vit D3Vehicle組大鼠隔日腹腔內(nèi)注射PTX 2 mg/kg，共4次（1、3、5及7 d）達到累積劑量8 mg/kg，建立CIPN模型。Con組和PTX Vehicle組于相同時間點腹腔注射等容量的0.9%氯化鈉注射液和PTX溶劑（聚氧乙烯蓖麻油∶無水乙醇∶0.9%氯化鈉注射液=1∶1∶4，1 ml/kg）。將維生素D3溶于無水乙醇（1g/l=40 U/l），再用0.9%氯化鈉注射液稀釋25倍至1.6 U/l。PTX+VitD3組和PTX+VitD3Vehicle組從1、3…19 d隔日腹腔注射維生素D3（2 000 U/kg）和維生素D3溶劑（0.1%乙醇1.25ml/kg），共10次。

1.4 觀察指標

1.4.1 一般情況實驗期間每天觀察大鼠的運動、進食、飲水量、排便、排尿及脫毛等情況，并記錄有無扭體、抽搐等異常行為。于給藥前（d0）和給藥后1、3…19、20 d隔天記錄大鼠的體質(zhì)量。

1.4.2 行為學測定所有大鼠分別于d0和給藥后4、8、12、16及20 d，用Von Frey纖維細絲測定50%右足底機械縮足反應閾值（50%PWTs），用冷熱板測痛儀測定熱縮足潛伏期（TWL）。

1.4.3 50%PWTs測定將大鼠置于底部為金屬篩網(wǎng)（1 cm×1cm）的透明有機玻璃箱（22cm×22 cm×22cm）中，玻璃箱被架高于實驗臺面50 cm。金屬網(wǎng)上蓋以透明的有機玻璃罩，先讓大鼠適應環(huán)境20 min左右,待大鼠的梳理和探究活動基本消失后，從2.0 g力度開始按照“Up&Down”法刺激大鼠后足掌底中部（避開突起部位），纖維絲需彎曲至“C”或“S”型并維持6～8 s，觀察大鼠是否出現(xiàn)縮足反應并記錄[3]。大鼠在刺激時間內(nèi)或在移開Von Frey纖維時立即出現(xiàn)快速的抬足或舔足反應，記為陽性反應“X”，而大鼠無反應或身體活動所引起的縮足反應記作陰性反應“O”。陰性反應時，予大一級力度纖維絲進行刺激，陽性反應時則改用小一級的纖維絲進行刺激，如此連續(xù)進行直至出現(xiàn)第1次陽性和陰性反應的騎跨，再連續(xù)測定4次，得到一串以“O”或“X”組合的序列，將該序列與最后一根纖維絲編號（xf）代入公式50%PWTs（g）=10（xf+k）/1 000計算，為各根纖維絲取對數(shù)后的均差，約等于0.224。若計算得出的50%PWTs＞15.0 g或＜2.0 g，則仍以15.0 g或2.0 g作為最大或最小值，每次刺激之間間隔30 s。

1.4.4 熱縮足潛伏期（TWL）測定先讓大鼠適應環(huán)境20 min，待大鼠能較好的適應當前環(huán)境后,將大鼠放在表面溫度（52.0±0.1）℃的智能冷熱板測痛儀上，上面罩以透明塑料籠，當大鼠出現(xiàn)快速縮足、舔趾或撕叫任一反應時即踩下熱板儀的踏板，記錄熱板儀顯示屏上的時間即為TWL[4]。為避免大鼠出現(xiàn)組織損傷，設定熱板自動切斷時間為15s。每只大鼠測定3次，每次間隔15min，取3次平均值為大鼠TWL值。

1.4.5 大鼠血清25（OH）D3測定采大鼠眼眶血，分離血清，按照酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒說明書進行操作，全自動生化分析儀檢測大鼠血清25-（OH）D3水平，每個實驗都包含了標準曲線，每個樣本檢測2次，取平均值。

1.5 統(tǒng)計方法數(shù)據(jù)采用Prism 9.0（Graphpad,La Jolla，CA）軟件分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用F檢驗，多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況實驗期間5組大鼠均未出現(xiàn)脫毛、腹瀉及運動失常等情況，毛色光滑柔軟，活動情況自如，體質(zhì)量均緩慢增長。5組大鼠體質(zhì)量在d0及給藥后1、3、5、7、9、11、13、15、17、19及20d時差異均無統(tǒng)計學意義（F≤13.21，均P＞0.05），見封二彩圖3。

2.2 50%PWTs變化比較5組大鼠在d0時50%PWTs差異無統(tǒng)計學意義（F=197.7，P＞0.05）。PTX組和PTX+VitD3組大鼠50%PWTs在4、8、12、16及20 d時明顯低于Con組（t≥6.18，均P＜0.05）。PTX+VitD3組大鼠50%PWTs在8、12、16及20 d時明顯高于PTX組（t≥2.32，均P＜0.05），見封二彩圖4。

2.3 TWL變化比較5組大鼠TWL在d0時差異無統(tǒng)計學意義（F=151.2，P＞0.05）。PTX組大鼠TWL在4、8、12、16及20 d時明顯低于Con組（t≥6.46，均P＜0.05）。而PTX+VitD3組大鼠TWL在12、16及20 d時明顯低于Con組（t≥5.33，均P＜0.05）。PTX+VitD3組大鼠TWL在4、8、12、16及20 d時明顯高于PTX組（t≥4.21，均P＜0.05），見封三彩圖1。

2.4 血清25-（OH）D3的變化 5組大鼠血清25-（OH）D3在d0時差異無統(tǒng)計學意義（F=22.97，P＞0.05）。PTX組大鼠血清25-（OH）D3在12及20 d時明顯低于Con組（t≥2.63，均P＜0.05）。PTX+VitD3組大鼠 在20 d時明顯高于Con組（t=5.13，均P＜0.05）。PTX+Vit D3組大鼠血清25-（OH）D3在12及20 d時明顯高于PTX組（t≥5.01，均P＜0.05），見封三彩圖2。

3 討論

本研究參照文獻介紹的方法[5]，隔日腹腔注射PTX 2 mg/kg，共4次，觀察到模型組大鼠50%PWTs和TWL值均有顯著降低，且最低值出現(xiàn)在給藥后1周左右，這與之前研究結(jié)果一致[5]，表明PTX誘發(fā)的CIPN模型大鼠制備成功。

多個臨床實驗證實，補充維生素D可緩解多種類型的慢性疼痛，如偏頭痛、腰背痛、癌痛和骨性疼痛等[6]。動物研究也有報道維生素D3對完全弗氏佐劑（CFA）導致的慢性膝關節(jié)炎疼痛模型大鼠有鎮(zhèn)痛作用[7]。本研究針對PTX誘導的大鼠CIPN模型，發(fā)現(xiàn)反復腹腔注射維生素D3后，干預組較模型組大鼠50%PWTs在8 d開始有顯著升高，TWL在4 d時出現(xiàn)顯著升高并持續(xù)至20 d，但較對照組仍有明顯降低，提示腹腔注射維生素D3能夠在一定程度上緩解PTX誘發(fā)的大鼠機械和熱痛敏。

基于已有證據(jù)，推測維生素D3改善大鼠痛覺過敏的可能機制有：（1）維生素D在星形膠質(zhì)細胞信號途徑中起著重要作用，從而發(fā)揮了神經(jīng)保護作用[8]。（2）維生素D作為一種神經(jīng)活性類固醇，可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性。在一定程度上，這種免疫調(diào)節(jié)作用可以減輕疼痛癥狀[2]。（3）維生素D的鎮(zhèn)痛作用更有可能是由于其抗炎作用，而不是抗傷害作用。維生素D似乎是通過減少促炎細胞因子的釋放和抑制T細胞反應來發(fā)揮其抗炎作用[8]。此外，維生素D還可以調(diào)節(jié)脊髓中的促氧化劑和抗氧化標志物[9]。

維生素D3在體內(nèi)的主要活性形式為25-（OH）D3和1，25-（OH）2D3兩種，其中25-（OH）D3為主要循環(huán)形式，且25-（OH）D3半衰期較1，25-（OH）2D3長，可以在血中維持比較恒定的濃度，通常用它來評估體內(nèi)的活性維生素D3狀態(tài)較為準確。本實驗結(jié)果表明，腹腔注射PTX后，模型組大鼠的血清25-（OH）D3出現(xiàn)持續(xù)下降趨勢，表現(xiàn)為維生素D不足。維生素D3干預組的大鼠血清25-（OH）D3水平未見明顯降低，且在20d時較對照組有顯著升高（但仍在正常范圍內(nèi)），表明隔日腹腔注射維生素D3（2000U/kg）是安全可靠的。但干預組大鼠的痛敏閾值在實驗期間仍較對照組顯著降低，表明血清25-（OH）D3水平與大鼠痛覺過敏之間無明顯關系。

維生素D3價格便宜，不良反應相對較少，即使出現(xiàn)通常也是輕微的。在作者實驗中也沒有觀察到大鼠體質(zhì)量減輕和異常表現(xiàn)等毒性反應的現(xiàn)象。以往的臨床研究表明，人體攝入過量的維生素D（每天超過50000U）導致高鈣血癥的很少，每天服用10000U的維生素D3持續(xù)5個月，也沒有發(fā)現(xiàn)毒性反應[7]。且絕大多數(shù)患者并沒有使用維生素D3的禁忌證，因此維生素D3可能是一種安全、簡單和潛在有益的治療神經(jīng)病理性疼痛患者的藥物。雖然有一定程度的證據(jù)表明，補充維生素D對治療慢性疼痛是有效的，但由于缺乏足夠的隨機和安慰劑對照臨床研究，目前的證據(jù)還不能證明補充維生素D3是對慢性疼痛有效的獨立治療方法。

綜上所述，腹腔注射維生素D3能夠在一定程度上緩解PTX誘發(fā)的大鼠周圍神經(jīng)病理性疼痛，為臨床化療痛的防治提供了新的探索方向。