阻斷粒細胞集落刺激因子受體減輕對乙酰氨基酚引起的小鼠肝損傷的研究

王夢炎，羅燦軍，方凌云

對乙酰氨基酚（APAP）是一種用于解熱鎮(zhèn)痛的安全有效藥物，早在1966年就觀察到過量可引起急性肝壞死[1]。APAP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙被認為是APAP誘導(dǎo)的肝損傷的主要原因，此外氧化應(yīng)激、APAP代謝、無菌炎癥和肝臟修復(fù)等也參與了肝損傷的病理生理過程[2]。APAP代謝可導(dǎo)致氧化應(yīng)激增加，并進一步促進先天免疫細胞（如巨噬細胞和中性粒細胞）的募集和激活。免疫細胞的激活，導(dǎo)致大量促炎細胞因子的分泌。活化的中性粒細胞遷移到肝臟中，并通過釋放活性氧、細胞因子、蛋白酶和中性粒細胞胞外陷阱等進一步導(dǎo)致肝損傷加重[3]。粒細胞集落刺激因子受體（G-CSF）是中性粒細胞發(fā)育和發(fā)揮功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。GCSF/G-CSFR相互作用與中性粒細胞分化、成熟和釋放有關(guān)[4]。G-CSF信號傳導(dǎo)在急性肝損傷中的作用尚不清楚，但G-CSF信號傳導(dǎo)的重要作用已在其他中性粒細胞相關(guān)疾病的小鼠模型中得到證實[5]。本研究通過構(gòu)建APAP誘導(dǎo)的肝損傷小鼠模型，在體內(nèi)水平研究阻斷G-CSFR對肝損傷的影響，報道如下。

1 資料與方法

1.1 動物和試劑C57BL/6小鼠28只，雄性，6～8周，購自寧波大學實驗動物中心。普通飼養(yǎng)，建立模型前24 h禁食。

1.2 模型建立及實驗分組參照文獻建立APAP引起的小鼠肝損傷模型[6]。藥物性肝損傷組（APAP組，n=7）小鼠腹腔注射350 mg/kg的APAP（0.7 g APAP溶解于100 ml 0.9%氯化鈉注射液中，購自Sigma公司），作用24 h?？瞻讓φ战M（Sham組）（n=7）腹腔予同等體積的0.9%氯化鈉注射液。阻斷G-CSFR組（抗G-CSFR組）（n=7）于APAP暴露前24h腹腔注射500 g VR81抗體（購自CSL公司），作用24 h后予APAP溶液。同型抗體對照組（Isotype組）（n=7）小鼠于APAP暴露前24 h腹腔注射500 g VR81同型對照抗體BM4（購自CSL公司），作用24 h后予APAP溶液。各組小鼠樣本均在APAP暴露24 h后獲取。

1.3 肝功能檢測按照丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）及天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）檢測試劑盒（購自南京建成生物工程研究所）說明書操作要求，首先制備上樣樣本（根據(jù)實際情況稀釋相應(yīng)倍數(shù)），依次加樣與相應(yīng)試劑，直至最后一步顯色，酶標儀下相應(yīng)波長得到光密度（OD）值，根據(jù)換算公式得出ALT及AST的含量。

1.4 肝組織病理學檢測在10%多聚甲醛中固定肝組織，依序脫水、包埋、切片、HE染色、封片，光學顯微鏡下觀察肝組織結(jié)構(gòu)并記錄保存。

1.5 炎癥相關(guān)因子的測定根據(jù)ELISA檢測試劑盒（購自Ebioscience公司）說明書指示，測定血清腫瘤壞死因子（TNF-）及白介素6（IL-6）含量。

1.6 實時熒光定量PCR檢測采用Trizol試劑提取肝組織總RNA，用分光光度計測定其濃度并定量。將2.5g總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后進行SYBR Green實時熒光定量PCR檢測IL-6、單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）、巨噬細胞炎癥蛋白2（MIP-2）、補體成分5a受體（C5aR）和C-X-C趨化因子受體（CXCR2）。具體操作步驟按試劑盒（購自TaKaRa公司）說明書進行。所應(yīng)用的引物見表1。

1.7 Western blot檢測凋亡蛋白3（Caspase-3）水平根據(jù)蛋白提取試劑盒（購自碧云天公司）說明書，稱取質(zhì)量相近的肝組織，冰上超聲勻漿，以4℃、12000g離心力（約12 377 r/min）離心10 min后，取上清液，進行蛋白定量，制作蛋白上樣樣本。制備12%濃度的SDS-PAGE膠，恒壓80 V電泳，250 mA電流電轉(zhuǎn)至偏氟乙烯膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，4℃冰箱孵育一抗（1∶1 000）過夜，第2天室溫下與相應(yīng)二抗（1∶2 000）孵育，TBST洗膜3次，電化學發(fā)光試劑顯影及曝光。根據(jù)圖片中條帶灰度值檢測Caspase-3蛋白相對表達量。

表1 實時熒光定量PCR檢測引物

1.8 統(tǒng)計方法數(shù)據(jù)采用Prism 9.0軟件分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用F檢驗，多重比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 阻斷G-CSF受體對APAP引起急性肝損傷肝功能的影響與對照組相比，APAP組小鼠血清ALT及AST水平明顯升高（均P＜0.05）；阻斷G-CSF受體后，ALT、AST水平較APAP組顯著降低（均P＜0.05）。Isotype組ALT及AST變化與APAP組相近（均P＞0.05），見圖1。

2.2 阻斷G-CSF受體對肝組織病理HE染色的影響對照組鏡下可見肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝板排列整齊，肝細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見變性壞死。APAP組鏡下可見圍繞中央靜脈周圍的肝細胞微泡性改變，處理24h后肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，肝細胞變性壞死、出現(xiàn)大片狀壞死灶?？笹-CSFR組肝組織無明顯壞死灶，見封二彩圖2。

2.3 阻斷G-CSF受體對APAP誘導(dǎo)急性肝損傷炎癥因子水平的影響APAP組TNF-和IL-6水平均較Sham組明顯升高（均P＜0.05）；相較于APAP組，抗G-CSFR組TNF-和IL-6水平均明顯下降（均P＜0.05），見圖2。

2.4 阻斷G-CSF受體減少損傷和炎癥相關(guān)標志物的表達情況APAP誘導(dǎo)急性肝損傷后，炎癥介質(zhì)IL-6，MCP-1/CCL2和MIP-2/CXCL2的表達，補體/細胞因子受體C5aR和CXCR2的表達均上調(diào)（均P＜0.05）。與APAP組相比，阻斷G-CSF受體顯著減少了上述標志物的增加，與Sham組差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見圖3。

2.5 阻斷G-CSF受體減少肝細胞凋亡情況APAP組小鼠肝組織中Casepase3表達較Sham組明顯增加（P＜0.05）。與APAP組相比，抗G-CSFR組小鼠Casepase 3表達顯著下降（P＜0.05），見圖4。

3 討論

中性粒細胞在APAP引起的肝損傷中發(fā)揮重要作用，參與肝損傷氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等病理生理過程[3]。G-CSF是中性粒細胞發(fā)育和發(fā)揮功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。G-CSF與骨髓祖細胞上的受體G-CSFR結(jié)合促進中性粒細胞分化、成熟和釋放。此外，G-CSF/GCSFR相互作用促進外周成熟中性粒細胞的存活、活化和運輸，并可導(dǎo)致?lián)p傷部位的炎癥[7]。G-CSF通過激活中性粒細胞并啟動中性粒細胞外誘捕來促進炎癥部位的損傷已在炎癥性關(guān)節(jié)炎的小鼠模型中得到證實[8]。

本研究結(jié)果顯示，阻斷G-CSFR后，血清中肝損傷標志物ALT及AST均有所降低，細胞因子TNF-和IL-6濃度也下降，肝組織中炎癥介質(zhì)IL-6、MCP-1、MIP-2、C5aR和CXCR2在基因水平表達均有所下調(diào)，凋亡相關(guān)蛋白Caspase 3表達也減少，肝組織損傷較APAP組減輕。

VR81抗體預(yù)先處理減少了APAP引起急性肝損傷后中性粒細胞活化和聚集，減弱了由中性粒細胞介質(zhì)（如活性氧、蛋白酶和中性粒細胞胞外陷阱）引發(fā)的肝細胞和內(nèi)皮損傷。這反過來又減少趨化因子的表達以及隨之而來的巨噬細胞和更多的中性粒細胞的聚集，從而防止損傷的惡性循環(huán)并使肝損傷得以恢復(fù)。

從安全角度來看，VR81抗體治療似乎不會減弱細菌或病毒感染小鼠模型的免疫力[9]。此外，一種抗人G-CSFR抗體CSL324被證明在非人靈長類動物中具有良好的耐受性，并且最近已經(jīng)完成了一期臨床研究[8]。因此，阻斷G-CSF受體具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

綜上所述，通過VR81抗體阻斷G-CSF受體可以顯著降低APAP誘導(dǎo)肝損傷的程度，這提供了一個以G-CSFR為靶點的減輕肝損傷的途徑。