綿羊瘤胃細菌、原蟲蛋白質(zhì)分解代謝相關(guān)酶活力及谷氨酸脫氫酶體系的米氏常數(shù)值

熊文秀 翟衛(wèi)爽 屯妮薩·麥提賽伊迪 吳 欣 楊開倫

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆肉乳用草食動物營養(yǎng)重點實驗室，烏魯木齊830052)

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綿羊瘤胃細菌、原蟲蛋白質(zhì)分解代謝相關(guān)酶活力及谷氨酸脫氫酶體系的米氏常數(shù)值

熊文秀 翟衛(wèi)爽 屯妮薩·麥提賽伊迪 吳 欣 楊開倫*

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆肉乳用草食動物營養(yǎng)重點實驗室，烏魯木齊830052)

本試驗旨在研究綿羊瘤胃細菌、原蟲蛋白質(zhì)分解代謝相關(guān)酶活力及谷氨酸脫氫酶體系的米氏常數(shù)(Km)值，為解釋綿羊瘤胃細菌、原蟲蛋白質(zhì)分解代謝特征提供酶學(xué)依據(jù)。選用6只1歲左右安裝永久性瘤胃瘺管的中國美利奴(新疆型)綿羊[平均體重為(32.00±1.36) kg]，飼喂精粗比為30∶70的飼糧，依次采集飼喂前(0 h)和飼喂后1.5、3.0、6.0、9.0、12.0 h 6個時間點的瘤胃液，重復(fù)采集3次。分離和制備細菌、原蟲破碎液，分別測定相關(guān)酶活力及谷氨酸脫氫酶體系的Km值。結(jié)果顯示：1)綿羊瘤胃細菌、原蟲破碎液中蛋白酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酸脫氫酶的活力隨飼喂時間的延長均呈現(xiàn)先升高后降低的動態(tài)變化規(guī)律，總體在飼喂后1.5 h達到峰值；谷氨酸和氨含量也呈現(xiàn)相似的變化規(guī)律。原蟲破碎液中參與蛋白質(zhì)分解代謝的這4種酶的活力在各時間點均極顯著高于細菌(P<0.01)。2)原蟲破碎液谷氨酸含量極顯著高于細菌(P<0.01)；原蟲破碎液氨含量在1.5、6.0、9.0和12.0 h顯著或極顯著高于細菌(P<0.05或P<0.01)。3)綿羊瘤胃細菌、原蟲谷氨酸脫氫酶對煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的Km值分別為2.60×10-7、1.48×10-7mol/L；細菌、原蟲谷氨酸脫氫酶對谷氨酸的Km值分別為8.41×10-6、4.91×10-6mol/L；細菌、原蟲谷氨酸脫氫酶對還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的Km值分別為3.80×10-8、2.70×10-8mol/L；細菌、原蟲谷氨酸脫氫酶對α-酮戊二酸的Km值分別為1.16×10-6、2.07×10-6mol/L；細菌、原蟲谷氨酸脫氫酶對氨的Km值分別為2.97×10-5、1.40×10-5mol/L。結(jié)果提示，總體上，綿羊瘤胃細菌、原蟲中蛋白酶、谷氨酸脫氫酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶的活力在飼喂后1.5 h達到峰值，之后逐漸降低；綿羊瘤胃原蟲中蛋白酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酸脫氫酶的活力均極顯著高于細菌，原蟲中蛋白質(zhì)分解代謝更旺盛；瘤胃原蟲中不僅存在谷氨酸轉(zhuǎn)氨機制，還可能存在利用氨重新合成氨基酸的機制。

瘤胃；細菌；原蟲；蛋白質(zhì)分解代謝；酶活力；Km值

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗選用平均體重為(32.00±1.36) kg、1歲左右的中國美利奴(新疆型)細毛公羊6只，在試驗前安裝永久性瘤胃瘺管。飼喂精粗比為30∶70的飼糧。每天09:00、21:00各飼喂1次，精料與粗料(玉米秸稈)分2次等量飼喂，將精料與粗料混合后飼喂。自由飲水。飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1)每千克預(yù)混料含有 One kg of premix contained the following：石粉 limestone 467.2 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 25.38 g，CuSO4·5H2O 13.45 g，MnSO4·H2O 12.56 g，VA 5×106 IU，CuSO4·5H2O 3.98 g，CoCl2·6H2O 0.083 g，KI 0.066 g，Na2SeO30.045 g。

2)營養(yǎng)水平為實際測定值。Nutrient levels were measured values.

1.2 樣品采集與處理

每只羊每周采樣1次，共采3次。采樣時間點為飼喂前(0 h)和飼喂后1.5、3.0、6.0、9、12.0 h。抽取用20目尼龍網(wǎng)過濾的瘤胃液，每個時間點每只羊抽取120 mL瘤胃液，從中量取100 mL瘤胃液，所有羊的瘤胃液混合在一起，再從中量取480 mL用于分離瘤胃液原蟲、細菌，制備無細胞破碎提取物，以測定酶活力。

1.3 瘤胃液細菌、原蟲分離和破碎

將混合瘤胃液480 mL，150×g離心10 min后棄沉淀，將上清液650×g離心20 min，將細菌和原蟲分離，沉淀為原蟲組分，上清液為細菌組分。

將沉淀(原蟲組分)用4 ℃過夜預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(25 mL)溶解后，低溫高速離心機4 ℃ 650×g離心20 min(重復(fù)2次)。將上清液(細菌組分)10 000×g離心20 min，棄上清液，收集所有沉淀，用4 ℃過夜預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(50 mL)溶解后，低溫高速離心機4 ℃ 10 000×g離心20 min(重復(fù)2次)。之后，分別收集沉淀，加入預(yù)冷的生理鹽水溶解，定容至40 mL，混勻后破碎(用超聲波破碎機，超聲破碎15 min，功率400 W，超聲3 s，間隔5 s，工作60次，重復(fù)3次)。破碎液經(jīng)低溫高速離心機4 ℃ 10 000×g離心20 min，收集上清液，-20 ℃保存，測定酶活力、谷氨酸脫氫酶體系的米氏常數(shù)(Km)值、谷氨酸和氨和蛋白質(zhì)含量。

1.4 蛋白質(zhì)含量、酶活力的測定

瘤胃細菌、原蟲破碎液的蛋白質(zhì)含量測定參考張龍翔等[11]的方法進行。標準蛋白質(zhì)為牛血清白蛋白。

瘤胃液細菌和原蟲蛋白酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶及谷氨酸脫氫酶活力的測定參考Palmquist等[12]的方法進行。分光光度計使用紫外可見分光光度計(754PC)，石英比色皿(光程1.0 cm)，水浴鍋為SSW型微電腦電熱恒溫水槽(上海博訊實業(yè)有限公司)，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)為Sigma公司產(chǎn)品，其余均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.5 瘤胃液細菌、原蟲谷氨酸脫氫酶Km值的測定

谷氨酸脫氫酶催化的脫氨反應(yīng)為：

谷氨酸+NADα-酮戊二酸+NADH+氨。

本試驗分別測定催化反應(yīng)中谷氨酸脫氫酶對反應(yīng)式中5種物質(zhì)的Km值。

瘤胃液細菌、原蟲谷氨酸脫氫酶Km值測定時底物谷氨酸濃度分別為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mmol/L；NAD濃度分別為0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、4.00 mmol/L；NADH濃度分別為0.157、0.313、0.625、0.250、0.500 mmol/L；α-酮戊二酸濃度分別為1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mmol/L；氨濃度分別為10、20、40、80、160 mmol/L。各濃度底物的測定步驟均與測定谷氨酸脫氫酶活力相同。測定出各底物濃度的反應(yīng)初速度，按Linewaver Burk法作圖，將米氏方程兩側(cè)取雙倒數(shù)，得方程式：

1/v=Km/vmax·1/[S]+1/vmax。

式中：v為反應(yīng)初速度(mol/min)；[S]為底物濃度(mol/L)；vmax為最大反應(yīng)速度[mol/min]；橫軸截距為-1/Km，縱軸截距為1/vmax，用圖解法求出vmax和Km值。

1.6 瘤胃液細菌、原蟲谷氨酸、氨含量的測定

谷氨酸、氨含量采用酶法測定，參考吉爾鮑特[13]的方法進行。測定谷氨酸含量時，谷氨酸標準液的終濃度分別為0、10、25、50、100、200 mmol/L，NAD的終濃度為2 mmol/L，加入谷氨酸脫氫酶100 U，反應(yīng)總體積為3 mL；混勻后置于37 ℃水浴40 min，取出后于紫外可見分光光度計(754PC)上測定340 nm處的吸光度值，建立標準曲線，調(diào)整待測樣品的谷氨酸含量在標準濃度范圍內(nèi)進行同樣操作，測定。測定氨含量時，氨標準液的終濃度分別為0、1、2、4、7、10 mmol/L，NADH的終濃度為4 mmol/L，加入谷氨酸脫氫酶100 U，反應(yīng)總體積為3 mL；混勻后置于37 ℃水浴40 min，取出后于紫外可見分光光度計(754PC)上測定340 nm處的吸光度值，建立標準曲線，調(diào)整待測樣品的氨含量在標準濃度范圍內(nèi)進行同樣操作，測定。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析，平均值的多重比較采用Duncan氏法進行，以獨立樣本t檢驗法對細菌和原蟲進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊瘤胃細菌、原蟲蛋白質(zhì)分解代謝主要相關(guān)酶活力的動態(tài)變化

從表2可見，細菌、原蟲破碎液中的蛋白酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸脫氫酶4種酶的活力隨飼喂后時間的延長均呈現(xiàn)“低-高-低”的動態(tài)變化規(guī)律，且除了細菌谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力外均在飼喂后1.5 h達到最大值，在飼喂后12.0 h活力基本恢復(fù)到飼喂前0 h的水平。各時間點的原蟲破碎液中蛋白酶活力比細菌高出近50%，兩者差異極顯著(P<0.01)，而原蟲破碎液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸脫氫酶3種酶的活力幾乎是細菌的2倍，差異極顯著(P<0.01)。

2.2 瘤胃細菌、原蟲破碎液中谷氨酸、氨含量的動態(tài)變化

從表3可見，細菌和原蟲破碎液谷氨酸含量隨飼喂時間的延長均呈現(xiàn)先升高后降低的動態(tài)變化規(guī)律。飼喂后1.5 h，細菌和原蟲破碎液谷氨酸含量均達到最大值。飼喂前、后各時間點原蟲破碎液谷氨酸含量均極顯著高于細菌(P<0.01)。細菌和原蟲破碎液氨含量隨飼喂時間的延長均呈現(xiàn)先升高后降低的動態(tài)變化規(guī)律。飼喂后1.5 h，細菌和原蟲破碎液氨含量均達到最大值。在飼喂后1.5 h，原蟲破碎液氨含量極顯著高于細菌(P<0.01)。在飼喂后6.0、9.0和12.0 h，原蟲破碎液氨含量顯著高于細菌(P<0.05)。

表2 綿羊瘤胃細菌、原蟲破碎液中蛋白質(zhì)分解代謝幾種相關(guān)酶的活力

同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

Values in the same column with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表3 綿羊瘤胃細菌、原蟲破碎液中谷氨酸、氨含量

項目Items組分Components0h1.5h3.0h6.0h9.0h12.0h谷氨酸細菌Bacteria85.94±5.76B139.28±3.60B103.29±3.64B90.13±3.06B70.91±3.25B63.81±2.00BGlutamate原蟲Protozoa159.02±1.85A171.11±2.87A147.99±5.42A128.83±2.10A116.97±7.50A95.73±3.91A氨細菌Bacteria5.46±0.105.88±0.06B5.53±0.284.94±0.20b4.57±0.22b4.37±0.15bNH+4原蟲Protozoa5.88±0.286.53±0.41A5.77±0.375.59±0.18a5.18±0.19a4.83±0.12a

2.3 綿羊瘤胃液細菌、原蟲谷氨酸脫氫酶的Km值比較

按Linewaver Burk法作圖，得到的典型結(jié)果如圖1、圖2所示。圖解計算出的Km值和vmax結(jié)果見表4。從表可見，谷氨酸脫氫酶對NAD+：細菌Km值為2.60×10-7mol/L，vmax為2.17×10-4mol/(L·min)；原蟲Km值為1.48×10-7mol/L，vmax為6.70×10-5mol/(L·min)，原蟲Km值較小。谷氨酸脫氫酶對谷氨酸：細菌Km值為8.41×10-6mol/L，vmax為1.35×10-4mol/(L·min)；原蟲Km值為4.91×10-6mol/L，vmax為1.79×10-4mol/(L·min)，原蟲Km值較小。谷氨酸脫氫酶對NADH：細菌Km值為3.80×10-8mol/L，vmax為1.89×10-4mol/(L·min)；原蟲Km值為2.70×10-8mol/L，vmax為2.73×10-4mol/(L·min)，原蟲Km值較小。谷氨酸脫氫酶對α-酮戊二酸：細菌Km值為1.16×10-6mol/L，vmax為4.00×10-4mol/(L·min)；原蟲Km值為2.07×10-6mol/L，vmax為6.67×10-4mol/(L·min)，細菌Km值較小。谷氨酸脫氫酶對氨：細菌Km值為2.97×10-5mol/L，vmax為3.57×10-4mol/(L·min)；原蟲Km值為1.40×10-5mol/L，vmax為3.33×10-4mol/(L·min)，原蟲Km值較小。

圖1 瘤胃細菌破碎液谷氨酸脫氫酶體系對NAD的Km值

圖2 瘤胃原蟲破碎液谷氨酸脫氫酶體系對NAD的Km值

3 討 論

3.1 綿羊瘤胃細菌、原蟲破碎液蛋白質(zhì)分解代謝主要相關(guān)酶活力的動態(tài)變化

本試驗測定了在飼糧精粗比為30∶70時，綿羊瘤胃細菌、原蟲破碎液在飼喂前、后各時間點蛋白質(zhì)分解主要相關(guān)酶活力的變化。從酶活力的動態(tài)變化來看，瘤胃細菌和原蟲蛋白酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶及谷氨酸脫氫酶的活力變化均呈現(xiàn)先升高后降低的動態(tài)變化規(guī)律，總體上在飼喂后1.5 h上升至最大值，之后緩慢降低。Chen等[14]的研究表明，綿羊瘤胃中的肽濃度隨飼喂后時間的延長呈現(xiàn)出先升高后緩慢降低的變化規(guī)律，且在1.5 h達到最高。瘤胃蛋白質(zhì)的快速降解在采食后1.5 h左右達到最活躍的階段，這可能導(dǎo)致小肽和氨基酸的迅速積累[8]。王夢芝[15]和翟衛(wèi)爽[16]的研究指出，綿羊瘤胃液氨態(tài)氮濃度在不同飼糧間均表現(xiàn)出有相似的變化趨勢，采食后1.5～3.0 h較高，之后逐漸降低。氨態(tài)氮濃度的變化規(guī)律表明，在采食后1.5 h，瘤胃中的脫氨反應(yīng)達到最活躍的階段。

表4 綿羊瘤胃液細菌、原蟲破碎液谷氨酸脫氫酶的Km值比較

瘤胃液中氨態(tài)氮濃度受飼糧蛋白質(zhì)含量的直接影響，也與原蟲數(shù)量和種類有關(guān)。飼糧蛋白質(zhì)含量高，瘤胃細菌可利用的蛋白質(zhì)底物含量也增加，蛋白酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶及谷氨酸脫氫酶活力也隨之提高，在瘤胃液中氨態(tài)氮濃度也就升高。瘤胃原蟲細胞內(nèi)的這4種酶活力都顯著高于瘤胃細菌，去原蟲能顯著降低瘤胃液中氨態(tài)氮的濃度[9]。本試驗從蛋白酶、谷氨酸脫氫酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶及谷草轉(zhuǎn)氨酶4種酶活力的變化規(guī)律為瘤胃液中肽、氨態(tài)氮濃度的變化規(guī)律提供了酶學(xué)理論依據(jù)。

3.2 綿羊瘤胃細菌、原蟲破碎液谷氨酸脫氫酶反應(yīng)體系Km值比較

有關(guān)瘤胃細菌、原蟲細胞內(nèi)谷氨酸脫氫酶反應(yīng)體系從Km值尚未見有報道。Shino等[17]研究顯示，黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)谷氨酸脫氫酶對氨的Km值為3.08 mmol/L，對谷氨酸的Km值為100.00 mmol/L，對α-酮戊二酸的Km值為5.72 mmol/L。Kujo等[18]研究顯示，厭氧超嗜熱菌(Anaerobichyperthermophiles)谷氨酸脫氫酶對NAD的Km值為0.025 mmol/L，對谷氨酸Km值為0.170 mmol/L，對NADH的Km值為0.005 mmol/L，對α-酮戊二酸的Km值為0.066 mmol/L，對氨的Km值為9.700 mmol/L。Newbold等[19]研究表明，大腸桿菌的谷氨酸脫氫酶對氨和α-酮戊二酸的親和力較強，Km值分別為2.33和0.71 mmol/L，對谷氨酸的親和力較弱，Km值為98.00 mmol/L。本試驗中得到的瘤胃細菌破碎液中谷氨酸脫氫酶對反應(yīng)底物的Km值的規(guī)律與前人研究的幾種細菌的Km值規(guī)律相似。綜合谷氨酸脫氫酶的活力及Km值的比較來看：1)瘤胃原蟲谷氨酸脫氫酶活力高于細菌，且對谷氨酸、NAD+的Km值比細菌低42%～43%，這表明原蟲細胞內(nèi)谷氨酸脫氫酶與谷氨酸、NAD+的親和力高出細菌的42%～43%，反應(yīng)催化速度更高，這也是為什么原蟲谷氨酸脫氫酶的活力高于細菌，且產(chǎn)氨速度高于細菌的重要原因之一；細菌α-酮戊二酸的Km值低于原蟲，表明細菌谷氨酸脫氫酶與α-酮戊二酸的親和力更高，更有利于逆反應(yīng)谷氨酸的合成，說明在細菌中逆反應(yīng)的催化速度高于原蟲，這也可能導(dǎo)致細菌產(chǎn)氨效率低于原蟲。2)從氨的利用角度看，在細菌細胞中底物ɑ-酮戊二酸的Km值為1.16×10-6mol/L，低于氨的2.97×10-5mol/L；原蟲細胞內(nèi)的趨勢與細菌相似。因此，在細菌、原蟲細胞內(nèi)ɑ-酮戊二酸的供應(yīng)充足與否是細菌、原蟲利用氨合成重新氨基酸的主要限制步驟，細菌、原蟲細胞內(nèi)的ɑ-酮戊二酸的含量和如何影響氨基酸的重新合成等問題需要進一步研究。

飼糧精粗比為30∶70是反芻家畜一般飼養(yǎng)中較為普遍的飼糧結(jié)構(gòu)。飼料精粗比例影響瘤胃內(nèi)細菌、原蟲的增殖和數(shù)量。因此，隨著精粗比的增加，瘤胃內(nèi)細菌、原蟲數(shù)量也會隨之發(fā)生變化，細胞內(nèi)的酶活力也將發(fā)生變化。從谷氨酸脫氫酶反應(yīng)體系的Km值來說，特定酶在特定反應(yīng)條件下是酶的屬性，因此，谷氨酸脫氫酶反應(yīng)體系的Km值并不隨底物濃度的變化(即飼糧精粗比例)而改變。

3.3 瘤胃原蟲細胞內(nèi)可能存在利用氨重新合成氨基酸的機制

原蟲不能利用氨而以吞噬小飼料顆粒和細菌的形式獲得氮源，“瘤胃原蟲是瘤胃內(nèi)的凈產(chǎn)氨者”，這是長久以來對瘤胃原蟲氨代謝的一個基本認定。然而，Williams等[20]研究發(fā)現(xiàn)，纖毛蟲可以從利用吞噬菌壁中的二氨基庚二酸合成賴氨酸，同時也認為全毛蟲可利用氨重新合成氨基酸。本試驗測得細菌、原蟲破碎液底物氨的Km值分別為2.97×10-5、1.40×10-5mol/L，這表明原蟲的谷氨酸脫氫酶與氨的親和力更高，更有利于原蟲利用氨進行逆反應(yīng)合成氨基酸，并為后續(xù)的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶提供更多的底物。這提示，瘤胃原蟲中不僅存在谷氨酸轉(zhuǎn)氨機制，可能還存在利用氨重新合成氨基酸的機制。

4 結(jié) 論

① 總體上，綿羊瘤胃細菌、原蟲中蛋白酶、谷氨酸脫氫酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶的活力在飼喂后1.5 h達到峰值，之后逐漸降低。

② 綿羊瘤胃原蟲中蛋白酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酸脫氫酶的活力均極顯著高于細菌，原蟲中蛋白質(zhì)分解代謝更旺盛。

③ 瘤胃原蟲中不僅存在谷氨酸轉(zhuǎn)氨機制，可能還存在利用氨重新合成氨基酸的機制。

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*Corresponding author, professor, E-mail： yangkailun2002@aliyun.com

(責任編輯 王智航)

Enzyme Activities Related to Protein Catabolism and KmValue of Glutamate Dehydrogenase System in Rumen Bacteria and Protozoa of Sheep

XIONG Wenxiu ZHAI Weishuang Tunnisa Maitisaiyidi WU Xin YANG Kailun*

(XinjiangKeyLaboratoryofHerbivoreNutritionforMeat&MilkProduction,XinjiangAgriculturalUniversity，Urumqi830052,China)

rumen; bacteria; protozoa; protein catabolism; enzyme activity;Kmvalue

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.01.037

2016-07-04

國家自然基金“瘤胃細菌、原蟲內(nèi)與NAD(P)H相關(guān)的幾個主要代謝途徑及其生理生化功能的研究”(31272473)

熊文秀(1990—)，女，四川達州人，碩士研究生，研究方向為草食動物動物營養(yǎng)代謝。E-mail： 1097043559@qq.com

*通信作者：楊開倫，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail： yangkailun2002@aliyun.com

S826

A

1006-267X(2017)01-0325-08