超高效液相色譜-三重四級桿線性離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀結(jié)合化學計量學方法對不同大小虹鱒魚肉中游離氨基酸含量與滋味相關(guān)性的研究

鮑守民，陳生蓉，田海寧，孟玉瓊*，馬睿*

1(省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，青海 西寧，810016)2(青海大學 生態(tài)環(huán)境工程學院，青海 西寧，810016)

虹鱒(Oncorhynchusmykiss)為鮭科、太平洋鮭屬的一種鮭魚，該魚適應生長于冷水環(huán)境中[1-3]，其魚肉富含氨基酸、蛋白質(zhì)，脂肪酸等營養(yǎng)成分，因肉質(zhì)鮮嫩，口感優(yōu)良，風味獨特，營養(yǎng)價值豐富，深受廣大消費者的喜愛[4]。其中，氨基酸作為人體、動物所需營養(yǎng)成分及蛋白質(zhì)的基本組成單元，是組成生命體的重要基礎物質(zhì)，其含量對人體和動物具有重要的生理意義。有研究報道指出，游離氨基酸含量可以判斷肉類食品的滋味特征，是關(guān)聯(lián)和影響肉類食品風味及品質(zhì)的重要成分[5-9]，可分為鮮味(門冬氨酸、谷氨酸)、甜味(蘇氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸)、苦味(苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、賴氨酸、酪氨酸、組氨酸和精氨酸)三類[10]，可作為肉類食品滋味特征評價的重要指標。因此，對虹鱒魚肉中游離氨基酸含量測定有助于分析該食品的滋味特征。

目前，氨基酸測定有氨基酸自動分析儀-茚三酮顯色法[11]、高效液相色譜-柱前衍生法[12-13]、高效液相色譜-熒光檢測法[14]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀[15-16]等分析方法[17]，多數(shù)方法需衍生化試劑處理，且衍生物不穩(wěn)定，檢測信號衰減快，干擾因素較多，影響檢測。氨基酸分析儀雖具有靈敏度高、分辨率高和檢測準確的優(yōu)勢，但僅應用于氨基酸分析，且衍生物不穩(wěn)定。因此，本研究建立超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析魚肉游離氨基酸的方法，同時測定不同大小虹鱒魚肉中的16種游離氨基酸含量，并結(jié)合化學計量學方法分析其含量與滋味特征的關(guān)系，以期為虹鱒品質(zhì)評價及產(chǎn)品開發(fā)利用提供參考基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

氨基酸混合對照品溶液，日本Shimadzu公司[天冬氨酸(Asp，332.8 μg/mL)、谷氨酸(Glu，367.8 μg/mL)、絲氨酸(Ser，262.7 μg/mL)、組氨酸(His，387.9 μg/mL)、甘氨酸(Gly，187.7 μg/mL)、蘇氨酸(Thr，297.8 μg/mL)、精氨酸(Arg，435.5 μg/mL)、丙氨酸(Ala，222.7 μg/mL)、酪氨酸(Tyr，453.0 μg/mL)、纈氨酸(Val，292.9 μg/mL)、甲硫氨酸(Met，373.0 μg/mL)、異亮氨酸(Ile，327.9 μg/mL)、苯丙氨酸(Phe，413.0 μg/mL)、賴氨酸(Lys，365.5 μg/mL)、亮氨酸(Leu，327.9 μg/mL)、脯氨酸(Pro，287.8 μg/mL)]；乙腈和甲酸(均為色譜純)，美國Thermo Fisher公司；甲酸銨(色譜純)，上海麥克林生化科技有限公司；水為超純水；其他試劑均為分析純。

在青海虹鱒養(yǎng)殖場分別采集三倍體虹鱒幼魚[LB；體重(0.14±0.01) kg]、中魚[SY；體重(0.73±0.16) kg)、成魚[BM；體重(3.97±0.47) kg]各12尾，剖取背部肌肉置于-80 ℃冰箱中待測。

1.2 儀器與設備

AB Sciex QTRAP 5500三重四極桿-線性離子阱質(zhì)譜儀，美國AB Sciex公司；Exion LC AD超高效液相色譜儀，美國AB Sciex公司；ME204E電子分析天平，德國Sartorius公司；5418 R低溫高速離心機，美國Eppendorf公司；LWFS31310水純化系統(tǒng)儀，美國PALL公司；XHF-D高速內(nèi)切式勻漿機，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 對照品溶液的配制

精密吸取適量16種氨基酸混合對照品溶液，置于10 mL棕色容量瓶中，用V(水)∶V(乙腈)=1∶3稀釋并定容，得不同濃度梯度的對照品儲備液，備用。

1.3.2 樣品溶液的制備

參照CHENG等[18]和QI等[19]所述游離氨基酸含量測定方法，有所改動。精確稱取虹鱒魚背部肌肉約0.5 g，置于50 mL離心管中，加入約10 mL[V(水)∶V(乙腈)=1∶3]溶液定容至10 mL刻度，在4 ℃條件下，勻漿至混懸均勻，靜置30 min，轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，于13 000 r/min離心15 min；取上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，制得待測樣品液。

1.3.3 色譜條件

Acquity UPLC BEH Amide色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，柱溫35 ℃，流速0.3 mL/min。流動相：5 mmol/L 甲酸銨-0.1%甲酸水溶液(A)，5 mmol/L 甲酸銨-0.1%甲酸乙腈(B)。梯度洗脫程序：0～2 min，100% B；2～5 min，100% B～87% B；5～8 min，87% B～79% B；8～12 min，79% B；12～17 min，79% B～73% B；17～20 min，73% B～50% B；進樣體積2 μL。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電噴霧正離子源(electrospray ionization，ESI+)，多反應監(jiān)測(multiple- reaction monitoring，MRM)模式采集；噴霧電壓5.5 kV；離子源溫度450 ℃；氣簾氣壓強138 kPa；噴霧氣(Gas1) 壓強310.3 kPa；輔助加熱氣壓強(Gas2)379.2 kPa；碰撞氣為Medium。得該質(zhì)譜條件下，16種氨基酸的定量檢測離子對、去簇電壓(declustering potential，DP)、碰撞能量(collision energy，CE)等參數(shù)(表1)。

表1 16 種氨基酸的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrum parameters of MRM of 16 kinds of cucurbitacin standard

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得實驗數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 22 (SPSS Corp, Chicago, USA)處理并進行單因素方差分析，實驗數(shù)據(jù)P<0.05具有統(tǒng)計學意義；多元統(tǒng)計分析采用SIMCA 14.1 (Umerics AB, Malmo, Sweden)，進行無監(jiān)督的主成分分析(principal component analysis，PCA)，采用MetaboAnalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/)在線繪制聚類熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 條件優(yōu)化

分別使用ESI正、負離子源，MRM檢測，發(fā)現(xiàn)氨基酸在正離子模式下信號響應度高，故選擇該離子模式作為檢測條件。另外，因亮氨酸和異亮氨酸屬于同分異構(gòu)體，分子質(zhì)量及定量離子對相同，需在UPLC色譜中分離且根據(jù)保留行為區(qū)別，故分別考察了不同的洗脫溶劑，包括向流動相中加入0.1%(體積分數(shù))甲酸或5 mmol/L甲酸銨，有機相選擇甲醇、乙腈，流動相等度和梯度洗脫程序等因素；不同的色譜柱，包括Waters Acquity UPLC BEH C18，Waters Acquity UPLC BEH Amide，Agilent ZORBAX SB-C18等；最終以5 mmol/L甲酸銨水溶液(0.1%甲酸)-5 mmol/L甲酸銨乙腈(0.1%甲酸)作為流動相，Waters BEH Amide色譜柱，進行梯度洗脫時為最優(yōu)分離條件(圖1)，因此選擇該色譜-質(zhì)譜條件進行后續(xù)分析。

圖1 16 種氨基酸MRM圖Fig.1 MRM chromatograms of 16 amino acids

2.2 線性關(guān)系

精密移取預先配制的各不同濃度混合對照品溶液，按1.3.3項色譜條件和1.3.4項質(zhì)譜條件測定，以峰面積為縱坐標(y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(x)，得16種氨基酸線性回歸方程(表2)。

表2 16種氨基酸的線性方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Table 2 Regression equation, correlation and linear range of 16 amino acids

2.3 精密度、重復性和穩(wěn)定性

采用上述已優(yōu)化的方法，并考察精密度、重復性和穩(wěn)定性，按1.3.3項色譜條件和1.3.4項質(zhì)譜條件測定，計算得出16種氨基酸保留時間的相對標準差(relative standard deviation,RSD)分別為0.03%～0.33%、0.05%～0.98% 和1.22%～3.48%；峰面積的RSD分別為1.16%～3.40%、1.72%～3.98%和2.54%～3.97%。表明此方法儀器精密度和重復性良好，供試樣品溶液穩(wěn)定。

2.4 加樣回收率

精密稱取已知含量的同一虹鱒魚肉樣品6份，精密加入適量16種氨基酸混合對照品溶液，按1.3.3項色譜條件和1.3.4項質(zhì)譜條件測定，記錄峰面積，計算回收率。16種氨基酸的平均加樣回收率為98.38%～103.57%，RSD分別為0.34%～2.89%。

2.5 含量測定

按1.3.2項的樣品處理方法及1.3.3項色譜條件和1.3.4項質(zhì)譜條件，對36個不同大小虹鱒魚肉樣品中16種氨基酸的含量進行測定，并采用外標法計算。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同大小虹鱒魚肉樣品中Met含量無顯著差異(P>0.05)，其他15種氨基酸的含量差異極顯著(P<0.01)；Gly、His、Ala和Glu四種氨基酸占總游離氨基酸的比例較高(表3)。

2.6 滋味相關(guān)性分析

虹鱒魚肉中游離的氨基酸的含量及閾值對其風味影響具有重要作用，經(jīng)查閱16種呈味氨基酸的閾值[20-21]，并參照CHEN等[22]和SABIKUN等[23]所述的滋味活度值評價方法，氨基酸的滋味活度值大于1對樣品的滋味有貢獻，滋味活度值小于1貢獻不顯著，對虹鱒魚肉進行呈味相關(guān)性分析；結(jié)果表明在幼魚魚肉中滋味活度值大于1的氨基酸為谷氨酸、精氨酸；在中魚魚肉中為甘氨酸、精氨酸；在成魚魚肉中為甲硫氨酸、精氨酸?？傰r味氨基酸活度貢獻值大小依次為：中魚、幼魚、成魚；總甜味氨基酸活度貢獻值大小依次為：幼魚、中魚、成魚；總苦味氨基酸活度貢獻值大小依次為：成魚、中魚、幼魚(表4)。因此，隨著虹鱒魚體型增長，該魚肉滋味氨基酸具有差異并呈現(xiàn)動態(tài)變化。

表3 不同大小虹鱒魚肉中游離氨基酸含量 單位：mg/100g

表4 不同大小虹鱒魚肉中游離氨基酸滋味活度值Table 4 Taste activity values of free amino acids in muscle of rainbow trout with different body sizes

對不同規(guī)格虹鱒魚肉16種氨基酸滋味活度值進行PCA分析(圖2-a)和熱圖聚類分析(圖3)，結(jié)果三者呈現(xiàn)明顯的分離效果，且主成分貢獻值較高，有效地反映出各變量的信息，在滋味特征方面有明顯不同。結(jié)合變量投影重要性指標(variable importance in projection，VIP)得分(圖2-b)并選擇VIP值>1的成分作為起主要作用的成分，Glu、Phe、Gly、Ile和Ser對區(qū)分不同規(guī)格魚肉滋味起主要作用。

a-PCA；b-VIP得分圖圖2 不同大小虹鱒魚肉游離氨基酸滋味活度值 PCA及VIP得分圖Fig.2 Principal component analysis and VIP score plot for taste activity values of free amino acids in muscle of rainbow trout with different body sizes

3 結(jié)論

本研究采用超高效液相色譜-三重四級桿線性離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀測定不同大小虹鱒魚肉中16種游離氨基酸含量，并結(jié)合化學計量學方法，對不同大小虹鱒魚肉中各游離氨基酸滋味活度值進行PCA分析探討各游離氨基酸含量對虹鱒魚肉滋味貢獻值，證明不同大小虹鱒魚肉中各游離氨基酸含量不同，其滋味呈現(xiàn)不同特征。

圖3 不同大小虹鱒魚肉游離氨基酸滋味活度值聚類熱圖Fig.3 Clustering heat map for taste activity values of free amino acids in muscle of rainbow trout with different body sizes