白藜蘆醇通過(guò)BRD4調(diào)控Wnt/β-catenin通路逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞替莫唑胺耐藥的機(jī)制研究

李振江，孫德超，孔晨旭，耿亞?wèn)|，徐晨陽(yáng)，丁炳謙

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，惡性度、發(fā)病率和復(fù)發(fā)率較高，預(yù)后較差［1］。替莫唑胺（TMZ）是治療膠質(zhì)瘤的重要化學(xué)藥物，但多數(shù)患者容易出現(xiàn)TMZ耐藥現(xiàn)象［2］，故提高其療效十分重要。Wnt可通過(guò)經(jīng)典及非經(jīng)典途徑調(diào)控β-連環(huán)素（β-catenin）活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)目的基因表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等生理活動(dòng)及腫瘤多藥耐藥性［3］。研究發(fā)現(xiàn)，抑制Wnt/β-catenin通路活性可阻斷依賴O6甲基鳥(niǎo)嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）的DNA修復(fù)途徑活化，降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ的化療耐藥性，因此，Wnt/β-catenin通路有望成為提高膠質(zhì)瘤TMZ化療療效的潛在干預(yù)靶點(diǎn)［4］。溴結(jié)構(gòu)域蛋白4（bromodomain-containing protein 4，BRD4）是一種致癌因子，在多種腫瘤中高表達(dá)［5］。BRD4在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者的總生存期呈負(fù)相關(guān)［6］。BRD4高表達(dá)可引起Wnt/β-catenin通路活化，抑制或降解BRD4可阻斷Wnt/β-catenin通路活化，發(fā)揮抗癌作用［6］。由此推測(cè)，BRD4可能與Wnt/β-catenin通路存在間接或直接聯(lián)系。白藜蘆醇（resveratrol，RES）為天然多酚類化合物，能通過(guò)多種生化作用發(fā)揮較為活躍的抗腫瘤作用［7］。RES具有脂溶性，可透過(guò)血腦屏障，發(fā)揮抗顱內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)作用［8］。另外，RES可增強(qiáng)TMZ對(duì)腦膠質(zhì)瘤的治療作用［9］，但其作用機(jī)制有待探究。本研究從BRD4及Wnt/β-catenin通路出發(fā)，探究RES提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞化療敏感性的機(jī)制，為提高膠質(zhì)瘤化療效果提供參考。

1 材料與方法

1.1材料清潔級(jí)雄性NUDE大鼠20只，42～49日齡，體質(zhì)量（230±5）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0011。本研究符合3R原則。人神經(jīng)膠質(zhì)瘤TMZ低敏細(xì)胞株（U138）、耐藥株（T98G）購(gòu)自ATCC；高敏細(xì)胞株（U251）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞資源中心；注射用TMZ購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥公司；RES、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Sigma公司；BRD4抑制劑JQ1購(gòu)自MCE公司；Wnt3a/βcatenin通路激活劑LiCl購(gòu)自Selleck公司；BRD4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA BRD4及陰性對(duì)照質(zhì)粒pcDNA NC由上海吉瑪基因公司合成；兔抗人BRD4、Wnt3a、β-catenin、Ki67抗體，小鼠抗人TMZ耐藥蛋白（MGMT）、內(nèi)參β-actin抗體及羊抗兔或羊抗小鼠二抗購(gòu)自Abcam公司；CCK-8試劑、Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物公司；酶標(biāo)儀（型號(hào)：MultiskanTMFC）購(gòu)自Thermo公司；流式細(xì)胞儀（型號(hào)：FACSCanto II）購(gòu)自BD公司；凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)：Tanon 1600/1600R）購(gòu)自Tanon公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理取適量U138、U251、T98G細(xì)胞37℃水浴復(fù)蘇后，于DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）和恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期T98G細(xì)胞，按1×106個(gè)/孔接種于6孔板內(nèi)，進(jìn)行如下處理：（1）不同濃度（0、5、10、50、100、200 μmoL/L）RES和不同濃度（0、10、50、100、200、400 μmoL/L）TMZ單獨(dú)培養(yǎng)，72 h后測(cè)定增殖活性，選擇50 μmoL/L RES及100 μmoL/L TMZ進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（2）設(shè)置對(duì)照1組（添加100 μmoL/L TMZ）、RES1組（添加50 μmoL/L RES）、RES+TMZ（同時(shí)添加100 μmoL/L TMZ和50 μmoL/L RES）組，培養(yǎng)72 h，另用CCK-8法繪制生長(zhǎng)曲線并計(jì)算RES存在或不存在時(shí)細(xì)胞對(duì)TMZ的耐藥指數(shù)，耐藥指數(shù)=添加RES時(shí)半數(shù)抑制濃度（IC50）/未添加RES時(shí)IC50。（3）在添加100 μmoL/L TMZ的基礎(chǔ)上，對(duì)T98G細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA BRD4（或pcDNA NC）或加入50 μmoL/L RES2，分別作為pcDNA NC組、pcDNA BRD4組、RES2組、RES+pcDNA BRD4組。（4）參照文獻(xiàn)［10］和［11］在添加100 μmoL/L TMZ的基礎(chǔ)上加入250 nmoL/L JQ1或40 μmoL/L LiCl，依次作為對(duì)照2組、JQ1組、JQ1+LiCl組。

1.2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖取培養(yǎng)72 h的各組細(xì)胞，加入10 μL的CCK-8溶液干預(yù)培養(yǎng)4 h，讀取酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處光密度（OD）值。根據(jù)OD值繪制生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞增殖活性（%）=（OD藥物-OD空白）/（OD對(duì)照-OD空白）×100%。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h，取細(xì)胞，PBS洗滌、4℃加入75%冷乙醇固定過(guò)夜，PBS洗滌重懸細(xì)胞后順次加入Annexin V-FITC染色液、PI染液，混勻后4℃避光孵育30 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。

1.2.4Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U138、U251、T98G細(xì)胞粉碎勻漿后，提取蛋白并測(cè)定濃度，取蛋白100 μg行上樣、電泳及轉(zhuǎn)膜操作，滴加1∶800的一抗（BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT）及1∶900的β-actin抗體孵育過(guò)夜，二抗孵育50 min，化學(xué)發(fā)光法顯影曝光，凝膠成像系統(tǒng)拍照并計(jì)算條帶相對(duì)灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的比值計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5裸鼠成瘤驗(yàn)證RES的作用裸鼠麻醉后，向左側(cè)肩胛區(qū)皮下注射200 μL（1×106個(gè)細(xì)胞）T98G單細(xì)胞懸液，無(wú)菌條件下飼養(yǎng)12 d，注射部位有明顯瘤塊突起為成瘤成功［9］。按隨機(jī)數(shù)字表法將裸鼠分為對(duì)照治療組、TMZ治療組、RES+TMZ治療組、RES+TMZ+JQ1治療組，每組5只，對(duì)照治療組腹腔注射DMSO溶液，TMZ治療組腹腔注射50 mg/kg TMZ，RES+TMZ組在TMZ治療的基礎(chǔ)上，腹腔注射40 mg/kg RES治療［9］，RES+TMZ+JQ1組在RES+TMZ治療的基礎(chǔ)上給予1 mg/kg JQ1［10］腹腔注射治療。1次/d，連續(xù)給藥30 d后處死大鼠。取瘤體，4%多聚甲醛固定，制成5 μm的石蠟切片，脫蠟、水化、H2O2處理后，加入1∶200的一抗Ki67抗體孵育過(guò)夜，二抗孵育1 h，DAB顯色，置于光鏡下觀察拍照。Image J軟件計(jì)算單位面積內(nèi)Ki67陽(yáng)性染色的OD值。另用Western blot法檢測(cè)瘤體中BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 24.0軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用±s表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TMZ不同 敏 感 細(xì)胞株中BRD4、Wnt3a、βcatenin及MGMT蛋白表達(dá)變化比較與U251細(xì)胞相 比，U138、T98G的BRD4、Wnt3a、β-catenin及MGMT表達(dá)依次升高（P＜0.05），見(jiàn)圖1、表1。

Fig.1 Immunoblot of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression in different sensitive cell lines of TMZ圖1 TMZ不同敏感細(xì)胞株中BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達(dá)免疫印跡圖

Tab.1 Comparison of protein expressions of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT between different sensitive cell lines of TMZ表1 TMZ不同敏感細(xì)胞株中BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達(dá)比較 （n=6，±s）

Tab.1 Comparison of protein expressions of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT between different sensitive cell lines of TMZ表1 TMZ不同敏感細(xì)胞株中BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達(dá)比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；aU251相比，b與U138相比，P＜0.05。

細(xì)胞系U251 U138 T98G F BRD4 0.38±0.06 0.91±0.11a 1.85±0.21ab 166.826＊＊Wnt3a 0.42±0.07 1.23±0.13a 2.09±0.28ab 125.287＊＊β-catenin 0.26±0.05 1.52±0.14a 2.17±0.26ab 189.237＊＊MGMT 0.63±0.07 1.78±0.12a 2.69±0.24ab 249.449＊＊

2.2 RES對(duì)T98G細(xì)胞增殖、凋亡、耐藥性、BRD4及Wnt3a/β-catenin通路的影響0、5、10、50、100、200 μmoL/L RES單獨(dú)處理T98G細(xì)胞72 h，當(dāng)其濃度為5～50 μmoL/L時(shí)，細(xì)胞增殖活性下降，并在50～200 μmoL/L時(shí)保持穩(wěn)定，見(jiàn)圖2。選擇50 μmoL/L RES進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Fig.2 Effects of different concentrations of RES on the proliferation activity of T98G cells圖2不同濃度RES對(duì)T98G細(xì)胞增殖活性的影響

0、10 、50、100、200、400 μmoL/L TMZ單獨(dú)處理T98G細(xì)胞72 h，當(dāng)濃度為10～100 μmoL/L時(shí)，細(xì)胞增殖活性下降，并在100～400 μmoL/L時(shí)保持穩(wěn)定，見(jiàn)圖3。選擇100 μmoL/L TMZ進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Fig.3 The effect of different concentrations of TMZ on the proliferation activity of T98G cells圖3不同濃度TMZ對(duì)T98G細(xì)胞增殖活性的影響

與對(duì)照1組相比，RES1組、RES+TMZ組T98G細(xì)胞凋亡率依次升高，BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達(dá)及細(xì)胞增殖活性依次降低（P＜0.05），見(jiàn)圖4、5，表2。

Fig.4 Flow cytometry chart of apoptosis of T98G cells in each group圖4各組T98G細(xì)胞流式凋亡圖

Fig.5 Immunoblot results of BRD4,Wnt3a,β-catenin,MGMT protein expression圖5 BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達(dá)免疫印跡圖

Tab.2 Effects of RES on the proliferation activity,apoptosis rate and protein expression of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT in T98G cells表2 RES對(duì)T98G細(xì)胞增殖活性、凋亡率及BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達(dá)的影響（n=6，±s）

Tab.2 Effects of RES on the proliferation activity,apoptosis rate and protein expression of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT in T98G cells表2 RES對(duì)T98G細(xì)胞增殖活性、凋亡率及BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達(dá)的影響（n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照1組相比，b與RES1組相比，P＜0.05。

組別對(duì)照1組RES1組RES+TMZ組F增殖活性（%）100.00±5.06 51.19±6.71a 25.47±2.63ab 332.660＊＊凋亡率（%）9.14±2.13 23.19±4.08a 45.36±6.52ab 94.239＊＊BRD4 1.78±0.19 1.36±0.27a 0.74±0.12b 39.929＊＊組別對(duì)照1組RES1組RES+TMZ組F Wnt3a 1.32±0.18 0.93±0.16a 0.42±0.11b 52.305＊＊β-catenin 1.86±0.33 1.47±0.12a 0.65±0.18b 44.096＊＊MGMT 2.19±0.48 1.68±0.23a 1.04±0.13b 19.909＊＊

生 長(zhǎng) 曲 線 見(jiàn) 圖6，RES干 預(yù) 時(shí)，T98G細(xì) 胞TMZIC50、耐藥指數(shù)分別為（53.47±5.40）μmoL/L、0.53±0.05，顯著低于無(wú)RES時(shí)的（100.08±9.14）μmoL/L、1.00±0.08（tTMZIC50=10.755，t耐藥指數(shù)=12.203，均P＜0.05）。

2.3 過(guò)表達(dá)BRD4可減弱RES對(duì)T98G細(xì)胞TMZ耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用與pcDNA NC組相比，pcDNA BRD4組T98G細(xì)胞BRD4蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），見(jiàn)圖7、表3。與pcDNA NC組相比，pcDNA BRD4組T98G細(xì)胞Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達(dá)及增殖活性升高，凋亡率降低（P＜0.05）；與RES2組相比，RES+pcDNA BRD4組Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達(dá)及增殖活性升高，凋亡率降低（P＜0.05），見(jiàn)圖7、8，表3。

Fig.6 The effect of RES on TMZIC50 in T98G cells圖6 RES對(duì)T98G細(xì)胞TMZIC50的影響

Fig.7 Western blot assay of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression圖7 BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達(dá)免疫印跡圖

2.4 BRD4對(duì)Wnt3a/β-catenin通路的影響相比對(duì)照2組，JQ1組增殖活性及BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），凋亡率升高（P＜0.05）。與JQ1組相比，JQ1+LiCl組增殖活性、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達(dá)升高，凋亡率降低（P＜0.05），見(jiàn)圖9、10，表4。

2.5 RES的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果與對(duì)照治療組相比，TMZ治療組瘤 體 中Ki67、BRD4、Wnt3a、βcatenin、MGMT蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與TMZ治療組相比，RES+TMZ治療組、RES+TMZ+JQ1治療 組瘤 體 中Ki67、BRD4、Wnt3a、βcatenin、MGMT蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），且RES+TMZ+JQ1組瘤體中Ki67及BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達(dá)最低（P＜0.05），見(jiàn)圖11、12，表5。

3 討論

Fig.8 Flow cytometry chart of apoptosis of T98G cells圖8 T98G細(xì)胞流式凋亡圖

Tab.3 Comparison of cell proliferation activity,apoptosis rate,BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression between the four groups表3各組細(xì)胞增殖活性、凋亡率、BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達(dá)比較 （n=6，±s）

Tab.3 Comparison of cell proliferation activity,apoptosis rate,BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression between the four groups表3各組細(xì)胞增殖活性、凋亡率、BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達(dá)比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與pcDNA NC組相比，b與pcDNA BRD4組相比，c與RES2組相比，P＜0.05。

組別pcDNA NC組pcDNA BRD4組RES2組RES+pcDNA BRD4組F增殖活性（%）100.02±6.18 160.73±15.02a 51.23±6.84a 93.42±7.15bc 134.977＊＊凋亡率（%）9.16±1.09 2.74±0.16a 22.36±5.07a 13.75±1.26bc 57.308＊＊BRD4 1.78±0.19 2.53±0.26a 1.32±0.28a 1.96±0.41 17.162＊＊Wnt3a 1.32±0.18 2.45±0.31a 0.92±0.25a 1.76±0.19bc 45.382＊＊β-catenin 1.86±0.33 2.84±0.37a 1.42±0.18a 2.15±0.37bc 20.542＊＊MGMT 2.07±0.38 2.95±0.41a 1.57±0.15a 2.51±0.17bc 23.081＊＊

Fig.9 Flow cytometry chart of apoptosis of T98G cells圖9 T98G細(xì)胞流式凋亡圖

Tab.4 Comparison of proliferation activity,apoptosis rate,BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression between the three groups表4各組增殖活性、凋亡率、BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達(dá)的比較 （n=6，±s）

Tab.4 Comparison of proliferation activity,apoptosis rate,BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression between the three groups表4各組增殖活性、凋亡率、BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達(dá)的比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照2組相比，b與JQ1組相比，P＜0.05。

組別對(duì)照2組JQ1組JQ1+LiCl組F增殖活性（%）100.00±6.43 51.19±7.42a 98.23±7.51b 92.280＊＊凋亡率（%）11.43±3.15 29.15±3.87a 13.46±3.21b 48.089＊＊BRD4 1.69±0.13 1.28±0.17a 1.25±0.19 13.282＊＊Wnt3a 1.31±0.19 0.89±0.07a 1.25±0.09b 18.916＊＊β-catenin 1.84±0.32 1.36±0.17a 1.79±0.12b 8.603＊＊MGMT 2.15±0.23 1.82±0.09a 2.09±0.11b 7.609＊＊

膠質(zhì)瘤占腦部腫瘤的半數(shù)以上，是神經(jīng)外科最難治療的腫瘤［12］。TMZ是臨床治療膠質(zhì)瘤的有效藥物，但有48%～58%的患者對(duì)TMZ化療不敏感［13］，故探尋膠質(zhì)瘤化療耐藥的分子機(jī)制對(duì)提高TMZ化療效果有重要意義。

TMZ可通過(guò)甲基化DNA分子并使DNA在復(fù)制過(guò)程中出現(xiàn)堿基錯(cuò)配，引起DNA鏈斷裂、損傷，發(fā)揮細(xì)胞毒性作用［14］。但MGMT表達(dá)升高后可轉(zhuǎn)移鳥(niǎo)嘌呤上的烷化基團(tuán)，阻斷DNA損傷，介導(dǎo)耐藥性產(chǎn)生［15］。如何干預(yù)MGMT表達(dá)已成為提高膠質(zhì)瘤TMZ化療敏感性的重要研究方向。有研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin通路活化是引起MGMT抗藥修復(fù)系統(tǒng)激活的關(guān)鍵原因［16］。Wnt通路被激活時(shí)，Wnt與相關(guān)受體結(jié)合后會(huì)促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)中β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)增殖、生長(zhǎng)及耐藥蛋白如P-糖蛋白等基因轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)多重耐藥［17］。此外，Wnt/β-catenin通路已被認(rèn)為參與MGMT的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，高敏株、低敏株、耐藥株中的MGMT及Wnt/βcatenin通路蛋白表達(dá)依次升高，提示W(wǎng)nt3a/βcatenin通路活化與膠質(zhì)瘤TMZ耐藥密切相關(guān)。但引起Wnt3a/β-catenin通路活化的上游調(diào)控機(jī)制還不明確。

Fig.10 Immunoblot results of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression圖10 BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達(dá)免疫印跡圖

Fig.11 Immunohistochemical staining showing Ki67 in tumor圖11瘤體內(nèi)Ki67免疫組化染色圖（標(biāo)尺：50 μm）

Fig.12 Immunoblot results of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression in tumor圖12瘤體中BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達(dá)免疫印跡圖

Tab.5 Comparison of Ki67,BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expressions in tumors between the four groups表5瘤體中Ki67、BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達(dá)比較 （n=5，±s）

Tab.5 Comparison of Ki67,BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expressions in tumors between the four groups表5瘤體中Ki67、BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達(dá)比較 （n=5，±s）

＊＊P＜0.01；a與TMZ治療組相比，b與RES+TMZ組相比，P＜0.05。

組別對(duì)照治療組TMZ治療組RES+TMZ治療組RES+TMZ+JQ1治療組F Ki67（光密度/mm2）2.13±0.18 2.10±0.21 1.47±0.13a 0.85±0.09ab 72.557＊＊BRD4 1.57±0.10 1.53±0.12 1.18±0.15a 0.61±0.11ab 66.924＊＊Wnt3a 1.83±0.14 1.82±0.18 1.27±0.12a 0.53±0.06ab 107.569＊＊β-catenin 1.25±0.16 1.23±0.15 0.96±0.12a 0.48±0.07ab 38.160＊＊MGMT 2.13±0.17 2.10±0.14 1.71±0.19a 1.06±0.12ab 50.141＊＊

BRD4可間接或直接引起Wnt3a/β-catenin通路活化而發(fā)揮致癌及促癌作用。BRD4能驅(qū)動(dòng)原癌基因（C-MYC）、凋亡調(diào)節(jié)因子（BCL-2）、程序性細(xì)胞死亡蛋白-1（PD-1）等關(guān)鍵致癌基因轉(zhuǎn)錄，加速腫瘤發(fā)展，還可激活DNA損傷檢查點(diǎn)來(lái)修復(fù)損傷DNA，提高癌細(xì)胞防御外界損傷的能力［19］。另外，BRD4能夠通過(guò)調(diào)節(jié)miR-142-5p、miR-216-3p等的表達(dá)，進(jìn)而影響其靶基因Wnt3a表達(dá)，促進(jìn)Wnt/β-catenin通路活化，參與癌癥的發(fā)展［6，20］。本研究發(fā)現(xiàn)，高敏株、低敏株、耐藥株中的BRD4表達(dá)也逐漸升高。使用BRD4抑制劑JQ1可顯著抑制BRD4表達(dá)，同時(shí)抑制T98G細(xì)胞增殖及Wnt3a/β-catenin、MGMT蛋白表達(dá)，促進(jìn)其凋亡，提高其對(duì)TMZ化療的敏感性；反之，Wnt/β-catenin通路激活劑可減弱JQ1的上述作用，提示BRD4可調(diào)控Wnt3a/β-catenin通路活化，參與膠質(zhì)瘤TMZ耐藥。

RES具有抗氧化、抗炎、促進(jìn)自噬、調(diào)控線粒體呼吸功能等作用［21］。研究發(fā)現(xiàn)，RES還能與順鉑、TMZ等化療藥物協(xié)同作用，降低化療藥物誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的閾值，提高化療效果［7，9］。本研究也發(fā)現(xiàn)，RES在提高膠質(zhì)瘤對(duì)TMZ化療敏感性的同時(shí)，還可抑 制BRD4、Wnt3a/β-catenin及MGMT表 達(dá)，且BRD4高表達(dá)可明顯減弱RES對(duì)T98G細(xì)胞TMZ耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用，提示RES對(duì)T98G細(xì)胞TMZ耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用可能與抑制BRD4、Wnt3a/β-catenin及MGMT表達(dá)有關(guān)。另外，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，與TMZ治療相比，RES+TMZ治療組、RES+TMZ+JQ1治療組瘤體中Ki67、BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表達(dá)降低，提示RES可激活TMZ對(duì)瘤體內(nèi)Wnt3a/βcatenin通路、MGMT表達(dá)和細(xì)胞增殖的抑制作用，JQ1可加強(qiáng)上述作用。

綜上所述，RES可能通過(guò)下調(diào)BRD4，進(jìn)而抑制Wnt3a/β-catenin通路活化，實(shí)現(xiàn)對(duì)膠質(zhì)瘤T98G細(xì)胞TMZ耐藥性的逆轉(zhuǎn)。本研究為闡明膠質(zhì)瘤TMZ化療耐藥性產(chǎn)生的分子機(jī)制提供了一定參考，也為治療膠質(zhì)瘤提供了新的化療思路。但BRD4、Wnt3a/β-catenin及MGMT之間的靶向關(guān)系仍需繼續(xù)探究。