內(nèi)毒素血癥通過下調(diào)HNF4α表達(dá)加劇肝損傷

唐永靜，陳云芬，廖月，程其嬌，張桂娟，王云，何毅懷△

重癥肝病在我國較為常見，其病死率高，預(yù)后差［1］。大范圍肝細(xì)胞的急性損傷（如細(xì)胞凋亡）是引起肝損傷進(jìn)展的機(jī)制之一［2］。肝損傷進(jìn)展受多種因素影響，包括合并細(xì)菌感染、高載量乙肝病毒感染等。有研究表明，內(nèi)毒素血癥與肝損傷進(jìn)展關(guān)系密切，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作為內(nèi)毒素的主要成分，在內(nèi)毒素血癥中起著重要作用［3］。LPS與D-氨基半乳糖聯(lián)合，常被用于建立實驗性肝衰竭小鼠模型。本課題組前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，LPS引起肝損傷的使用劑量尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，正常狀態(tài)下大量LPS才能引起肝損傷，但是在肝損傷的基礎(chǔ)上，非肝毒性劑量LPS將加劇肝損傷。這一發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)［4-5］報道相一致，提示肝臟的基礎(chǔ)疾病可能增加肝臟對內(nèi)毒素血癥的敏感性，肝臟損傷程度越重，其對內(nèi)毒素血癥的損傷作用反應(yīng)越敏感，但具體機(jī)制不詳。肝細(xì)胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor 4 alpha，HNF4α）作為肝細(xì)胞富集的重要轉(zhuǎn)錄因子，與肝細(xì)胞的抗損傷反應(yīng)密切相關(guān)［6］。有研究發(fā)現(xiàn)，LPS可顯著下調(diào)大鼠肝臟中HNF4α的表達(dá)［7］；而在肝癌中條件性上調(diào)HNF4α表達(dá)可抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［8］，提示HNF4α表達(dá)水平可在一定程度上反映肝臟對內(nèi)毒素血癥的敏感性。本研究旨在探索內(nèi)毒素血癥中HNF4α表達(dá)的變化特點(diǎn)、對肝細(xì)胞凋亡的作用及在肝損傷中的意義。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物SPF級雄性BALB/c小鼠144只，6～8周齡，平均體質(zhì)量（25±4）g，購自遵義醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心［動物生產(chǎn)許可證號：SYXK（黔）2021-0004］。將所有動物置于溫度（21.0±2.0）℃，濕度65%±5%條件下自由進(jìn)食飲水，并保持12 h/12 h晝夜循環(huán)光照。實驗小鼠的使用遵循《實驗動物管理條例》［9］及遵義醫(yī)科大學(xué)實驗動物管理規(guī)定［倫審（2020）2-321號］。

1.1.2主要設(shè)備和試劑全自動曝光機(jī)（Clinx，ChemiScope 6000，中國），全自動生化分析儀（Beckman Coulter autoanalyzer，AU5800，美國）。裂解液（R0010，Solarbio，北京）；鼠單 克 隆β-actin內(nèi) 參 蛋 白（sc-58673，Santa Cruz Biotechnology）、鼠 單 克 隆HNF4α（ab41898，Abcam，Cambridge，MA，USA）、兔單克隆胱天蛋 白酶3剪切體（Cleaved caspase-3，9664，CST）。辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗小鼠IgG二抗（sc-516102，Santa Cruz，USA）或抗兔IgG二抗（sc-2357，Santa Cruz）。

1.2動物分組和建模方法小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分組。每組誘導(dǎo)12只小鼠，均給藥1次，注射前禁飲禁食6 h。誘導(dǎo)時間為24 h。

1.2.1CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷CCl4組：分別腹腔注射0.5、1.0、2.0 mL/kg CCl4（按CCl4折算；CCl4與橄欖油按體積比為1∶4混合，0.22 μm濾菌器濾菌，4～8℃保存）。對照組：腹腔注射等體積橄欖油（0.22 μm濾菌器濾菌，4～8℃保存）。

1.2.2LPS誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷LPS組：分別腹腔注射LPS，劑量為非肝毒性劑量（0.1 mg/kg、0.5 mg/kg）、肝毒性劑量（2.5 mg/kg，10 mg LPS溶于50 mL的PBS中；0.22 μm濾菌器濾菌，-20℃冰箱保存）。對照組：腹腔注射等體積

PBS。

1.2.3LPS干預(yù)CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷模型小鼠CCl4組：腹腔注射1.0 mL/kg CCl4；LPS+CCl4組：分別腹腔注射0.1 mg/kg、0.5 mg/kg LPS預(yù)處理2 h，均給藥1次；然后腹腔注射1.0 mL/kg CCl4。對照組：腹腔注射等體積橄欖油或PBS。

1.2.4標(biāo)本收集與處理建模24 h后將小鼠置于有4 L CO2的安樂死盒中，待其失去知覺后，維持血液循環(huán)的同時收集血液和肝組織樣本。將收集到的血液標(biāo)本3 000 r/min離心15 min，吸取上清液，置于4℃冰箱過夜。取50 mg肝組織置于裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解，置于-80℃冰箱保存；1 cm3大小的肝組織樣本置于4%多聚甲醛中固定24 h，隨后切成5 μm厚的組織切片，置于切片盒室溫保存。

1.3指標(biāo)檢測與方法

1.3.1肝功能的檢測采用全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT，速率法）及血清總膽紅素（TBil，重氮法）水平。

1.3.2蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測HNF4α、Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)將各組小鼠50 mg肝組織加入5 mL裂解緩沖液［含50 μL苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）］，4℃下進(jìn)行細(xì)胞裂解，BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測總蛋白量。樣本經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（100 V恒壓）分離，然后按照凝膠面積以0.65 mA/cm2恒流電轉(zhuǎn)移1.5 h將蛋白自凝膠轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，加入1∶1 000稀釋的β-actin、HNF4α、Cleaved caspase-3一抗，4℃孵育過夜，TBST漂洗后用1∶2 000稀釋的HRP抗小鼠IgG二抗或抗兔IgG二抗孵育2 h，漂洗后滴加ECL化學(xué)發(fā)光試劑于全自動曝光機(jī)中顯影，利用Image J軟件分析條帶灰度值，計算HNF4α、Cleaved caspase-3蛋白與β-actin的比值。實驗重復(fù)3次。

1.3.3原位末端標(biāo)記法檢測細(xì)胞凋亡情況各實驗組小鼠肝組織石蠟切片分別經(jīng)過脫蠟、脫水、去除組織蛋白、破膜后，取脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）與脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛按體積比1∶14混合，滴到肝組織上，保持濕盒內(nèi)濕度，37℃孵育2 h。紫外激發(fā)波長330～380 nm，發(fā)射波長420 nm；FITC綠光激發(fā)波長465～495 nm，發(fā)射波長515～555 nm；CY3紅光激發(fā)波長510～560 nm，發(fā)射波長590 nm。細(xì)胞核在DAPI染色后在紫外線下呈藍(lán)色，F(xiàn)ITC熒光素標(biāo)記的陽性凋亡細(xì)胞核呈綠色。切片通過全息掃描（Pannoramic DESK/MIDI/250/1000，3DHISTECH，Hungary）及CaseViewer 2.3軟件（3DHISTECH，Hungary）采集圖像。每張切片高倍鏡下隨機(jī)讀取5個視野，計算細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。實驗重復(fù)3次。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊組間多重比較行LSD-t檢驗；若方差不齊組間多重比較行Tamhane′s T2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCl4對小鼠肝損傷及細(xì)胞凋亡的影響0.5、1.0、2.0 mL/kg CCl4組小鼠的血清ALT、TBil水平及肝組織HNF4α、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平均明顯高于對照組，且均呈劑量依賴性增高（均P＜0.05），見表1、圖1。

Tab.1 Comparison of serum ALT and TBil levels,and protein expression levels of HNF4α and Cleaved caspase-3 in liver tissue between the four groups of mice induced by different doses of CCl4表1不同劑量CCl4誘導(dǎo)組血清ALT、TBil水平及肝組織HNF4α、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平比較（±s）

Tab.1 Comparison of serum ALT and TBil levels,and protein expression levels of HNF4α and Cleaved caspase-3 in liver tissue between the four groups of mice induced by different doses of CCl4表1不同劑量CCl4誘導(dǎo)組血清ALT、TBil水平及肝組織HNF4α、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平比較（±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與0.5 mL/kg CCl4組比較，c與1.0 mL/kg CCl4組比較，P＜0.05。

組別對照組0.5 mL/kg CCl4組1.0 mL/kg CCl4組2.0 mL/kg CCl4組F n 12 12 12 12 ALT（U/L）42.08±5.53 2 496.25±202.35a 4 458.00±506.94ab 6 502.08±599.06abc 493.724＊＊TBil（μmol/L）1.28±0.15 1.93±0.17a 4.45±0.27ab 6.35±0.69abc 404.139＊＊組別對照組0.5 mL/kg CCl4組1.0 mL/kg CCl4組2.0 mL/kg CCl4組F HNF4α 1.00±0.00 1.95±0.05a 6.46±0.25ab 11.48±0.43abc 4 020.010＊＊Cleaved caspase-3 1.00±0.00 1.71±0.11a 5.55±0.21ab 8.48±0.16abc 6 745.702＊＊

Fig.1 Western blot detection of HNF4α and Cleaved caspase-3 protein expression in liver tissue induced by different doses of CCl4圖1 Western blot檢測不同劑量CCl4誘導(dǎo)組肝組織HNF4α、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)

2.2 LPS對小鼠肝損傷及細(xì)胞凋亡的影響2.5 mg/kg LPS組小鼠血清ALT、TBil水平及肝組織Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平高于對照組、0.1 mg/kg LPS組、0.5 mg/kg LPS組，肝組織HNF4α蛋白表達(dá)水平低于對照組、0.1 mg/kg LPS組、0.5 mg/kg LPS組（P＜0.05）；對照組、0.1 mg/kg LPS組、0.5 mg/kg LPS組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2、圖2。

Tab.2 Comparison of serum ALT and TBil levels,and protein expression levels of HNF4α and Cleaved caspase-3 in liver tissue between the four groups of mice induced by different doses of LPS表2不同劑量LPS組血清ALT、TBil水平及肝組織HNF4α、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平比較（±s）

Tab.2 Comparison of serum ALT and TBil levels,and protein expression levels of HNF4α and Cleaved caspase-3 in liver tissue between the four groups of mice induced by different doses of LPS表2不同劑量LPS組血清ALT、TBil水平及肝組織HNF4α、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平比較（±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與0.1 mg/kg LPS組比較，c與0.5 mg/kg LPS組比較，P＜0.05。

組別對照組0.1 mg/kg LPS組0.5 mg/kg LPS組2.5 mg/kg LPS組F HNF4α 1.00±0.00 0.94±0.10 0.86±0.07 0.47±0.03abc 156.332＊＊Cleaved caspase-3 1.00±0.00 1.06±0.10 2.44±0.14 7.40±0.16abc 7 022.815＊＊組別對照組0.1 mg/kg LPS組0.5 mg/kg LPS組2.5 mg/kg LPS組F n 12 12 12 12 ALT（U/L）32.92±5.89 37.67±9.12 53.33±8.51 5 725.50±109.62abc 29 112.963＊＊TBil（μmol/L）1.18±0.29 1.48±0.21 1.50±0.21 5.44±0.22abc 836.544＊＊

2.3 LPS及CCl4對小鼠肝損傷及肝細(xì)胞凋亡的影響CCl4組、0.1 mg/kg LPS+CCl4組和0.5 mg/kg LPS+CCl4組小鼠血清ALT、TBil水平，肝組織HNF4α、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平及肝細(xì)胞凋亡指數(shù)均高于對照組（P＜0.05）。0.1 mg/kg LPS+CCl4組和0.5 mg/kg LPS+CCl4組小鼠血清ALT、TBil水平，肝組織Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平及肝細(xì)胞凋亡指數(shù)均高于CCl4組，HNF4α蛋白表達(dá)水平低于CCl4組（P＜0.05）；0.5 mg/kg LPS+CCl4組與0.1 mg/kg LPS+CCl4組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3，圖3、4。

Fig.2 Western blot detection of HNF4α and Cleaved caspase-3 protein expression in liver tissue induced by different doses of LPS圖2 Western blot檢測不同劑量LPS誘導(dǎo)組肝組織HNF4α、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)

Tab.3 Comparison of serum ALT and TBil levels,protein expression levels of HNF4α and Cleaved caspase-3 in liver tissue and apoptotic index between the four groups表3各組血清ALT、TBil水平，肝組織HNF4α、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平及肝細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（±s）

Tab.3 Comparison of serum ALT and TBil levels,protein expression levels of HNF4α and Cleaved caspase-3 in liver tissue and apoptotic index between the four groups表3各組血清ALT、TBil水平，肝組織HNF4α、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平及肝細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與CCl4組比較，P＜0.05。

組別對照組CCl4組0.1 mg/kg LPS+CCl4組0.5 mg/kg LPS+CCl4組F n 12 12 12 12 ALT（U/L）34.75±2.24 3 412.08±122.68a 5 683.00±177.65ab 6 269.92±98.71ab 6 236.269＊＊TBil（μmol/L）1.26±0.26 3.38±0.29a 5.40±0.20ab 6.28±0.16ab 1 011.176＊＊組別對照組CCl4組0.1 mg/kg LPS+CCl4組0.5 mg/kg LPS+CCl4組F HNF4α 1.00±0.00 3.41±0.26a 2.45±0.14ab 1.55±0.08ab 513.070＊＊Cleaved caspase-3 1.00±0.00 2.29±0.15a 2.78±0.23ab 3.23±0.31ab 238.550＊＊凋亡指數(shù)0.52±0.11 27.58±0.83a 31.93±0.73ab 36.71±0.82ab 6 101.197＊＊

Fig.3 Western blot detection of HNF4α and Cleaved caspase-3protein levels in liver tissue of mice圖3 Western blot檢測各組小鼠肝臟HNF4α、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平

Fig.4 TUNEL detection of hepatocyte apoptosis of mice in each group(×20)圖4原位末端標(biāo)記染色檢測各組小鼠肝細(xì)胞凋亡情況（×20）

3 討論

肝臟損傷與代謝紊亂、飲酒、肝炎病毒感染等多種因素有關(guān)，如合并細(xì)菌感染會顯著加重肝臟損傷，但其具體機(jī)制尚未明確［10-11］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）-磷酸化真核翻譯起始因子2α（eIF2α）信號通路可通過抗肝細(xì)胞凋亡減輕小鼠肝損傷［2］，與文獻(xiàn)［12-13］報道一致。有研究表明，肝損傷時，將觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激，激活PERK、活化轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）和需肌醇酶1α（IRE1α）以阻礙蛋白質(zhì)合成，減輕肝臟負(fù)荷，促進(jìn)細(xì)胞存活［14］。一旦ER穩(wěn)態(tài)受到破壞，ER應(yīng)激將觸發(fā)促凋亡信號，凋亡的激活受多種信號通路共同影響。目前主要有3條凋亡途徑：C/EBP同源蛋白（CHOP）基因的激活轉(zhuǎn)錄、Jun-氨基末端激酶（JNK）的激活通路及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特有的caspase-3激活等［15］。有研究表明，HNF4α表達(dá)短暫性下調(diào)對急性肝損傷可能有益，可以重新分配轉(zhuǎn)錄資源；但持續(xù)存在的刺激將促使HNF4α表達(dá)持續(xù)下調(diào)，其下調(diào)程度與肝損傷程度密切相關(guān)［16］。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，CCl4及LPS均可加重小鼠肝損傷及肝細(xì)胞凋亡，肝毒性劑量LPS組肝損傷程度更為顯著，且可下調(diào)HNF4α蛋白表達(dá)；而CCl4組肝組織HNF4α蛋白表達(dá)上調(diào)，提示HNF4α在不同原因引起的肝損傷中存在多種表達(dá)模式。有研究表明，肝臟因其解剖位置易成為細(xì)菌誘導(dǎo)損傷和產(chǎn)生炎癥的主要受累器官；累積的LPS可參與肝細(xì)胞直接損傷或通過促進(jìn)炎癥反應(yīng)加重肝損傷［17］。大量LPS可以參與肝細(xì)胞損傷并誘導(dǎo)其凋亡，血清LPS水平與肝細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)［18］。肝損傷合并細(xì)菌感染及內(nèi)毒素血癥均可導(dǎo)致肝損傷程度加重［19-20］。本研究結(jié)果顯示，非肝毒性劑量LPS誘導(dǎo)組小鼠血清ALT、TBiL及肝組織HNF4α、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)無明顯差異，均未引起肝損傷；肝毒性劑量LPS誘導(dǎo)組小鼠血清ALT、TBiL及Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著增加，HNF4α蛋白表達(dá)下調(diào)，與相關(guān)研究結(jié)果一致［21］，提示肝細(xì)胞凋亡與肝臟損害程度相關(guān)，但HNF4α對肝細(xì)胞凋亡及肝損害的作用及機(jī)制尚未確定。

本研究通過CCl4聯(lián)合非肝毒性劑量的LPS模擬肝損傷合并內(nèi)毒素血癥實驗?zāi)Ｐ?，發(fā)現(xiàn)0.1 mg/kg LPS+CCl4組和0.5 mg/kg LPS+CCl4組小鼠血清ALT、TBil水平，肝組織Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平及肝細(xì)胞凋亡指數(shù)均高于對照組和CCl4組，HNF4α蛋白表達(dá)水平低于對照組和CCl4組。由此進(jìn)一步說明，在肝損傷的基礎(chǔ)上非肝毒性劑量的LPS也能夠通過抑制HNF4α表達(dá)，增加肝細(xì)胞對凋亡的敏感性來加劇肝損害。

綜上所述，內(nèi)毒素血癥對肝損傷的影響除與內(nèi)毒素水平有關(guān)外，還與肝細(xì)胞的基礎(chǔ)狀態(tài)及損傷后HNF4α的反應(yīng)性上調(diào)水平有關(guān)。HNF4α可能通過調(diào)控肝細(xì)胞凋亡影響肝損傷進(jìn)展過程，HNF4α在不同肝損傷模型中存在多種調(diào)節(jié)模式。但在肝損傷中差異調(diào)控HNF4α的機(jī)制，及HNF4α在肝細(xì)胞凋亡和肝損傷中的具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。