神經(jīng)肽P物質(zhì)對放射損傷皮膚成纖維細胞分泌功能及VEGF、bFGF、PDGF表達的影響

林海鵬，黨旭紅，左雅慧

放射性皮膚損傷是由X、γ或β射線外照射引起的皮膚損傷，也是一種放射性職業(yè)病。在核燃料循環(huán)領域，如乏燃料后處理廠事故情況下，料液泄露可能導致皮膚沾污而引發(fā)放射性皮膚損傷；放射性皮炎是腫瘤放射治療最常見的并發(fā)癥。輻射損傷與一般熱力燒傷不同，臨床表現(xiàn)為發(fā)病緩慢、病程長、臨床分期明顯、全身反應重；深度放射性損傷創(chuàng)面反復破潰，經(jīng)久不愈甚至惡變，是典型的難愈性傷口。皮膚成纖維細胞是參與創(chuàng)面修復的主要細胞，其功能正常與否直接影響創(chuàng)面肉芽組織生成和創(chuàng)面愈合［1］。放射性皮膚損傷進程中，輻射誘發(fā)皮膚成纖維細胞功能改變的研究對于損傷救治具有重要意義。神經(jīng)肽P物質(zhì)（SP）是由11個氨基酸組成的多肽，屬于速激肽家族［2］。SP作為神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)節(jié)劑，在神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要的作用。外源SP可以刺激傷口表面成纖維細胞的增殖和分化，促進血管生成因子和膠原纖維的合成和分泌，在傷口愈合和瘢痕增生中發(fā)揮重要作用［3］。本研究旨在探討外源性SP對放射損傷皮膚成纖維細胞分泌功能及細胞因子表達的影響，以期為放射性皮膚損傷救治提供參考。

1 材料與方法

1.1材料人皮膚成纖維細胞HFF-1購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。SP（Sigma-Aldrich公司，美國）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），胎牛血清（Biological Industries，以色列）；胰蛋白酶［生工生物工程（上海）股份有限公司，中國］；二甲基亞砜（DMSO，Sigma-Aldrich公司，美國）；RNAsimple總RNA提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司，中國］；實時熒光定量PCR（qPCR）試劑SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（寶生物工程有限公司，大連）；Ⅰ型膠原（Col-Ⅰ）、Ⅲ型膠原（Col-Ⅲ）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、降鈣素基因相關肽（CGRP）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒［安迪生物科技（上海）有限公司，上海］；Rotor-Gene 6000熒光定量PCR儀（Corbett Life Science公司，澳大利亞）。

Tab.1 Design of real-time fluorescence quantitative PCR primers表1實時熒光定量PCR引物設計

1.2研究方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與分組在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)HFF-1細胞至對數(shù)生長期。取對數(shù)生長期的HFF-1細胞分組傳代培養(yǎng)。細胞分為未照射組（0 Gy），照射組（2 Gy、6 Gy、12 Gy、18 Gy），SP干預組（0 Gy+SP、2 Gy+SP、6 Gy+SP、12 Gy+SP、18 Gy+SP）。各實驗組細胞傳代培養(yǎng)，待貼壁生長后，于照射前12 h更換為含有0.5%胎牛血清的培養(yǎng)基。照射前1 h，向SP干預組細胞培養(yǎng)基中加入SP水溶液，SP終濃度為1×10-7mol/L。

1.2.2細胞照射在冰浴下用醫(yī)用直線加速器產(chǎn)生的4 MeV電子束照射細胞，吸收劑量率為4 Gy/min，源距100 cm，照射野為20 cm×20 cm。照射劑量分別為0、2、6、12和18 Gy。

1.2.3人皮膚成纖維細胞分泌功能的檢測于12孔細胞培養(yǎng)板中接種HFF-1細胞，照射后24 h分別收集各實驗組細胞培養(yǎng)基及細胞，參照ELISA試劑盒說明書，分別測定各組培養(yǎng)基及細胞裂解液中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ及CGRP表達量。

1.2.4ELISA法檢測人皮膚成纖維細胞中VEGF、bFGF、PDGF蛋白表達水平于照射后24 h，2 000 r/min離心10 min收集各實驗組細胞，經(jīng)磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后超聲破碎，12 000 r/min離心10 min收集細胞上清液，參照ELISA試劑盒說明書，分別測定各組VEGF、bFGF及PDGF蛋白表達情況。

1.2.5qPCR檢測人皮膚成纖維細胞中VEGF、bFGF、PDGF mRNA表達水平電子束照射后24 h收集各實驗組HFF-1細胞。利用RNAsimple總RNA提取試劑盒進行細胞總RNA的提取，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進行qPCR檢測。PCR引物序列見表1。反應體系（25 μL）：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（2×）12.5 μL，cDNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O9.5 μL。反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火/延伸20 s，共40個循環(huán)。以2-ΔΔCt法計算VEGF、bFGF、PDGF經(jīng)GAPDH標化后的相對表達量。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SP對放射損傷皮膚成纖維細胞分泌功能的影響

2.1.1 各組HFF-1細胞培養(yǎng)基中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ及CGRP表達水平比較與0 Gy組比較，各照射組（2 Gy、6 Gy、12 Gy、18 Gy組）Col-Ⅰ、Col-Ⅰ/Col-Ⅲ均升高，照射組（12 Gy、18 Gy組）Col-Ⅲ升高，照射組（6 Gy、12 Gy、18 Gy組）CGRP升高。照射前給予SP干預后，與未SP干預的相應組相比：0 Gy+SP組除Col-Ⅲ降低外，各指標水平均升高；2 Gy+SP組Col-Ⅰ、Col-Ⅰ/Col-Ⅲ降低，Col-Ⅲ、CGRP升高；6 Gy+SP組Col-Ⅰ、Col-Ⅰ/Col-Ⅲ降低，CGRP升高；12 Gy+SP組Col-Ⅰ、Col-Ⅲ升高，Col-Ⅰ/Col-Ⅲ降低；18 Gy+SP組Col-Ⅲ升高，Col-Ⅰ/Col-Ⅲ降低（均P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of expression levels of Col-I,Col-Ⅲ,Col-I/Col-Ⅲand CGRP between different culture medium groups表2各組培養(yǎng)基Col-I、Col-Ⅲ、Col-I/Col-Ⅲ、CGRP表達水平比較 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of expression levels of Col-I,Col-Ⅲ,Col-I/Col-Ⅲand CGRP between different culture medium groups表2各組培養(yǎng)基Col-I、Col-Ⅲ、Col-I/Col-Ⅲ、CGRP表達水平比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與0 Gy組比較，b與2 Gy組比較，c與6 Gy組比較，d與12 Gy組比較，e與18 Gy組比較，P＜0.05。

組別0 Gy組2 Gy組6 Gy組12 Gy組18 Gy組0 Gy+SP組2 Gy+SP組6 Gy+SP組12 Gy+SP組18 Gy+SP組F Col-Ⅰ（μg/L）14.34±0.25 20.50±0.19a 19.31±0.51a 21.07±0.84a 26.33±0.63a 21.86±0.93a 18.22±0.63b 16.10±0.57c 23.31±1.25d 25.07±0.99 76.684＊＊Col-Ⅲ（μg/L）31.50±0.69 30.14±0.35 32.52±1.18 33.37±0.74a 33.50±0.74a 28.16±1.26a 31.97±0.57b 33.35±1.01 42.24±1.15d 41.37±0.74e 77.852＊＊Col-Ⅰ/Col-Ⅲ0.46±0.02 0.68±0.01a 0.59±0.03a 0.63±0.02a 0.79±0.03a 0.78±0.01a 0.57±0.01b 0.48±0.03c 0.55±0.02d 0.61±0.02e 80.440＊＊CGRP（ng/L）52.48±2.04 53.07±3.50 61.48±1.86a 99.91±4.94a 103.80±2.82a 62.57±4.17a 76.89±4.11b 98.92±2.78c 102.29±3.64 108.88±3.13 135.039＊＊

2.1.2 各組HFF-1細胞內(nèi)源Col-Ⅰ、Col-Ⅲ及CGRP表達水平比較與0 Gy組比較，各照射組（2 Gy、6 Gy、12 Gy、18 Gy組）CGRP升高，照射組（6 Gy、18 Gy組）Col-Ⅰ、Col-Ⅲ升高，照射組（18 Gy組）Col-Ⅰ/Col-Ⅲ升高（均P＜0.05）。照射前給予SP干預后，與未SP干預的相應組相比：0 Gy+SP組CGRP升高；2 Gy+SP組各指標水平均降低；6 Gy+SP組Col-Ⅰ、Col-Ⅰ/Col-Ⅲ降低，CGRP升高；12 Gy+SP組除Col-Ⅰ/Col-Ⅲ，其余各指標水平均降低；18 Gy+SP組Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、Col-Ⅰ/Col-Ⅲ降低，CGRP升高（均P＜0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of the expression levels of endogenousCol-I,Col-Ⅲ,Col-I/Col-Ⅲand CGRP between the ten groups表3各組細胞內(nèi)源Col-I、Col-Ⅲ、Col-I/Col-Ⅲ、CGRP表達水平比較 （n=3，±s）

Tab.3 Comparison of the expression levels of endogenousCol-I,Col-Ⅲ,Col-I/Col-Ⅲand CGRP between the ten groups表3各組細胞內(nèi)源Col-I、Col-Ⅲ、Col-I/Col-Ⅲ、CGRP表達水平比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與0 Gy組比較，b與2 Gy組比較，c與6 Gy組比較，d與12 Gy組比較，e與18 Gy組比較，P＜0.05。

組別0 Gy組2 Gy組6 Gy組12 Gy組18 Gy組0 Gy+SP組2 Gy+SP組6 Gy+SP組12 Gy+SP組18 Gy+SP組F Col-Ⅰ（μg/L）38.78±0.53 39.10±0.62 42.98±1.28a 39.69±1.12 43.86±0.71a 37.81±0.49 33.64±0.42b 37.25±0.31c 38.19±0.37d 37.19±0.44e 52.361＊＊Col-Ⅲ（μg/L）73.59±0.66 72.29±0.90 78.70±1.94a 72.84±0.62 78.05±1.83a 72.13±0.90 65.40±1.88b 79.14±1.70 68.44±0.77d 70.83±0.84e 34.876＊＊Col-Ⅰ/Col-Ⅲ0.53±0.01 0.54±0.01 0.55±0.00 0.54±0.02 0.56±0.01a 0.52±0.01 0.51±0.02b 0.47±0.01c 0.56±0.01 0.53±0.00e 14.151＊＊CGRP（ng/L）26.56±0.61 33.53±0.71a 31.10±0.58a 32.55±0.73a 31.48±0.09a 29.52±1.25a 28.81±0.41b 32.70±0.96c 31.07±0.95d 38.15±0.58e 51.309＊＊

2.2 SP對放射損傷皮膚成纖維細胞內(nèi)源細胞因子表達的影響

2.2.1 各組HFF-1細胞VEGF、bFGF、PDGF mRNA表達水平比較與0 Gy組比較，照射組（2 Gy組）VEGF降低，照射組（6 Gy、12 Gy、18 Gy組）bFGF、PDGF均升高（均P＜0.05）。照射前給予SP干預后，與未SP干預的相應組相比：0 Gy+SP組各指標水平均升高；2 Gy+SP組VEGF、bFGF升高；6 Gy+SP組VEGF降低；12 Gy+SP組和18 Gy+SP組各指標水平均升高（均P＜0.05），見表4。

2.2.2 各組HFF-1細胞VEGF、bFGF、PDGF蛋白表達水平比較與0 Gy組比較，照射組（2 Gy、18 Gy組）各指標水平均升高，照射組（6 Gy組）VEGF升高，照射組（12 Gy組）VEGF、bFGF均升高（均P＜0.05）。照射前給予SP干預后，與未SP干預的相應組相比：0 Gy+SP組和2 Gy+SP組均呈現(xiàn)VEGF升高，bFGF降 低；6 Gy+SP組VEGF升 高；12 Gy+SP組VEGF、PDGF升高，bFGF降低；18 Gy+SP組VEGF、PDGF均升高（均P＜0.05），見表5。

Tab.4 Comparison of mRNA expression levels of VEGF,bFGF and PDGF between the ten groups表4各組VEGF、bFGF、PDGF mRNA表達水平比較（n=3，±s）

Tab.4 Comparison of mRNA expression levels of VEGF,bFGF and PDGF between the ten groups表4各組VEGF、bFGF、PDGF mRNA表達水平比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與0 Gy組比較，b與2 Gy組比較，c與6 Gy組比較，d與12 Gy組比較，e與18 Gy組比較，P＜0.05。

組別0 Gy組2 Gy組6 Gy組12 Gy組18 Gy組0 Gy+SP組2 Gy+SP組6 Gy+SP組12 Gy+SP組18 Gy+SP組F VEGF mRNA 1.00±0.00 0.75±0.04a 1.13±0.10 1.09±0.12 1.03±0.03 1.64±0.16a 1.28±0.04b 0.86±0.04c 2.31±0.01d 2.14±0.22e 81.916＊＊bFGF mRNA 1.00±0.00 1.12±0.11 1.70±0.44a 1.51±0.28a 1.65±0.33a 1.55±0.15a 1.65±0.09b 1.55±0.39 1.98±0.04d 2.62±0.32e 8.663＊＊PDGF mRNA 1.00±0.00 1.31±0.06 1.62±0.16a 1.80±0.20a 1.90±0.09a 1.57±0.14a 1.57±0.17 1.54±0.37 2.45±0.45d 2.42±0.27e 11.405＊＊

Tab.5 Comparison of protein expression levels of VEGF,bFGF and PDGF between the ten groups表5各組VEGF、bFGF、PDGF蛋白表達水平比較（n=3，ng/L，±s）

Tab.5 Comparison of protein expression levels of VEGF,bFGF and PDGF between the ten groups表5各組VEGF、bFGF、PDGF蛋白表達水平比較（n=3，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與0 Gy組比較，b與2 Gy組比較，c與6 Gy組比較，d與12 Gy組比較，e與18 Gy組比較，P＜0.05。

組別0 Gy組2 Gy組6 Gy組12 Gy組18 Gy組0 Gy+SP組2 Gy+SP組6 Gy+SP組12 Gy+SP組18 Gy+SP組F VEGF 788.84±41.15 856.82±24.47a 954.71±23.71a 1 090.68±15.14a 1 140.53±24.67a 1 100.65±29.08a 1 174.97±21.75b 1 065.30±40.36c 1 285.55±21.81d 1 317.28±26.13e 112.077＊＊bFGF 24.92±0.28 26.90±0.59a 24.75±0.28 25.93±0.27a 26.92±0.94a 19.77±0.34a 20.34±0.34b 25.33±0.34 22.42±0.22d 27.64±0.36 114.822＊＊PDGF 12.02±0.21 12.50±0.40a 11.74±0.19 12.18±0.22 12.66±0.32a 12.23±0.22 12.83±0.30 11.85±0.21 13.09±0.18d 14.78±0.21e 36.113＊＊

3 討論

放射性皮膚潰瘍創(chuàng)面破潰難愈是其治療難點。傷口愈合是一個復雜、高度可調(diào)的過程，由多種細胞及分子介導，主要包括炎癥期、新生組織形成期及組織重塑期［4］。在創(chuàng)面環(huán)境的應激條件下，成纖維細胞通過分泌多種信號分子參與調(diào)節(jié)炎癥反應和細胞增殖，通過細胞與細胞的直接通訊以及自分泌和旁分泌的相互作用，從而調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細胞、內(nèi)皮細胞和巨噬細胞的功能［1，5］。SP作為局部傷口愈合重要介導因子，可調(diào)節(jié)成纖維細胞增殖、分泌功能，進而促進皮膚創(chuàng)面愈合［4，6-7］。

真皮成纖維細胞主要通過合成和分泌細胞外基質(zhì)成分（包括Col-Ⅰ和Col-Ⅲ）在傷口愈合中發(fā)揮重要作用。膠原蛋白是組織再生過程中一種重要的細胞外基質(zhì)，為組織細胞提供支撐，維持其生理結(jié)構(gòu)和功能［4，8］。皮膚真皮中的膠原蛋白主要是Col-Ⅰ和Col-Ⅲ。其表達分泌量不僅決定了真皮修復的進程，其比例也影響真皮瘢痕的結(jié)構(gòu)和功能。在傷口愈合中，Col-Ⅰ的大量出現(xiàn)導致瘢痕結(jié)構(gòu)質(zhì)地堅硬而缺乏彈性；Col-Ⅲ是皮膚中網(wǎng)狀纖維的主要組成部分，含量越高纖維束越細，在創(chuàng)傷修復中，Col-Ⅲ高表達有利于皮膚組織細膩柔潤［9］。本研究通過對細胞培養(yǎng)基中膠原蛋白含量分析來闡述皮膚成纖維細胞對膠原蛋白的分泌功能，結(jié)果顯示，電子束照射后，與0 Gy組比較，隨著照射劑量增加，各照射組細胞培養(yǎng)基中Col-Ⅰ、Col-Ⅰ/Col-Ⅲ升高趨勢明顯，照射前給予SP干預，發(fā)現(xiàn)低照射劑量組（2 Gy、6 Gy組）Col-Ⅰ降低明顯，高照射劑量組（12 Gy、18 Gy組）Col-Ⅲ升高明顯，但各照射組均呈現(xiàn)Col-Ⅰ/Col-Ⅲ降低，表明外源SP可降低照射后皮膚成纖維細胞中Col-Ⅰ/Col-Ⅲ，提示SP可通過調(diào)節(jié)Col-Ⅰ/Col-Ⅲ，誘發(fā)真皮瘢痕組織結(jié)構(gòu)的改變，有利于皮膚瘢痕軟化。為進一步確證上述調(diào)節(jié)關系，對電子束照射前后及SP干預情況下，細胞膠原蛋白表達情況進行分析表明，電子束照射后，僅高劑量18 Gy組Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、Col-Ⅰ/Col-Ⅲ指標與培養(yǎng)基中表達變化一致，其他劑量組Col-Ⅰ、Col-Ⅰ/Col-Ⅲ指標表達趨勢不一致；外源SP干預后，細胞內(nèi)Col-Ⅰ和Col-Ⅰ/Col-Ⅲ分別在干預組（2 Gy+SP、6 Gy+SP組）和（2 Gy+SP、6 Gy+SP、18 Gy+SP組）與培養(yǎng)基中表達變化一致。

在傷口愈合過程中，細胞和分子級聯(lián)過程伴隨著多種細胞因子參與。作為首個被批準用于治療潰瘍的生長因子，PDGF可促進平滑肌細胞、成纖維細胞等的分裂，膠原的合成及血管生成。bFGF可促進成纖維細胞、內(nèi)皮細胞等向損傷部位遷移，加速創(chuàng)面肉芽生長與血管形成，進而改善創(chuàng)傷組織供血環(huán)境，縮短創(chuàng)傷愈合時間。VEGF通過刺激血管內(nèi)皮細胞分裂與增殖，促進微血管新生，提高血管通透性，進而加速傷口愈合［10-12］。Kant等［13］研究表明，局部應用SP可通過對細胞因子、生長因子等的調(diào)節(jié)，促進傷口愈合?；蛘{(diào)控對外界刺激反映在基因表達的各個環(huán)節(jié)。本研究結(jié)果顯示，電子束照射后，僅bFGF在高劑量組（12 Gy、18 Gy組）呈現(xiàn)蛋白和mRNA水平表達變化一致性；SP干預后，VEGF和PDGF在高劑量組（12 Gy+SP、18 Gy+SP組）呈現(xiàn)蛋白和mRNA一致性高表達，表明細胞因子合成調(diào)節(jié)可能是皮膚成纖維細胞在應激條件下為減少輻射損傷的一種生物學調(diào)節(jié)反應，SP可協(xié)同皮膚成纖維細胞對輻射照射的應激反應，進而參與傷口創(chuàng)面愈合微環(huán)境的調(diào)控。

綜上所述，SP干預可調(diào)節(jié)放射損傷皮膚成纖維細胞Col-Ⅰ、Col-Ⅲ表達與分泌，降低Col-Ⅰ/Col-Ⅲ比值，協(xié)同成纖維細胞對電子束照射的應激反應，促進放射損傷皮膚成纖維細胞中VEGF、PDGF的高表達。本研究為SP用于放射性皮膚損傷治療干預提供了數(shù)據(jù)支持。