Wnt/β-catenin信號調(diào)節(jié)對毛囊干細(xì)胞定向分化的影響

周汝楠，段明玥，王一碩，羅皓文，陳夢怡，閆佳樂，陳 杰

（1.西安醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院麻醉系，陜西 西安 710000；2.西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院醫(yī)療美容科，陜西 西安 710000）

毛囊干細(xì)胞（hair follicle stem cells，HFSC）的發(fā)現(xiàn)和體外培養(yǎng)方法的發(fā)展為燒傷皮膚的組織工程治療提供了可能[1]。HFSC是一種多能干細(xì)胞，具有多向分化潛能[2]。HFSC的增殖和分化能力都受自身基因和外界信號的影響。研究證實(shí)[3，4]，Wnt/β-catenin信號通路在毛囊的發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用，Wnt是胚胎毛囊發(fā)育過程中最早表達(dá)的信號分子，Wnt蛋白與其受體結(jié)合可激活Wnt/β-catenin信號通路，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積聚，β-catenin與淋巴增強(qiáng)因子-1（LEF1）結(jié)合可激活靶基因，加速HFSC的定向分化[5]?；瘜W(xué)物質(zhì)（如LiCl）和角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子（KGF）也可導(dǎo)致HFSC分化，但具體機(jī)制尚不明確。本研究旨在探討角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子（KGF）和LiCl在毛囊干細(xì)胞分化過程中對Wnt/β-catenin信號通路功能的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 組織收獲與細(xì)胞分離 無菌條件下取新鮮人頭皮標(biāo)本，用含5%青霉素和鏈霉素的磷酸鹽緩沖液（PBS）反復(fù)沖洗；去除皮下脂肪組織和雜質(zhì)后，將皮膚切成4 mm×2 mm的小塊，放入含有0.25%分散酶的離心管中，4 ℃下消化過夜；然后沿毛發(fā)生長方向輕輕拔出毛囊，用PBS洗滌去除皮下油脂，加入60 mmol/L培養(yǎng)皿中，添加含10%胎牛血清（FBS）DMEM培養(yǎng)基（HyClone）；用2.5 g/L胰蛋白酶和0.04% EDTA在37 ℃下孵育10 min，分離毛囊隆起區(qū)，然后以5×107個/L的密度離心再懸浮于K-SFM培養(yǎng)液，細(xì)胞在37 ℃、5% CO2的加濕箱中孵育。每隔3～4 d更換培養(yǎng)液1次，培養(yǎng)傳代3次后用于所有實(shí)驗(yàn)。

1.2 LiCl和KGF的處理及各蛋白檢測方法 將HFSC懸浮于K-SFM培養(yǎng)基（不含胎牛血清）中，以1×105個/ml的濃度接種于100 mmol/L培養(yǎng)皿中。然后將10 mmol/L LiCl或10 μg/L KGF濃度加入培養(yǎng)基中，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測培養(yǎng)3、5、7、9 d后腺瘤性大腸息肉（APC）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β)、軸蛋白（Axin）及淋巴增強(qiáng)因子1（LEF1）mRNA的表達(dá)。未治療組作為對照組。

2 結(jié)果

2.1 HFSC生長特性 毛囊突起的原代細(xì)胞呈橢圓形，體積小，大小均勻，活細(xì)胞光學(xué)透明，邊界清晰，可見一簇簇未分離的細(xì)胞。培養(yǎng)初期細(xì)胞黏附和活性較弱，培養(yǎng)1～3 d后觀察到少數(shù)HFSC貼壁，多數(shù)仍保持懸浮狀態(tài)（圖1A、圖1B）；培養(yǎng)4～6 d后培養(yǎng)皿上附著少量單個細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)，呈鵝卵石狀，排列整齊，折射率高。細(xì)胞數(shù)量隨著培養(yǎng)時間的增加而增加（圖1C、圖1D）；培養(yǎng)2周后，可觀察到一些老化的細(xì)胞。

圖1 HFSC的原代培養(yǎng)情況（×40）

2.2 LiCl及KGF對Wnt/β-catenin信號通路組分基因表達(dá)的影響 經(jīng)10 mmol/L LiCl處理后，β-catenin、APC及LEF1 mRNA表達(dá)逐漸升高，Axin和GSK-3β mRNA表達(dá)逐漸降低（圖2）；經(jīng)10 μg/L KGF處理后，β-catenin mRNA相對表達(dá)量沒有明顯改變，但GSK-3β和LEF1 mRNA的表達(dá)逐漸下降（圖3）。

圖2 10 mmol/L LiCl對β-catenin、APC、GSK-3β、Axin及LEF1 mRNA表達(dá)的影響

圖3 10 μg/L KGF對β-catenin、APC、GSK-3β、Axin及LEF1 mRNA表達(dá)的影響

3 討論

HFSC是在人的毛囊外根鞘隆突部中的一種，屬于成體干細(xì)胞，在體內(nèi)處于靜止?fàn)顟B(tài)，在體外培養(yǎng)作用下具有較強(qiáng)的增殖能力。研究發(fā)現(xiàn)[6]，HFSC具有多向分化潛能，可分化成表皮、毛囊、皮脂腺，參與皮膚創(chuàng)傷愈合的過程。影響毛囊干細(xì)胞增殖和分化的主要內(nèi)在調(diào)控因子是Wnt、β-catenin和Notch和Exit domain A信號通路，外在信號主要包括有絲分裂原、細(xì)胞間相互作用、堿性成纖維細(xì)胞生長因子或表皮生長因子等細(xì)胞生長因子[7，8]，此外，部分化學(xué)物質(zhì)（如LiCl）等信號構(gòu)成了HFSC增殖分化的外部微環(huán)境。KGF是成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）超家族的成員，可調(diào)節(jié)各種細(xì)胞類型的增殖和分化。當(dāng)皮膚受損時，基質(zhì)細(xì)胞中KGF的表達(dá)急劇上調(diào)，促進(jìn)HFSC的增殖[9]。本研究從毛囊隆起中分離出HFSC，探討10 mmol/L LiCl、10 μg/L KGF對HFSC分化的影響。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)10 mmol/L LiCl處理后，β-catenin、APC及LEF1 mRNA表達(dá)逐漸升高，Axin和GSK-3β mRNA表達(dá)逐漸降低。分析認(rèn)為，LiCl作為關(guān)鍵的Wnt信號激動劑，可抑制GSK-3β的活性。絲氨酸-9處的GSK-3磷酸化可阻止GSK-3β降解β-catenin，從而上調(diào)β-catenin的表達(dá)。β-catenin的表達(dá)與β-catenin-Axin-Apc-GSK-3β復(fù)合物呈正相關(guān)，而與GSK-3β和Axin水平呈負(fù)相關(guān)。Axin是Wnt信號通路的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子，是β-catenin降解復(fù)合物的關(guān)鍵成分，具有多個蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域，在各種蛋白質(zhì)復(fù)合體中起支架蛋白的作用[10-12]。Axin使GSK-3β接近β-catenin，并調(diào)節(jié)磷酸化β-catenin的降解。本研究表明，LiCl可抑制GSK-3β mRNA的表達(dá)，從而抑制軸蛋白復(fù)合體的形成，從而間接上調(diào)β-catenin的水平。LEF1是Wnt信號通路中的重要轉(zhuǎn)錄因子，該基因編碼的蛋白質(zhì)可以與T細(xì)胞受體α增強(qiáng)子中的功能重要位點(diǎn)結(jié)合，可能在毛細(xì)胞分化和毛囊形態(tài)發(fā)生中發(fā)揮作用。LiCl處理使β-catenin和LEF1 mRNA水平隨培養(yǎng)時間的延長而升高，可能是由于β-catenin復(fù)合體與LEF1的蛋白水平升高所致。在10 μg/L KGF處理的細(xì)胞中，隨著HFSC的分化，β-catenin的表達(dá)在第7天略有增加，而GSK-3β的表達(dá)略有下降，LEF1水平在早期即下降，顯示角質(zhì)細(xì)胞生長因子的干預(yù)作用與GSK-3β對Wnt/β-catenin途徑由活化轉(zhuǎn)為抑制的過程尚未明確，但說明KGF與LEF1呈負(fù)相關(guān)，在初始階段可抑制毛囊分化與形成[13-16]。

綜上所述，分離培養(yǎng)的毛囊干細(xì)胞在體外經(jīng)多次傳代后仍具有一定的增殖能力和多向分化潛能。LiCl與KGF均可激活Wnt/β-catenin信號通路，改變β-catenin的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)毛囊干細(xì)胞分化。